乙醇厂副产物用于酵母繁殖的用途的制作方法

专利名称：乙醇厂副产物用于酵母繁殖的用途的制作方法
乙醇厂副产物用于酵母繁殖的用途相关申请的交叉引用本申请要求2007年11月2日提交的美国专利申请序列号61/001，714的权益。美 国专利申请序列号61/001，714通过引用并入，如同完全重写于本文中。联邦资助研究的声明无。
背景技术：
下文包括可用于理解本教导的信息。这并非承认，对于目前所描述的或所要求的 主题而言，本文所提供的信息中的任一种或者物质为现有技术，也并非承认，被具体或者暗 示引用的任何出版物或者文献为现有技术。1.发明领域本教导涉及但不限于如下领域乙醇发酵、酵母生产以及减少来自那些工艺的废 物量。实施方案涉及，例如，降低被再循环到发酵工艺的水中的有机酸(醋酸和乳酸)和甘 油的加载量(load)的方法。实施方案还涉及，例如，乙醇发酵副产物作为酵母生产原料的 用途。还提供了使酵母发酵和制备酵母接种物的方法。2.现有技术的背景

图1阐述了在乙醇发酵厂管理引入的培养基(media)、接种物、产物和副产物流的 典型工艺。在厌氧发酵罐10中，通过酵母(通常为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) 的菌株)在培养基中的厌氧发酵来制备乙醇，所述培养基包含作为主要碳源的右旋糖(或 者C5或更大的其它糖或多糖)。在发酵之前，酵母可通过接种菌株进行繁殖，其中接种物在 一连串增大体积的通气发酵罐中培养。那些发酵罐的组成为来自不同的可能来源的水，以 及玉米醪和酶。在乙醇发酵完成之后，将液体流供给到蒸馏釜30中，在蒸馏釜30中将乙醇与所述 流分离。然后，将来自发酵的生物质和其它颗粒物质在分离器20中通过重力、离心或过滤 与发酵液分离。将包含生物质的干燥的、分离的固体浓缩，最终干燥，并且通常称为干酒糟 (distillers dried grain，DDG)。DDG通常作为动物饲料或动物饲料组分出售。来自发酵培养基的水相溶液的剩余物通常被称为“回流(backset)”。回流中的主 要碳化合物为稀释的有机酸和甘油(“0AG”)。将回流的一部分(通常约35% )回收并返 回到最初的厌氧发酵罐10中，以补充在发酵期间必须被使用的水(或淡水或工艺用水)的 量。在厌氧发酵期间有机酸和甘油不能由酵母用作碳源；这些化合物实际上通过酵母和污 染性生物体(contaminating organism)由右旋糖形成。将回流连续再循环到厌氧发酵罐 10中可导致会抑制乙醇生产的有机酸和甘油的积聚。因此，在连续工艺中，如在图1中“其 它处理步骤”中所显示，大多数的回流被导向到废水或蒸发系统中。在“其它处理步骤”中，蒸发系统从回流回收水的一部分，这些水与最初的回流和 其它水源组合以被送到厌氧发酵罐中。因此，水相的剩余物为0AG的浓缩溶液，该浓缩溶液 可以，例如通过与DDG混合并干燥从而用作动物饲料。0AG还可能需要作为废物来进行处 理。通常，0AG为“负值”产物，其不会增加发酵的财政收益(financial yield)。
发明简述有机酸和甘油为酵母厌氧发酵生产乙醇期间形成的两种副产物。我已发现，厌氧 发酵的这些副产物是在需氧发酵中的酵母的有用底物。这具有许多有益效果。例如，允许 将有机酸和甘油中所包含的碳用作酵母的需氧培养的碳源。该需氧培养的酵母又可用作厌 氧发酵的接种物。本发明的实施方案提供，例如，使酵母基于右旋糖或其它糖的乙醇发酵期间所生 产的0AG再循环的方法。一个实施方案提供通过分批发酵制备乙醇的方法，所述方法包括 在第一培养条件(first growth condition)下在第一培养基中培养产乙醇微生物，所述第 一培养基包含碳源。该碳源包括至少一种有机酸(例如，醋酸、乳酸或者两者)和甘油，它 们作为在第二培养基中培养微生物以通过发酵来生产乙醇的副产物而获得。所述第二培养 基包含碳源，诸如具有至少5个碳原子的糖或糖类；微生物在第二培养基中进行培养，生产 乙醇和所述副产物。在一个典型的实施方案中，产乙醇微生物为酿酒酵母；并且第一培养基 碳源基本上由水、微量营养素以及作为碳源的醋酸、乳酸和甘油组成，并且所述第二培养基 基本上由水、营养素以及作为碳源的右旋糖组成。在另一个实施方案中，第一培养基包括作 为碳源的醋酸、乳酸和甘油，并且第二培养基包括作为碳源的右旋糖。