专利名称：一种一步检测鸡新城疫和传染性支气管炎病毒的试纸条的制作方法
技术领域：
本发明属于预防兽医学检验领域，具体是涉及一种一步检测鸡新城疫和传染性支 气管炎病毒的试纸条及其制备方法和应用。
背景技术：
鸡新城疫(Newcastle Disease，ND) —直是给养鸡业带来重大危害的疫病，被国 际兽医局(0IE)列为A类传染病，该病对世界贸易有较大的商业影响。传染性支气管炎 (InfectiousBrochitis, IB)是由传染性支气管炎病毒(IBV)引起的危害呼吸和泌尿生殖 道的急性传染病，鸡群一经感染，引起巨大经济损失。目前，鸡病的爆发已发生了一些新的 变化，以往那种单纯发生某一种疾病的情况已不多见，取而代之的是几种疫病混合感染、病 毒性疫病、隐性慢性疾病日见增多，呼吸道病的发病率超过了肠道病.这些都使鸡病日趋 走向复杂化，给鸡病诊断与防治带来一定的难度，特别是鸡新城疫和传染性支气管炎，病鸡 的临床症状有很大的差异，不同宿主对感染后的反应也不一样，这使诊断更为复杂和困难， 单一临床和病变不能作为诊断的依据。对禽病毒的检测方法，主要有病毒分离、血清学诊断以及分子生物学方法，但病毒 分离时间长，要求条件高，分离率低，而采集患者急性期与恢复期双份血清进行抗体测定来 确认，又不能及时进行诊断，因此，使这两种方法在使用中受到很大的限制，而免疫金标法 (Immunochromatography Assay)是九十年代初发展起来的，因其快速、操作简便、试剂稳 定、可室温储运、不易污染的特点得到广泛的应用。它是免疫亲和技术、印记技术、免疫标记 技术和层析技术的组合。将包被抗体、胶体金标记抗体固相化，与样本吸附材料等组合在一 起，制备出免疫层析诊断试条，使用时只需要把该试条下插入样品溶液，数分钟就可以判断 结果。与免疫渗滤法比较，稳定性好，操作更简便、快速，且由于为干试条形式，无需低温保 存，储运也方便，但是目前关于同时检测鸡新城疫和传染性支气管炎病毒的装置或者其它 的检测工具未见有报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种一步检测鸡新城疫和传染性支气管炎病毒的试纸条及 其制备方法和应用，能满足现有技术的上述需求。一种一步检测鸡新城疫和传染性支气管炎病毒的试纸条，有一底衬、该底衬上面 的中部粘帖一包被膜，其特征在于该包被膜中部有一条包被鸡新城疫病毒的抗体的检测 线、一条包被鸡传染性支气管炎病毒的抗体的检测线和一条包被抗鼠IgG抗体的控制线， 包被膜的上面左右分别粘帖一涂覆金标抗体的玻璃纤维膜和吸水纸；涂覆金标抗体的玻璃 纤维膜上面粘贴一样品垫。上述一步检测鸡新城疫和传染性支气管炎病毒的试纸条的制备方法，其特征在于 先制备包被膜将用包被缓冲液稀释的鸡新城疫和传染性支气管炎病毒的单克隆抗体或抗 鸡新城疫和传染性支气管炎病毒的多克隆抗体和抗鼠IgG抗体稀释，并将三种抗体分别平行地喷于硝酸纤维膜的中部上，三种抗体渗入硝酸纤维膜后分别形成鸡传染性支气管炎病 毒的检测线、鸡新城疫病毒的检测线和抗鼠IgG的控制线；再制备涂敷金标抗体的玻璃纤 维膜；然后将包被膜粘贴在底衬上面的中部，在包被膜的上面左右分别粘帖一涂覆金标抗 体的玻璃纤维膜和吸水纸；涂覆金标抗体的玻璃纤维膜上面粘贴一样品垫，做成大板，切割 即得胶体金试纸条。上述一步检测鸡新城疫和传染性支气管炎病毒的试纸条在检测鸡新城疫和传染 性支气管炎病毒中的应用。本发明利用现代国际最先进的胶体金免疫层析技术，提供一种现地农户、基层自 测等用的同时检测鸡新城疫病毒和传染性支气管炎病毒的试纸条，该试纸条具有特异性 强、灵敏度高、检测速度快等优点，且不需使用仪器设备，成本低廉，操作简便，能广泛应用 于现地农户、基层及个人对于鸡新城疫病毒和传染性支气管炎病毒的检测。
