Cyp2f1基因在骨关节炎诊治中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，具体地涉及人CYP2F1基因在骨关节炎的诊断、治疗中 的用途。
【背景技术】
[0002] 骨关节炎（Osterarthritis，0A)也称为退行性关节炎，是在老年人和肥胖者中最 普遍的疾病。0A是关节的疾病，但不同于类风湿性关节炎（RA)，这种疾病不是系统性的，通 常只影响一个或数个关节。这种疾病导致关节软骨的总的破坏，下方骨头的硬化，和骨赘形 成，造成运动能力丧失和疼痛。最终的结果往往是需要全关节置换。
[0003] 人口统计学趋势表明，到2020年，受关节疾病影响的人群将增加到50%，全世界 将有5. 7亿人受到骨关节炎的困扰。我国社会逐渐进入老龄化社会，因此我们将面临骨关 节炎发病的普遍流行时期。对该病的研究十分重要和迫切。
[0004] 骨关节炎的原发异常可以发生在关节软骨、滑膜、软骨下骨、韧带或关节周围的神 经肌肉组织。关节软骨的损害是骨关节炎最明显的变化。关节软骨丧失是骨关节炎的关键 病变。随着蛋白聚糖含量的下降，关节软骨逐渐缓慢降解。由于骨关节炎患者的蛋白聚糖、 胶原和透明质酸合成速率均增加，使得组织的分解代谢活性特别高。通常认为，蛋白溶解酶 和中性金属蛋白酶在骨关节炎关节软骨丢失中是最重要的原因。关节软骨组织内没有血管 和神经，对创伤、炎症的反应是由关节软骨、滑膜组织或关节液中的蛋白质如细胞因子等介 导的。滑膜对于维持关节的正常功能，并且在骨关节炎疾病的发生发展过程中起着重要的 作用。
[0005] 目前临床上对于骨关节炎的诊断主要基于影像学的检查。X线表现主要为关节间 隙狭窄，软骨下骨质硬化及囊性变，关节边缘骨赘形成，关节面萎陷、变形和关节半脱位等。 MRI可示早期软骨、半月板等关节结构的病变，有利于早期诊断。CT用于椎间盘病的诊断， 优于X线。关节间隙变窄，软骨下骨硬化，边缘性骨刺脊椎关节连成骨桥。亦可见骨囊肿以 及畸形。如发现这些变化可作为诊断的依据和估计关节损伤的程度。0A-般在早期没有或 很少有症状，只在继发炎症、疼痛或影响关节的活动时，病人才找医生。此时，关节损伤发生 已久。因为开发用于早期骨关节炎诊断的方法是亟待解决的问题。
【发明内容】
[0006] 为了弥补现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种可用于骨关节炎 (Osterarthritis，0A)早期诊断的分子标志物。相比传统的骨关节炎的诊断方法，使用基 因标志物来诊断骨关节炎的具有及时性、特异性和灵敏性，从而使患者在疾病早期就能知 晓疾病风险，针对风险高低，采取相应的预防和治疗措施。
[0007] 为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
[0008] 本发明提供了一种人CYP2F1基因及其表达产物在制备诊断骨关节炎的产品中的 应用。
[0009] 进一步，上面所提到的诊断产品包括：通过RT-PCR、实时定量PCR、免疫检测、原位 杂交或芯片检测CYP2F1基因及其表达产物的表达水平以诊断骨关节炎的产品。
[0010] 进一步，所述用RT-PCR诊断骨关节炎的产品至少包括一对特异扩增CYP2F1基因 的引物；所述用实时定量PCR诊断骨关节炎的产品至少包括一对特异扩增CYP2F1基因的引 物；所述用免疫检测诊断骨关节炎的产品包括：与CYP2F1蛋白特异性结合的抗体；所述用 原位杂交诊断骨关节炎的产品包括：与CYP2F1基因的核酸序列杂交的探针；所述用芯片诊 断骨关节炎的产品包括：蛋白芯片和基因芯片；其中，蛋白芯片包括与CYP2F1蛋白特异性 结合的抗体，基因芯片包括与CYP2F1基因的核酸序列杂交的探针。
[0011] 优选地，所述产品包括芯片、试剂盒。
[0012] 本发明还提供了人CYP2F1基因在高通量测序平台中的应用。随着高通量测序技 术的发展，对一个人的基因表达谱的构建将成为十分便捷的工作。通过对比疾病患者和正 常人群的基因表达谱，容易分析出哪个基因的异常与疾病相关。因此，在高通量测序中获知 人CYP2F1基因的异常与骨关节炎相关也属于人CYP2F1基因的用途，同样在本发明的保护 范围之内。
[0013] 本发明还提供了人CYP2F1基因及其表达产物在制备治疗骨关节炎的药物中的应 用。
[0014] 本发明所述的"治疗骨关节炎的药物"的主要活性成分包括抑制CYP2F1基因表达 的物质、抑制CYP2F1基因表达产物稳定性的物质、和/或抑制CYP2F1基因表达产物活性的 物质。
[0015] 进一步，本发明所述的治疗骨关节炎的药物包括：通过干扰RNA抑制CYP2F1基因 表达的双链核糖核酸，或基于CYP2F1抗原蛋白的肿瘤疫苗、或用于抑制CYP2F1蛋白活性的 蛋白质。
[0016] 本发明还提供了一种用于治疗骨关节炎的药物组合物，所述药物组合物包含 CYP2F1基因和/或其表达产物抑制剂。所述抑制剂包括抑制CYP2F1基因表达的物质、抑制 CYP2F1基因表达产物稳定性的物质、和/或抑制CYP2F1基因表达产物活性的物质。
