用于鸡传染性支气管炎病毒rt-pcr检测的引物及含有该引物的试剂盒及其检测方法
【技术领域】
[0001]本发明属于兽医微生物检测领域，涉及一种鸡传染性支气管炎病毒荧光定量RT-PCR检测试剂盒，适用于各种组织、细胞、体液样品及疫苗生产中间产品中IBV核酸的定量检测。
【背景技术】
[0002]鸡传染性支气管炎(infect1us bronchitis, IB)是由传染性支气管炎病毒(infect1us bronchitis virus, IBV)引起的一种急性、高度接触性传染病。该病可以侵害鸡的气管、肾脏、输卵管和腺胃等组织，引起雏鸡死亡，产蛋鸡产蛋量和蛋品质下降。IB的流行对养鸡业造成巨大的经济损失，严重制约了世界养禽业的发展。
[0003]IBV属于冠状病毒科的Gamma冠状病毒，其基因组因具有独特的先导引物转录机制，具有很高的错配率。在免疫接种程序、家禽饲养密度等因素的影响下，IBV正以不同的速度和不同的进化方向发生变异。由于不同血清型IBV毒株之间交叉保护力弱，这给IB的免疫预防带来了很大的困难。临床上IB与禽流感、鸡传染性喉气管炎、传染性鼻炎和新城疫等疾病的临床症状相似，给该病的快速诊断造成了困难。因此，建立方便、快速和准确的IBV检测方法成为预防和控制该病的关键。目前，检测IBV的常用方法有病毒分离、血清学试验和分子生物学方法如RT-PCR等。在这些方法中，反转录-多聚酶链式反应(RT-PCR)虽然具有灵敏度高、快速等优点，但不能实现对病毒的定量检测。虽然传统的鸡胚或气管环培养能用于病毒的定量，但这些技术都存在实验周期长、成本高、重复性差等缺点。随着分子生物学技术的飞速发展，近年来发展起来的实时荧光定量PCR技术，不但具有灵敏度高、特异性强、重复性好等优点，还能实现对病毒的定量检测，对病毒的致病机理、免疫机理、防控效果的研究都具有重要意义。
[0004]建立荧光定量RT-PCR方法用于鸡传染性支气管炎病毒的定量检测方面，国内外已有不少研究。国内刘乔然等(刘乔然，刘胜旺.鸡传染性支气管炎病毒Real-time PCR方法的建立及其对感染鸡体内病毒的检测.中国预防兽医学报，2008，(08):637-641.)根据IBV LDT3毒株的N基因设计引物，建立了检测IBV核酸的SYBR Green I荧光定量PCR方法，建立的荧光定量PCR检测方法灵敏度高、特异性强、重复性好，可用于传染性支气管炎的临床诊断。之后，磨美兰等(磨美兰，陈秋英，侯金莲等.鸡传染性支气管炎病毒real-timePCR检测方法的建立.中国兽医科学，2011，(02): 193-198.)根据IBV基因组中N基因的保守区域设计引物，成功建立了检测IBV核酸的SYBR Green I real-time PCR检测方法，通过对人工感染组织样品中病毒核酸的检测，结果显示该方法具有灵敏度高、特异性强、重复性好等优点。王鹏等(王鹏，高峰，王园等.鸡传染性支气管炎病毒Real-time RT-PCR检测方法的建立及应用.中国农学通报，2013，(08): 45-49.)也根据IBV基因组中N基因的保守区域设计引物，建立了检测IBV核酸的SYBR Green I real-time PCR检测方法，对IBVM41株感染组织样品中的病毒核酸进行了定量检测。
[0005]上述文献中报道的鸡传染性支气管炎病毒荧光定量RT-PCR检测方法，所采用的检测引物都是根据IBV结构蛋白基因N的基因序列设计，由于IBV基因组采用独特的先导引物转录机制，在新鲜组织等样品中病毒N基因序列的拷贝数理论上要高于IBV基因组的拷贝数，因此在检测新鲜组织样品时，采用N基因等结构基因设计的检测引物并不能真实反应IBV基因组的拷贝数。而IBV基因组5'端非编码区序列与病毒基因组的拷贝数存在一一对应的关系，本发明针对IBV基因组5'端非编码区保守区域设计引物建立荧光定量RT-PCR检测方法，能真实反应IBV基因组的拷贝数，适用于各种组织、细胞、体液样品及疫苗生产中间产品中IBV基因组的定量检测。