本领域技术人员会认识到，本发明的培养基将包括对微生物培养而言必需的其它 营养素。微生物的繁殖培养基，除包含至少一种碳源之外，通常包含至少一种氮源。典型的 氮源为，例如，氨、铵盐、氨基酸、硝酸盐或亚硝酸盐。除氮之外，通常包括其它矿物质。这些 包括，例如，钾、镁、钠、硫和磷，其通常以在0.05g/L到2g/L之间的浓度被包括。其它痕量 元素以毫克/升的浓度水平而被包括，例如，在lmg/L和5mg/L之间。那些元素可包括，例 如，铁的(ferric)和/或亚铁的(ferrous)形式的铁、钼、钴、钙、锌、锰、碘、铜和硼。痕量 元素通常以它们的离子形式存在于培养基中。可存在于培养基中的其它营养素包括维生素，所述维生素包括复合维生素B维生 素。核酸前体也可在培养基中存在和利用。在如本文所报告使用的生产培养基的生产培养 基中，必需组分通常以过量于需要量的形式而存在。还有可能的是，在一些应用中可能要求 增补那些组分中的一些。一个进一步的实施方案包括通过发酵制备乙醇的方法，所述方法包括在需氧条 件下在第一培养基中培养产乙醇微生物以形成接种肉汤，所述第一培养基包括含有有机酸 和/或甘油的碳源。将接种肉汤与第二培养基混合，所述第二培养基包括含有具有至少5 个碳原子的糖和/或多糖的碳源。在厌氧条件下培养微生物以生产乙醇和副产物，所述副 产物包含由有机酸和甘油组成的组的至少一种成分。所述副产物的来源还可以是通常存在 于乙醇发酵中的污染性生物体。在一个典型的实施方案中，微生物为酿酒酵母，所述第一培养基基本上由营养素 和作为碳源的乳酸、醋酸、甘油以及水组成；并且所述第二培养基基本上由营养素和作为碳 源的右旋糖以及水组成。在一个进一步的实施方案中，第一培养基包含作为碳源的乳酸、醋 酸和甘油；并且第二培养基包含作为碳源的右旋糖。在一些实施方案中，培养所需的其它营 养素以适量存在于包含0AG的被再循环的液体部分中。在一些实施方案中，可能需要增补 氮以培养，并且在一个进一步的实施方案中，在被再循环的水流中不存在适量的氮和其它 营养素，也可能需要增补一些营养素。
一个还进一步的实施方案包括一种通过发酵制备主产物(primaryproduct)的方 法，所述方法包括在第一发酵条件下在第一培养基中，以连续培养方式培养微生物，生产 在第二条件下发酵所需的接种物，所述第一培养基包含相同微生物培养物在第二条件下发 酵的副产物，所述第二条件被选择为生产所述主产物；在第二发酵条件下在第二培养基中 培养微生物培养物以生产主产物和包含来自步骤1的主要营养素源的副产物；将包含主要 营养素源的副产物与主产物和第二培养基分离以获得副产物流；以及提供副产物流来以连 续培养方式需氧培养微生物。在一个进一步的实施方案中，本文所描述的方法包括在第一培养基中培养微生 物之前浓缩副产物流的进一步的步骤。较大浓度的副产物流产生了较高的所得到的生物 质。本发明的实施方案的发酵条件可以是需氧的。如果将OAG用作底物，发酵将是需氧的。在第一培养基中培养的培养物可作为分批培养物和作为连续培养物进行繁殖。当 以连续方式培养培养物时，这提供了利用远远小于当前所使用的生产用于第二阶段的接种 物的发酵罐体积的能力。这提供了对发酵罐和辅助系统的更好利用。相比于工业中当前所 达到的而言，应用连续发酵还能够更多地应用培养接种物的发酵罐。利用率高达先前工艺 的利用率的16倍。接种物繁殖的当前方法取决于两种工艺酶催化分解淀粉或其它碳源以生产可被 培养物利用的糖，以及培养物的培养依赖于淀粉降解的速率。本文所提供的方法具有以易 于量化的量的易于得到的底物。接种物的再现性和一致性倾向为优于现有技术方法的再现 性和一致性。在已经应用本文教导的一些或全部进行的实验中，对于所消耗的每一 lg/L的OAG 而言，获得了至少约ι χ IO8酵母细胞/ml培养基的酵母产率。获得了 1. 5 X IO9细胞/ml的 酵母浓度和3X 108g/L/hr至4X 108g/L/hr的连续培养的生长速率(growth rate)。通常，使用酵母菌株来进行发酵，所述酵母菌株通常为酵母属的菌株，并且更通常 为酿酒酵母的菌株。微生物还可以是例如棒状杆菌(Corynebacterium)的菌株、葡萄球菌 (Staphylococcus)的菌株或李斯特菌(Listeria)的菌株。附图简述图1.图1说明了在乙醇发酵厂管理培养基和副产物流的典型工艺。