附图为本发明试纸条的纵剖结构示意图。
具体实施例方式制备本发明的试纸条，所用的底衬1、样品垫2和吸水纸5是本领域通用的部件，其 余部件的制备方法如下一、包被膜4的制备1.抗体的细胞株制备①新城疫病毒的单克隆抗体细胞株的制备和检定慢慢搅动含有新城疫病毒的鸡胚尿囊液，并加入氯化钠，使其终浓度为0. 5mol/L, 再加入10% (重量百分数，下同)的聚乙二醇6000( ￡66000)，41过夜，以800017/1^11离心 30分钟，收集病毒沉淀，将病毒沉淀用磷酸盐缓冲液(PBS)溶解，4°C过夜，以lOOOOr/min离 心1小时，所得沉淀即为浓缩的病毒，储存在-20°C低温冰箱中备用。从-20°C低温冰箱取出浓缩的病毒，溶化后给BALB/C小鼠多点皮下注射(0. 5ml/ 只)，间隔15天，共免疫3次，融合之前3日，在小鼠腹腔以上述浓缩的病毒0. 25ml的抗原 量进行攻击。用含10% (体积百分数，下同)小牛血清的DMEM培养SP2/0细胞和免疫的 BALB/C小鼠的淋巴细胞，分别按2X107和2X108比例用聚乙二醇1500 (PEG1500)融合，将 融合孔中的上清液分别加在新城疫病毒抗原包被的聚乙烯96孔扳上，用ELISA法检测，确 定细胞阳性孔。将检测所得的阳性株以有限稀释法进行亚克隆，将亚克隆所得的单抗细胞 株于体外进行传代培养，并进行反复液氮冻存和复苏，产生新城疫病毒单克隆抗体阳性率 100%，且保持稳定分泌抗体的能力，其ELISA效价达到1 1000以上。在无菌条件下每只 小鼠腹腔注射液体石蜡0. 5ml，一周后每只小鼠腹腔注射扩大培养为0. 2ml含1-3XI06个 杂交瘤细胞。注射细胞株7-10天后，或小鼠濒死前一次采集腹水，-20°C下保存。采用硫 酸铵沉淀法粗提，进而用HITraprProteinA柱纯化，经SDS-PAGE电泳检定，仅显示单一蛋白 带。采用NaSCN竞争ELISA实验，测定其半数有效量(ED5CI)的下降值，来间接反映其抗体亲 合力的大小。选择其中亲和力较好的细胞株，用相加ELISA法对抗体的抗原结合位点进行 检测。
②传染性支气管炎病毒的单克隆抗体细胞株的制备和检定慢慢搅动含有传染性支气管炎病毒的鸡胚尿囊液，并加入氯化钠，使其终浓度为 0. 5mol/L，再加入10%的PEG6000，4°C过夜，以8000r/min离心30分钟，收集病毒沉淀，将 病毒沉淀用PBS溶解，4°C过夜，以lOOOOr/min离心1小时，所得沉淀即为浓缩的病毒，储存 在-20°C低温冰箱中备用。从-20°C低温冰箱取出浓缩的病毒，溶化后给BALB/C小鼠多点皮下注射(0. 5ml/ 只)，间隔15天，共免疫3次，融合之前3日，在小鼠腹腔以上述浓缩的病毒0. 25ml的抗原 量进行攻击。用含10%小牛血清的DMEM培养SP2/0细胞和免疫的BALB/C鼠的淋巴细胞， 分别按2X 107和2X 108比例用PEG1500融合，将融合孔中的上清液分别加在传染性支气 管炎病毒抗原包被的聚乙烯96孔扳上，用ELISA法检测，确定细胞阳性孔。将检测所得的 阳性株以有限稀释法进行亚克隆，将亚克隆所得的单抗细胞株于体外进行传代培养，并进 行反复液氮冻存和复苏，产生传染性支气管炎病毒单克隆抗体阳性率100%，且保持稳定分 泌抗体的能力，其ELISA效价达到1 1000以上。在无菌条件下每只小鼠腹腔注射液体石 蜡0. 5ml，一周后每只小鼠腹腔注射扩大培养为0. 2ml含1_3X I06个杂交瘤细胞。注射细 胞株7-10天后，或小鼠濒死前一次采集腹水，-20°C下保存。采用硫酸铵沉淀法粗提，进而 用HITraprProteinA柱纯化，经SDS-PAGE电泳检定，仅显示单一蛋白带。采用NaSCN竞争 ELISA实验，测定其ED5(i的下降值，来间接反映其抗体亲合力的大小。选择其中亲和力较好 的细胞株，用相加ELISA法对其的抗原结合位点进行检测。2.溶液的配制①包被缓冲液的配制将0. 05M、pH9. 6的碳酸盐缓冲液(PBS)，用0. 22u膜过滤，