【发明内容】
[0006]本发明的针对上述缺陷，目的在于提供一种用于鸡传染性支气管炎病毒荧光定量RT-PCR检测的引物及含有该引物的检测试剂盒及其检测方法。
[0007]为此本发明采用的技术方案是:所述的引物对是通过对GenBank中公布的IBV基因组序列进行比较分析，选择5'端非编码区序列中无特殊结构且高度保守的区域设计而成。
[0008]所述引物对的核苷酸序列分别如下所示:
引物 1: 5’ - CCGTTGCTTGGGCTACCTAGT-3’ ；或5’ - CTTTTGAGCCTAGCGTTGG-3’ ；或
5’ -GGCGGGTGTGTGGAAGTAGC-3’ ；
引物 2: 5 ’ - CGCCTACCGCTAGATGAACC-3 ’ ；或5’ - TTGTCACTGTCTATTGTATGTCTGC-3’ ；或5 ’ - GCCGACCTTGTGCGAGAACG-3’。
[0009]包含上述引物的鸡传染性支气管炎病毒荧光定量RT-PCR检测试剂盒，包括引物对、SYBR Green I实时荧光定量RT-PCR扩增预混液、阳性对照和水。
[0010]所述实时荧光定量RT-PCR扩增预混液:包含有SYBR Green 1、ROX ReferenceDye、DNA聚合酶、反转录酶、dNTPs、Mg2+和RNA酶抑制剂。
[0011]所述的阳性对照包含有IBV基因组5'端非编码区保守序列的重组质粒。
[0012]一种鸡传染性支气管炎病毒荧光定量RT-PCR检测试剂盒的监测方法，按以下步骤进行:
O阳性对照质粒的构建:
5r端非编码区序列的RT-PCR扩增:根据传染性支气管炎病毒H120的基因组序列设计引物，用于扩增其5'端非编码区片段；
将H120疫苗株接种于SPF鸡胚，后收获尿囊液；采用RNAiso Plus提取基因组RNA，反转录米用 PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit，构建 20 μ L 的反应体系，以 5R作为反转录引物进行反转录反应；
以上述反转录产物为模板，采用引物对5F和5R进行PCR扩增，PCR反应采用高保真酶PrimeSTAR HS DNA Polymerase，构建50 μ L的反应体系；PCR产物经电泳检测后进行胶回收；
重组质粒的构建及鉴定:将上述胶回收的DNA片段用T1ai7酶进行加T处理后，连接到pMD 18-T载体中，转化JMl 09基因工程菌，菌落PCR鉴定阳性克隆，将获得的阳性克隆进行序列测定，筛选阳性对照质粒PMD5UTR ;
2)标准曲线的建立和溶解曲线分析
提取阳性对照质粒PMD5UTR，并进行定量，然后按照10倍梯度进行稀释至10°?10 9拷贝/yL，以不同稀释度的阳性质粒作为模板，每个稀释度设3个重复，进行SYBR Green I实时荧光定量PCR扩增，绘制标准曲线；扩增反应体系为:SYBR Green 1、ROX ReferenceDye、Ex Taq HS DNA 聚合酶、dNTPs、Mg2+ 等 10 μ L，pMD5UTR 质粒 2 μ L，浓度为 10 μ mol/L的引物I和引物2各0.4 μ L，dH20补足至20 μ L，扩增反应程序为:95°C 30s，然后95°C 5s，60°C 20s 进行 40 个循环，然后 95°C 30s，20°C/s，60°C 30s，20°C/s，95°C 30s, 0.1°C /s进行溶解曲线分析。
[0013]所述引物对的核苷酸序列分别如下所示:
引物 1: 5’ - CCGTTGCTTGGGCTACCTAGT-3’ ；或5’ - CTTTTGAGCCTAGCGTTGG-3’ ；或
5’ -GGCGGGTGTGTGGAAGTAGC-3’ ；
