雌激素代谢检测试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种检测女性雌激素代谢是否正常的试剂盒，包括检测CYP1A1基因上rs4646903位点、CYP1B1基因上Leu432Val位点、COMT基因上Val158Met位点和GSTT1基因上Present/Null位点多态性的特异性引物对及特异性荧光探针对，Taq酶，dNTP混合液，MgCl2溶液，反应缓冲液和去离子水。
【专利说明】雌激素代谢检测试剂盒
【技术领域】
[0001]本发明涉及分子生物学和医学领域，更具体的，本发明涉及一种检测女性雌激素代谢是否正常的试剂盒。
【背景技术】
[0002]雌激素是一组化学结构非常相近的类固醇激素，由18个碳原子组成，包括一个芳香环(A环)，一个位于C-3处的羟基和一个位于C-17的羟基或酮基，以及在其他一些基团。最常见的天然雌激素是雌酮(El)、雌二醇(E2)和雌三醇(E3)，其中以E2的雌激素作用最强。通常情况下主要由女性或者雌性哺乳动物的卵泡颗粒细胞分泌，此外两性的肾上腺皮质、大脑和脂肪细胞，以及雄性睾丸间质细胞也能分泌少量雌激素。无论雄性和雌性动物体内都存在一定比例的雌、雄激素。
[0003]雌激素的代谢由I相代谢酶和II相代谢酶共同完成。雌二醇被CYPlAl和CYPlBl羟基化为儿茶酚雌激素，即2-0HE2和4-0HE2。儿茶酚雌激素要么经COMT发生氧位甲基化生成 2-Me0E2、2-0H-3-Me0E2 或 4_Me0E2，要么进一步由 CYP450 酶系氧化为半醌(E2_2，3-SQ、E2-3，4-SQ)和醌(E2-2，3_Q、E2_3，4-Q)。这些雌激素醌类物质经GSTs催化，与GSH结合形成2-0HE2-l-SG、2-0HE2-4-SG或4-0HE2-2-SG。若未能经GSTs代谢，则形成醌-DNA加合物(比如4-0HE2-N7-鸟嘌呤、2-0HE2-N2-脱氧鸟嘌呤)或者通过活性氧在半醌和醌上发生多重氧化生成氧化加合物(比如8-0H-脱氧鸟嘌呤)。此外，UGTs和SULTs分别向雌激素的中间代谢产物转移葡萄糖醛酸基和磺基，形成水溶性化合物，被机体排出体内
[0004]进入围绝经期 是女性的一个特殊阶段，受到生物、心理和社会因素的影响，现代医学研究认为，卵巢功能衰退、性激素分泌减少、促性腺激素升高以及不适应机体内分泌的重新调整而引起植物神经功能紊乱是导致绝经期综合征发病的主要原因。科学研究发现，雌激素受体广泛分布在女性全身组织和器官的细胞膜上，当雌激素减少时，这些组织和器官就会发生退行性变或代谢上的变化，进而出现一系列神经、内分泌、代谢和心理的失衡，弓丨起各系统改变的综合征候群。目前认为卵巢功能衰退、雌激素分泌减少、促性腺激素升高及内分泌平衡状况改变是引起绝经期综合征的主要原因，并发现雌激素降低的水平与绝经期综合征的严重度基本呈正相关。
【发明内容】
[0005]本发明提供一种检测女性雌激素代谢是否正常的试剂盒。
[0006]该试剂盒包括:检测CYPlAl基因上rs4646903位点、CYPlBl基因上Leu432Val位点、COMT基因上Vall58Met位点和GSTTl基因上Present/Null位点多态性的特异性引物对及特异性荧光探针对，Taq酶，dNTP混合液，MgCl2溶液，反应缓冲液，去离子水。
[0007]本试剂盒中所述的特异性引物和荧光探针对于本领域的普通技术人员来说是能够轻易完成设计的，特异性引物和荧光探针对可用常规的DNA合成技术进行合成。【具体实施方式】
[0008]下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照厂商所建议的条件。
[0009]实施例检测试剂盒的使用
[0010]步骤1:DNA模板的抽取
[0011]用硅胶吸附法抽提口腔上皮细胞的基因组DNA。
[0012]步骤2:荧光定量PCR反应
[0013]使用检测试剂盒中的荧光定量PCR套装，进行荧光定量PCR反应，反应的体系为总体积10 u 1，包含浓 度为20ng/ Ul的DNA模板2u、1ul IOX荧光定量PCR反应缓冲液、
0.1 u l 25mM dNTP 混合液、0.6 u I 25mMMgCl2 溶液、0.025 u l (5units/ u I) Taq DNA 聚合酶、20 u M的有义引物和反义引物各0.225 ul、10 u M的带VIC荧光探针和带FAM荧光探针各0.25 yl,去尚子水5.325 ul o
[0014]在PCR扩增仪上进行反应，反应条件为50°C、2分钟，95°C、10分钟，进行60个循环的95°C、30秒，60°C、1分钟。反应结束后在荧光定量PCR仪上读取样品荧光量。
[0015]步骤4:基因型分析
[0016]根据试剂盒使用说明书标示的基因分型图示对SNP位点进行基因型分析。
[0017]熟悉荧光定量PCR技术的本领域技术人员能够通过辨识荧光定量PCR仪上显示的最终样品荧光量，根据不同序列探针荧光信号的强弱即可确定所检测的SNP位点的基因型。
【权利要求】
1.一种检测女性雌激素代谢是否正常的试剂盒，包括特异性引物对及特异性荧光探针对，Taq酶，dNTP混合液，MgCl2溶液，荧光定量PCR反应缓冲液和去离子水，其特征在于:所述的特异性引物对及特异性荧光探针对是针对CYPlAl基因上rs4646903位点、CYPlBl基因上Leu432Val位点、COMT基因上Vall58Met位点和GSTTl基因上Present/Null位点多态性设计的。
【文档编号】C12Q1/68GK103757090SQ200910200485
【公开日】2014年4月30日 申请日期:2009年12月23日 优先权日:2009年12月23日
【发明者】冯哲民, 邹祖烨, 贺宪民 申请人:新靶向(上海)分子医疗技术有限公司