置于4°C备用，有效期为7天。②封闭缓冲液的配制将0. 01M、pH7. 0的PBS，用0. 22u膜过滤，将滤出液置于4°C
备用，有效期为7天。③封闭工作液的配制将含2% BSA、2%脱脂奶溶解于封闭缓冲液，用0. 22u膜过 滤，置于4°C备用，有效期为3天。3.包被膜4制备①抗鸡新城疫病毒检测线6的制备调 喷膜机，喷液量为25微升/35厘米，用包 被缓冲液稀释抗鸡新城疫病毒的单克隆抗体，浓度为70ug/ml，在硝酸纤维膜中部上划线， 室温晾干20分钟。②抗鸡传染性支气管炎病毒检测线7的制备调试喷膜机，喷液量为25微升/35 厘米，用包被缓冲液稀释抗鸡传染性支气管炎病毒的单克隆抗体，浓度为70ug/ml，在硝酸 纤维膜中部上划线，该线与抗鸡新城疫病毒检测线6平行，两线间隔5mm，应细致均勻，室温 晾干20分钟。③控制线8的制备调试喷膜机，喷液量为25微升/35厘米，用包被缓冲液稀释抗 鼠IgG抗体，浓度为2mg/ml，在硝酸纤维膜上划线，该线与抗鸡传染性支气管炎病毒检测线 7平行，两线间隔5mm，应细致均勻，室温晾干20分钟。该三线用的液体分别渗入硝酸纤维 膜中，即分别为抗鸡新城疫病毒检测线6、抗鸡传染性支气管炎病毒检测线7和控制线8。用上述封闭工作液将含有抗鸡新城疫病毒检测线6、抗鸡传染性支气管炎病毒检 测线7和控制线8的硝酸纤维膜于37°C封闭60分钟，取出后置37°C下烘干处理两小时，封袋备用。二、涂敷金标抗体的玻璃纤维膜3的制备1.抗体的制备①新城疫病毒的单克隆抗体细胞株的制备和检定过程同上。②传染性支气管炎病毒的单克隆抗体细胞株的制备和检定过程同上。2.溶液的配制①氯金酸水溶液的配制将10g氯金酸用1000ml双蒸水溶解配成水溶液，置4°C 备用，有效期3天。②柠檬酸三钠水溶液的配制用双蒸水溶解柠檬酸三钠，配成水溶液，置4°C备 用，有效期3天。③碳酸钾水溶液的配制将13. 8g碳酸钾用1000ml双蒸水配制成碳酸钾水溶液， 0. 22u膜过滤，将所得标记洗涤液置4°C备用，有效期7天。④标记洗涤液的配制将20g BSA用1000ml 0. 01M、pH7. 0PBS配置成2% BSA溶 液，0. 22u膜过滤，置4°C备用，有效期15天。⑤金标抗体保存液的配制将10g BSA、5g脱脂奶粉、0. 5g NaN3和1ml Tween-20 溶解在1000ml 0.01M、pH 7. OPBS中，用0. 22u膜过滤，置4°C备用，有效期15天。3.涂敷金标抗体的玻璃纤维膜3的制备①胶体金的烧制用双蒸水将氯金酸稀释成0. 01%，置电炉煮沸，按每100毫 升0. 01%氯金酸加入4毫升柠檬酸三纳，继续煮沸，直到液体呈亮红色即停止加热，冷 却至室温后补足失水。外观应纯净，透亮，无沉淀和漂浮物。②金标抗体的制备用0. 1M碳酸钾水溶液调上述胶体金的pH值至7. 6，按20微 克抗体/毫升胶体金加入抗新城疫和传染性支气管炎病毒的单克隆抗体，混勻，静置30分 钟，以12000rpm离心30分钟，弃去上清液，所得沉淀用标记洗涤液洗涤两次，最后一次弃去 上清液，将所得沉淀用十分之一初始胶体金体积的上述金标抗体保存液溶解，置4°C备用， 有效期7天。③将标记好的胶体金均勻地铺在玻璃纤维膜上，每毫升溶液铺10平方厘米，干 燥，封袋，置4°C备用。制备本发明的试纸条时，将上述包被膜4、覆金标抗体的玻璃纤维膜3和已知的底 衬1、样品垫2以及吸水纸5依次粘贴起来，得到试纸板，最后将该试纸板切割成不同宽度的 试纸条即可。