对hbv基因分型及耐药性位点分析的试剂盒及其方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物技术服务行业，涉及一种利用DNA —代测序技术对乙型肝炎病毒HBV基因分型及耐药性位点分析的试剂盒。
【背景技术】
[0002]乙型肝炎病毒Ofepatitis B Virus, HBV)属嗜肝DNA病毒科，基因组长约3.2KB，为部分双链环状DNA，目前已确定的乙型肝炎病毒HBV基因型有A、B、C、D、E、F、G、H八种。乙型肝炎病毒HBV感染引起宿主肝脏炎性病变为主，并可引起多器官损坏的疾病，乙型病毒性肝炎，俗称乙肝。据世界卫生组织报告，全球约有20亿人曾感染过乙型肝炎病毒HBV，其中3.5亿为慢性乙型肝炎病毒HBV感染者，每年约有100万人死于乙型肝炎病毒HBV感染所致的肝衰竭、肝硬化和原发性肝癌。目前国内外对于慢性乙型肝炎病毒HBV感染患者的治疗共识是抗病毒长期治疗，乙型肝炎病毒HBV是一种突变率极高的病毒，自然突变率101° 11点突变/天，在长期药物治疗特别是核苷酸类似物药物选择压力下，乙型肝炎病毒HBV耐药突变发生频率高，临床耐药突变成为影响慢性乙肝治疗效果的主要因素之一。我国SFDA批准上市的核苷酸类似物药物有4种:拉米夫定(Lamivudine，LAM)、替比夫定(Telbivudine，LdT)、阿德福韦酯(Adefovir，ADV)和恩替卡韦(Entecavir，ETV);根据乙肝患者不同分型，及耐药性位点型别，来确定使用哪种药物，因此检测分型和早期发现乙型肝炎病毒HBV耐药相关变异具有重要的意义。目前常规的乙型肝炎病毒HBV分型检测主要使用的是血清分型，不同型别的抗原性表位不同，利用这些具有型特异表位的单克隆抗体通过酶联免疫来区分不同的型别，另外还有限制性片段长度多态性(RFLP)、型特异性探针检测、基因芯片分析、实时定量PCR法等；而耐药性分析主要是应用基因芯片的方法进行。
[0003]应用血清分型的方法形成较早，适用于大量样本的分型分析，但由于乙肝患者体内血清中的乙肝核心抗原数量有限，使酶联免疫反应的效率极低，而且步骤繁杂，相对耗时较长；同时耐药性分析对于基因序列的准确性要求较高，所以传统的基因芯片相对于基因组序列测序检测，容易污染，出现假阳性，准确性较差，耗时较长，测序的方法更加直观可
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【发明内容】
[0004]本发明的目的在于提供一种对HBV基因分型及耐药性位点分析的试剂盒以及其方法，利用该试剂盒得到的结果准确性极高，灵敏度高，可高通量操作，有利于应用在精准医疗，对慢性乙肝长期治疗给予准确的指导。
[0005]为实现本发明的目的，本发明采用以下技术方案:
[0006]一种对HBV基因分型及耐药性位点分析的试剂盒，包括1xPCR Permix,乙型肝炎病毒HBV靶DNA扩增引物、阳性对照标准品以及去离子水，所述乙型肝炎病毒HBV靶DNA扩增引物是:
[0007]HBV-forward primer (HBV-FP):GGTGGACTTCTCTCAATTTTCTAGG
[0008]HBV-reverse primer (HBV-RP):GTGCAGAGGTGAAGCGAAGTG
[0009]所述1xPCRPermix 包括:1xTaq bufTer、25mM 的 Mgcl2、2mM 的 dNTPs、lU 的 Taq酶及去离子水。
[0010]作为优选地，所述试剂盒还包括乙型肝炎病毒HBVDNA提取试剂、阳性对照标准品和阴性对照。
[0011]作为优选地，所述乙型肝炎病毒HBV DNA提取试剂包括20mg/ml的蛋白酶K、50mg/ml的RNaseA、红细胞裂解液、无水乙醇、吸附柱、washing buffer以及去离子水。
[0012]作为优选地，所述的阳性对照标准品为已知型别的乙型肝炎病毒HBV DNA样品，所述阴性对照为去离子水。
[0013]一种乙型肝炎病毒HBV基因分型及耐药性位点分析的方法，包括以下步骤:
[0014]I)乙型肝炎病毒HBV基因组的提取:以含灭活乙型肝炎病毒HBV的血清为样本，取200ul血清样本，加入20ul蛋白酶K溶液到1.5ml离心管中，另外加入5ul RNaseA溶液，混合均匀；加入200ul红细胞裂解液，混匀充分，低速瞬时离心后置于56°C水浴中，温浴15min,并且每隔3min颠倒混匀一次，加入200ul无水乙醇，震荡10s，将混合后的溶液全部转移到套有2ml收集管的吸附柱中，室温下，1000g离心lmin，倒掉收集管中废液，将吸附柱放到一个新的2ml收集管中，使用washing buffer 500ul，室温离心13000g离心lmin，重复洗脱两次，室温下13000g离心2min，去除残留在吸附柱上面的废液和.washing buffer，然后将吸附柱置于一个干净灭菌的1.5ml离心管中，使用去离子水将吸附柱硅胶膜上的DNA洗脱下来；
[0015]2)基因组序列扩增:根据已知乙型肝炎病毒HBV基因组序列分析，得到P区及S区序列，P区和S区经过同源性比对，设计合成一对引物扩增目的区域的序列:
[0016]引物序列:
[0017]HBV-forward primer (HBV-FP):GGTGGACTTCTCTCAATTTTCTAGG
[0018]HBV-reverse primer (HBV-RP):GTGCAGAGGTGAAGCGAAGTG
[0019]其中的PCR 反应液包括:1xTaq buffer、1pmoI/uI 的 HBV-FP 和 HBV_RP、25mM 的Mgcl2、2mM的dNTPs、IU的Taq酶、乙型肝炎病毒HBVDNA及去离子水；
[0020]3)乙型肝炎病毒HBV分型:对扩增得到的DNA进行测序，测序所得P区(包含S区)的碱基序列，通过NCBI在线分型数据库进行分型分析:
[0021]分型网站:http://www.ncb1.nlm.nih.gov/projects/genotyping/formpage.cgi ；
[0022]4)乙型肝炎病毒HBV耐药性位点分析:基于目前治疗乙肝的药物主要是核苷类药物，其治疗原理是通过与乙型肝炎病毒HBV多聚酶的天然底物dNTP竞争来达到抑制乙型肝炎病毒HBV多聚酶活性，从而达到抑制乙型肝炎病毒HBV复制的作用；测定对下列位点的基因分析，确定耐药性情况:
[0023]A、拉米夫定(LAM):rtM204V/I，rtL180M、rtV173L，
[0024]B、阿德福韦酯(ADV):rtA181T/V、rtN236T、rtI233V，
[0025]C、恩替卡韦(ETV):rtT184G、rtS202G/1、rtI169T、rtM250V，
[0026]D、替比夫定(LdT):rtM204I/V、rtL180M。
[0027]本发明与现有技术相比具有的有益效果为:本发明的方法基于sanger法DNA—代测序技术，对乙型肝炎病毒HBV的基因组进行序列测序分析，碱基序列的准确率达99.9%，根据测序得到的乙型肝炎病毒HBV的基因组序列，来对病毒进行分型及其相关耐药性位点分析，结果可靠，灵敏度高。
【附图说明】
[0028]图1为HBV靶DNA片段扩增琼脂糖凝胶电泳；
[0029]图2为HBV靶DNA序列测序结果拼接情况；
[0030]图3为HBV NCBI在线分型结果。
[0031 ] 图4为HBV耐药性位点突变分析情况。
【具体实施方式】
[0032]为让本领域的技术人员更加清晰直观的了解本发明，下面将对本发明作进一步的说明。
[0033]实施例1
[0034]一种对HBV基因分型及耐药性位点分析的试剂盒，包括1xPCR Permix,乙型肝炎病毒HBV靶DNA扩增引物、阳性对照标准品以及去离子水，所述乙型肝炎病毒HBV靶DNA扩增引物是:
[0035]HBV-forward primer (HBV-FP):GGTGGACTTCTCTCAATTTTCTAGG
[0036]HBV-reverse primer (HBV-RP):GTGCAGAGGTGAAGCGAAGTG
[0037]所述PCR 反应液包括:10xTaq buffer、1pmoI/uI 的 HBV-FP 和 HBV_RP、25mM 的Mgcl2、2mM的dNTPs、IU的Taq酶、乙型肝炎病毒HBVDNA及去离子水；所述试剂盒还包括乙型肝炎病毒HBVDNA提取试剂、阳性对照标准品和阴性对照；所述的阳性对照标准品为已知型别的乙型肝炎病毒HBV DNA样品，所述阴性对照为去离子水；所述乙型肝炎病毒HBVDNA提取试剂包括20mg/ml的蛋白酶K、50mg/ml的RNaseA、红细胞裂解液、无水乙醇、吸附柱、washing buffer以及去离子水。