专利名称：：一种经济简便的pcr产物凝胶乙醇纯化方法
技术领域：
：本发明涉及一种经济简便的PCR产物凝胶乙醇纯化方法，属于生物
技术领域：
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背景技术：
：PCR产物中除了含有目的DNA片段之外，还含有剩余的引物、TaqDNA酶以及dNTP，这些成分的存在将会影响到后续的一些实验。例如双脱氧PCR测序反应只需要单侧引物，因此要去除过量剩余的双侧引物；单核甘酸延伸SNP基因分型技术(AppliedBiosystemSNaPShot)要去除所有残存的dNTP,反应中只允许荧光标记的单个ddNTP掺入。因此，对PCR产物进行纯化非常必要。目前，扩增后的PCR产物纯化主要有两类一种是直接从PCR扩增反应混合物中进行纯化，如超滤、沉淀(PEG沉淀)，硅结合等；另一种是先将PCR产物进行凝胶电泳，然后通过柱纯化、磁珠纯化或尼龙膜等方法纯化。然而，这些纯化方法各有利弊，一般来讲，其弊端如下1.DNA回收率不高，大致在50%90%;2.纯化试剂价格昂贵，一般的试剂盒纯化一个样本约需要人民币3-5元；3.回收DNA片段长度范围窄，尤其对短的DNA片段不易回收，且得率低；4.操作步骤比较繁琐，费时费力；5.回收使用的试剂会给后续实验带来干扰。因此，探索一种能将各种长度的PCR产物中的目的片段，大批量地、廉价地、高纯度地，纯化出来的方法，一直是分子生物学研究工作者所不断追求的。
发明内容本发明的目的是克服上述弊端，而提供一种成本较低、高效、快速、回收片段范围大的PCR产物的纯化方法。本发明解决问题所采取的技术方案是一种经济简便的PCR产物凝胶乙醇纯化方法，其特征是将经琼脂糖凝胶电泳DNA分离技术分离得到的PCR产物中的目的DNA片段切胶后放入离心管，向其直接加去离子水并水浴锅加热使凝胶溶解，然后迅速加入无水乙醇，再高速离心沉淀分离得到纯化产物。所述的一种经济简便的PCR产物凝胶乙醇纯化方法，其中加热为水浴锅加热至煮沸，煮沸时间约610分钟。所述的一种经济简便的PCR产物凝胶乙醇纯化方法，其中无水乙醇是在凝胶刚溶解完时立即加入的。所述的一种经济简便的PCR产物凝胶乙醇纯化方法，其中先加入的去离子水与后加入的无水乙醇的体积比为4:10。所述的一种经济简便的PCR产物凝胶乙醇纯化方法，其中离心沉淀用的离心速度为14000~16000转/分钟。本发明提供的一种经济简便的PCR产物凝胶乙醇纯化方法，成本较低，只需几分人民币，而一般商用试剂盒成本是其数百倍，另外该方法具有高效、快速、回收片段范围大、方便等优点。全套操作只需15分钟便可完成，片段范围为大于等于30bp，回收纯化的DNA片段纯度高，完整性好，纯化的产物可用于连接、标记、测序、杂交、酶切、显微注射、体外转录等后继实验。本发明提供的一种经济简便的PCR产物凝胶乙醇纯化方法纯化效果如表1、表2和表3。表1:PCR产物纯化前后DNA浓度测定<table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table>表2:PCR产物不同片段回收率比较<table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table>表3:PCR产物不同纯化方法比较<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>具体实施例方式通过以下具体实施步骤，来进一步说明本发明(1)使用lXTAE缓冲液制作2X(w/v)的琼脂糖凝胶，然后对含有目的DNA的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳；(2)在紫外灯下切出含有目的DNA的琼脂糖凝胶，此时应注意尽量切除不含目的DNA的凝胶，尽量减少凝胶体积，切胶时请注意不要将DNA长时间暴露于紫外灯下，以防止DNA损伤；(3)将切下的凝胶小块(约3mmX3mmX3函^9mm3)置入1.5m1离心管内，然后加入400u1去离子水；(4)将含有凝胶的离心管放入水浴锅加热至煮沸，煮沸约610分钟，使凝胶融化后迅速加入1000ul无水乙醇；(5)用漩涡振荡器将离心管震荡10秒，然后轻微离心3秒钟(短暂甩一下)，此时管底会出现凝胶沉淀物；(6)将上清液倒入另一个1.5ml离心管，丢弃含有凝胶沉淀物的离心管；(7)将含有上清液的离心管离心(15000转/分钟)离心15分钟，迅速倒置弃上清液；(8)离心管盖打开，室温晾干5分钟，然后加入20u1去离子水溶解沉淀在管子底部的DNA;(9)取5nl样品，D6(w/v)琼脂糖凝胶电泳检测纯化结果，测定DNA浓度。权利要求1、一种经济简便的PCR产物凝胶乙醇纯化方法，其特征是将经琼脂糖凝胶电泳DNA分离技术分离得到的PCR产物中的目的DNA片段切胶后放入离心管，向其直接加去离子水并水浴锅加热使凝胶溶解，然后迅速加入无水乙醇，再高速离心沉淀分离得到纯化产物。2、按照权利要求1所述的纯化方法，其特征是其中加热为水浴锅加热至煮沸，煮沸时间约610分钟。3、按照权利要求1所述的纯化方法，其特征是其中无水乙醇是在凝胶刚溶解完时立即加入的。4、按照权利要求1所述的纯化方法，其特征是其中先加入的去离子水与后加入的无水乙醇的体积比为4:10。5、按照权利要求1所述的纯化方法，其特征是其中离心沉淀用的离心速度为1400016000转/分钟。全文摘要本发明公开了一种经济简便的PCR产物凝胶乙醇纯化方法，属生物
技术领域：
，它是将经琼脂糖凝胶电泳DNA分离技术分离得到的PCR产物中的目的DNA片段切胶后放入离心管，向其直接加去离子水并水浴锅加热使凝胶溶解，然后迅速加入无水乙醇，再高速离心沉淀分离得到纯化产物。该方法成本较低，具有高效、快速、回收片段范围大、方便等优点。文档编号C12N15/10GK101503684SQ20091001968公开日2009年8月12日申请日期2009年3月16日优先权日2009年3月16日发明者阳刘,刘文敏,杨树林,刚陈申请人:刚陈