[0017] 进一步，本发明所述抑制剂包括：通过干扰RNA抑制CYP2F1基因表达的双链核糖 核酸，或基于CYP2F1抗原蛋白的肿瘤疫苗、或用于抑制CYP2F1蛋白活性的蛋白质。
[0018] 本发明还提供了上述CYP2F1基因和/或其表达产物抑制剂在制备治疗骨关节炎 药物中的应用。
[0019] 在本发明中，所述RNA干扰（RNA interference，RNAi)是指在进化过程中高度保 守的、由双链RNA (double-stranded RNA，dsRNA)诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现 象。使用RNAi技术可以特异性剔除或关闭特定基因的表达，该技术已被广泛用于探索基因 功能和传染性疾病及恶性肿瘤的基因治疗领域。以细胞为基础的RNAi筛选在功能基因学 研究方面具有许多优势，主要表现在大多数细胞类型都能使用RNAi方法，并且相对较容易 下调或沉默任何目的基因的表达。
[0020] 为了确保CYP2F1基因能够被高效剔除或沉默，根据CYP2F1基因的mRNA序列设计 了siRNA特异性片段。siRNA的设计根据已发表的通用设计原则（Elbashir et. al 2001， Schwarz et.al 2003，Khvorova et. al 2003，Reynolds et.al 2004，Hsieh et. al 2004， Ui-Tei et.al 2004)，通过在线工具完成设计，该在线工具为：
[0021] siRNASelectionProgram of Whitehead Institute (BingbingYuan et. al 2004， http://jura.wi.mit.edu/bioc/siRNAext/)和 BLOCK-iTTM RNAi Designer ofINVITROGEN(winner of the 2004Frost&Sul1ivan Excellence in Research Award, https://rnaidesigner. invitrogen. com/sirna/)。为了进一步提高 siRNA 片断的有效性， 综合两个在线设计工具的优点来设计用于筛选的siRNA片断。最后，通过同源性比对（NCBI BLAST)来过滤siRNA序列，以提高siRNA片断的特异性并减少RNAi干扰的脱靶效应。
[0022] 本发明的药物还包括药学上可接受的载体，载体，这类载体包括（但并不限于）： 稀释剂、赋形剂如水等、填充剂如淀粉、蔗糖等；粘合剂如纤维素衍生物、藻酸盐、明胶和聚 乙烯吡咯烷酮；湿润剂如甘油；崩解剂如琼脂、碳酸钙和碳酸氢钠；吸收促进剂季铵化合 物；表面活性剂如十六烷醇；吸附载体如高岭土和皂粘土；润滑剂如滑石粉、硬脂酸钙和 镁、聚乙二醇等。
[0023] 本发明的药物还可与其他治疗骨关节炎的药物联用，多种药物联合使用可以大大 提到治疗的成功率。
[0024] 本发明还提供了一种诊断骨关节炎的产品，所述产品包括但不限于芯片、试剂盒。
[0025] 其中，所述芯片包括基因芯片、蛋白质芯片；所述基因芯片包括固相载体以及固 定在固相载体的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括用于检测CYP2F1基因转录水平的 针对CYP2F1基因的寡核苷酸探针；所述蛋白质芯片包括固相载体以及固定在固相载体的 CYP2F1蛋白的特异性抗体；所述基因芯片可用于检测包括人CYP2F1基因在内的多个基 因（例如，与骨关节炎相关的多个基因）的表达水平。所述蛋白质芯片可用于检测包括人 CYP2F1蛋白在内的多个蛋白质（例如与骨关节炎相关的多个蛋白质）的表达水平。通过将 多个与骨关节炎的标志物同时检测，可大大提高骨关节炎诊断的准确率。
[0026] 其中，所述试剂盒包括基因检测试剂盒和蛋白免疫检测试剂盒；所述基因检测试 剂盒包括用于检测CYP2F1基因转录水平的试剂；所述蛋白免疫检测试剂盒包括CYP2F1蛋 白的特异性抗体。进一步，所述试剂包括使用RT-PCR、实时定量PCR、免疫检测、原位杂交或 芯片方法检测CYP2F1基因表达水平过程中所需的试剂。优选度，所述试剂包括针对CYP2F1 基因的引物和/或探针。根据CYP2F1基因的核苷酸序列信息容易设计出可以用于检测 CYP2F1基因表达水平的引物和探针。
[0027] 与CYP2F1基因的核酸序列杂交的探针可以是DNA、RNA、DNA-RNA嵌合体、PNA或 其它衍生物。所述探针的长度没有限制，只要完成特异性杂交、与目的核苷酸序列特异性结 合，任何长度都可以。所述探针的长度可短至25、20、15、13或10个碱基长度。同样，所述 探针的长度可长至60、80、100、150、300个碱基对或更长，甚至整个基因。由于不同的探针 长度对杂交效率、信号特异性有不同的影