上述的试纸条在检测新城疫和传染性支气管炎病毒中的应用用本试纸条检测发病期鸡的口腔或者肛门拭子中含有的液体样品，把该液体样品 离心后，将所得的液体滴加在本试纸条的样品垫2上，出现的结果在试纸条的检测线6、检 测线7和控制线8位置上各出现一条紫红色条带，鸡新城疫和传染性支气管炎病毒均为阳 性结果；在试纸条的检测线6和控制线8位置上各出现一条紫红色条带，鸡新城疫病毒为阳 性结果；在试纸条的检测线7和控制线8位置上各出现一条紫红色条带，鸡传染性支气管炎 病毒为阳性结果；仅试纸条的控制线8位置上出现一条紫红色条带，为阴性结果；在试纸条 的控制线8位置上未出现紫红色条带为无效结果。
权利要求
一种一步检测鸡新城疫和传染性支气管炎病毒的试纸条，有一底衬(1)、该底衬(1)上面的中部粘帖一包被膜(4)，其特征在于该包被膜(4)中部有一条包被鸡新城疫病毒的抗体的检测线(6)、一条包被鸡传染性支气管炎病毒的抗体的检测线(7)和一条包被抗鼠IgG抗体的控制线(8)，包被膜(4)的上面左右分别粘帖一涂覆金标抗体的玻璃纤维膜(3)和吸水纸(5)；涂覆金标抗体的玻璃纤维膜(3)上面粘贴一样品垫(2)。
2.根据权利要求1所述的一步检测鸡新城疫和传染性支气管炎病毒的试纸条，其特征 在于所述的检测线(6)中包被的鸡新城疫病毒的抗体为抗单克隆抗体和/或多克隆抗体。
3.根据权利要求1所述的一步检测鸡新城疫和传染性支气管炎病毒的试纸条，其特征 在于所述的检测线(7)中包被的鸡传染性支气管炎病毒的抗体为抗单克隆抗体和/或多克 隆抗体。
4.根据权利要求1所述的一步检测鸡新城疫和传染性支气管炎病毒的试纸条，其特征 在于所述的涂覆金标抗体的玻璃纤维膜(3)中有由胶体金颗粒标记的抗鸡新城疫病毒和 抗鸡传染性支气管炎病毒的单克隆抗体。
5.权利要求1所述的一步检测鸡新城疫和传染性支气管炎病毒的试纸条的制备方法， 其特征在于先制备包被膜(4)将用包被缓冲液稀释的鸡新城疫和传染性支气管炎病毒的 单克隆抗体或抗鸡新城疫和传染性支气管炎病毒的多克隆抗体和抗鼠IgG抗体稀释，并将 三种抗体分别平行地喷于硝酸纤维膜(3)的中部上，三种抗体渗入硝酸纤维膜后分别形 成鸡传染性支气管炎病毒的检测线(6)、鸡新城疫病毒的检测线(7)和抗鼠IgG的控制线 (8)；再制备涂敷金标抗体的玻璃纤维膜(3)；然后将包被膜(4)粘贴在底衬(1)上面的中 部，在包被膜(4)的上面左右分别粘帖一涂覆金标抗体的玻璃纤维膜(3)和吸水纸(5)；涂 覆金标抗体的玻璃纤维膜(3)上面粘贴一样品垫(2)，做成大板，切割即得胶体金试纸条。
6.权利要求1所述的一步检测鸡新城疫和传染性支气管炎病毒的试纸条在检测鸡新 城疫和传染性支气管炎病毒中的应用。
全文摘要
一种一步检测鸡新城疫和传染性支气管炎病毒的试纸条及其制备方法和应用，制备时，先制备包被膜将用包被缓冲液稀释的鸡新城疫和传染性支气管炎病毒的单克隆抗体或抗鸡新城疫和传染性支气管炎病毒的多克隆抗体和抗鼠IgG抗体稀释，并将三种抗体分别平行地喷于硝酸纤维膜的中部上，三种抗体渗入硝酸纤维膜后分别形成鸡传染性支气管炎病毒的检测线、鸡新城疫病毒的检测线和抗鼠IgG的控制线；再制备涂敷金标抗体的玻璃纤维膜；然后将包被膜粘贴在底衬上面的中部，在包被膜的上面左右分别粘帖一玻璃纤维膜和吸水纸；玻璃纤维膜上面粘贴一样品垫。该试纸条特异性强，灵敏度高，检测速度快，成本低廉，操作简便，能广泛应用。
文档编号G01N33/577GK101852802SQ201010173048
公开日2010年10月6日 申请日期2010年5月5日 优先权日2010年5月5日
发明者凌红丽, 宋新雨, 蒋贻海, 高亚东, 魏笑笑 申请人:青岛康地恩药业有限公司;青岛宝依特生物制药有限公司