引物 2: 5 ’ - CGCCTACCGCTAGATGAACC-3 ’ ；或5’ -TTGTCACTGTCTATTGTATGTCTGC-3’ ；或5’ -GCCGACCTTGTGCGAGAACG-3’；
所述 5F:5’ -gttgctggtatcactgcttgt-3，，5R:5’ -GACCACTGGCATGCTGTT-3，。
[0014]所述I)步骤中:所述H120疫苗株接种于11日龄SPF鸡胚，36h后收获尿囊液； PCR反应条件为:95°C，30s ；52°C, 30s ;72°C，Imin ;PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后进行胶回收。
[0015]所述2)步骤中:采用无内毒素质粒提取试剂盒提取阳性对照质粒PMD5UTR，并进行定量
本发明所述的引物对是通过对GenBank中公布的IBV基因组序列进行比较分析，选择5'端非编码区序列中无特殊结构且高度保守的区域设计多对引物，通过最终优化筛选获得。引物间和引物内无互补序列。
[0016]本发明的第二个目的是提供一种用于荧光定量RT-PCR检测鸡传染性支气管炎病毒的试剂盒。
[0017]优选地，所提供的用于荧光定量RT-PCR检测鸡传染性支气管炎病毒的试剂盒，由所述的引物对、SYBR Green I实时荧光定量RT-PCR扩增预混液、阳性对照和水组成。
[0018]其中所述实时荧光定量RT-PCR扩增预混液，包含有SYBR Green 1、R0X ReferenceDye、DNA聚合酶、反转录酶、dNTPs, Mg2+和RNA酶抑制剂。
[0019]其中所述的阳性对照，其特征在于含有IBV基因组5'端非编码区保守序列的重组质粒。
[0020]实验证明，本发明具有以下优点:
O能快速定量样品中病毒基因组的拷贝数。该方法无需进行电泳，扩增反应仅需要40min，反应结果可以直接通过电脑观察；而常规的RT-PCR方法最少需要120min来完成扩增反应和结果观察，且无法定量。
[0021]2)操作简单，一次检测的样本量大。按照设定的程序和步骤制备反应管，PCR反应开始就在封闭的体系中完成扩增和实时检测，降低了污染的可能性。
[0022]3)灵敏度高。建立的SYBR Green I实时荧光定量RT-PCR方法对样品中IBV的含量进行定量，能检测到限量为100个拷贝的含有IBV基因片段的阳性质粒，常规PCR为1000个拷贝，检测结果比常规PCR方法敏感。
[0023]4)特异性好。本发明提供的引物对于不含有IBV的检测样本均无扩增信号，具有良好的特异性。
【附图说明】
[0024]图1为构建阳性标准品时，5'端非编码区PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，片段的大小约为0.7kb。
[0025]图2是SYBR Green I实时定量RT-PCR方法检测IBV的标准曲线。图中各点分别对应的模板浓度为I X 12拷贝/ μ L，I X 103拷贝/ μ L，I X 104拷贝/ μ L，I X 105拷贝/ μ L，
I X 16拷贝 / μ L 和 I X 10 7拷贝 / μ L。
[0026]图3为SYBR Green I实时定量RT-PCR方法检测IBV的溶解曲线。其中空白对照为H2O,阳性模板浓度分别为I X 12拷贝/ μ L，I X 103拷贝/ μ L，I X 104拷贝/ μ L，I X 105拷贝/ μ L，I X 16拷贝/ μ L和I X 10 7拷贝/ μ L。
[0027]图4为采用SYBR Green I实时定量RT-PCR方法检测IBV在鸡胚中的生长曲线，分别测定18h、24h、30h、36h、42h、48h、60h和72h所收获尿囊液中毒株rH120_YZ株及其亲本毒株H120的病毒滴度。