图2.图2说明了由本教导提供的改进的一个实施方案。图3.图3说明了图1的典型工艺与本公开所提供的改进工艺的比较。典型工艺 步骤由虚线显示。图4.图4显示如实施例1中所报告的，根据一个实施方案的需氧分批酵母繁殖的结果。图5.图5显示在实施例2中报告的连续发酵的活细胞计数(以细胞数目测量并 通过光密度测量)。图6.图6显示实施例2中的连续发酵的进料添加和保留时间。图7.图7显示如实施例3中所报告的利用未浓缩的OAG进行的酵母培养的活细 胞计数。发明详述本教导根据各种示例实施方案描述了本发明的若干不同的特征和方面。然而，应当理解，本发明涵盖了许多的可选择的实施方案，其可通过以本领域普通技术人员会认 为有用的任何组合的方式组合本文所描述的不同的特征和方面中的任一个来完成。如本文所描述的处理方法和产物可提供超出现有技术的许多优点。当然，本发明 的范围通过权利要求来限定，并且实施方案是否落入该范围不应受限于所述方法是否提供 了这些优点中的一个或多个。本发明的至少一个实施方案的说明可通过参考附图来进行。图2说明了由本教导 提供的改进的一个实施方案。不是将被再循环的浓缩有机物的大部分导向废水和导向低级 的动物饲料(诸如DDG)，而是将浓缩的0AG( “cOAG”)用于向需氧发酵罐5A中的第二发酵 提供主要的碳源。在没有添加的右旋糖或其它糖的情况下，有机酸和甘油在需氧发酵期间 被酵母消耗了。加入到第一需氧发酵的OAG的浓度可随它们的来源而变化；例如，它们可随初始 设备(originating facility)而变化。氮源通常以少许量存在于被再循环的流中，但是如 果碳氮比太高就可能必须被加入到第一发酵中。发现其它营养素以适当量存在于被测试的 再循环流中，但是使用来自其它来源的流可能要求加入一种或多种营养素。含水量通常变化，如果期望具有高固体含量的再循环流，则小于80% ；或者如果期 望具有较低固体含量的再循环流，则为80%和99%之间。系统的固体容许量可取决于许多 因素，所述因素包括再循环流的来源以及在发酵罐中对渗透压的影响。OAG发酵为需氧的。OAG的利用率可受限于OAG发酵中的传氧速率。这可以是有 益的，例如，如果期望较慢的发酵，例如以便维持较低的水平的来自发酵的放热。在需氧发酵罐5A中制得的含酵母的生物质可以用作接种物，来进一步在厌氧发 酵罐10中引发厌氧发酵而生成乙醇。它还可以例如以DDG的形式直接用作较高质量的动 物饲料。不要求特定浓度的cOAG。通常，两者为成比例的，并且较低的cOAG浓度会导致较 低的酵母产量。在回流中的有机酸和甘油以及作为浓缩物的有机酸和甘油的典型组成提供 于表1。当然，那些数值可随发酵和浓缩的性质而变化。表 1
/L在典型的连续实践中，校正被供给到需氧发酵罐5A中的cOAG的量，使得基本上全 部有机酸和约25-75%的甘油被酵母消耗并被转化为生物质。就“基本上全部”而言，它表 示被供给到发酵罐中的大于95%的有机酸在分批发酵中被消耗。因为需氧发酵首先消耗有 机酸，所以校正发酵为消耗少于基本上全部的有机酸会大大地降低被消耗的甘油的量。在 一个优选实施方案中，基本上全部的有机酸和约15%至45%的甘油被消耗。
可调节OAG的消耗速率的一种方法是通过调节发酵的pH。在一个典型的发酵中， 通过加入氨或铵盐，将PH维持于4. 2至4. 8。在本发明的一个实施方案的发酵中，通过加入 碱，将PH维持在5.0和6. 5之间，通常为约5. 5。该碱可以是，例如，氨或氢氧化钠。通常使 用氨，这是因为它还能为酵母的培养提供氮源。随着有机酸被消耗，发酵罐中的肉汤的pH会上升。较高的pH水平是该现象的结 果。如果需要，用作氮源的铵盐会减轻该问题。随着氮被利用，PH会被降低。尽管生物质繁殖所需的其它添加剂可被包含于厌氧发酵中，但当 产生OAG流的厌 氧发酵是干磨(dry-grind)乙醇生产工艺的一部分时，通常不需要添加剂。当OAG流为湿 磨发酵的产物时，一些微量营养素的加入可以是有益的或甚至是必要的。从需氧发酵罐5A中提取接种物或DDG的速率可与cOAG的进料速率和形成生物质 的消耗速率实现平衡，使得实际上，在需氧发酵罐5A中的发酵培养基包含了稳态水平的甘 油和非常低水平的有机酸，同时连续生产生物质。如果添加成排的第二反应器，则可获得低 水平的甘油。在这样的反应器中，甘油将优选被用作单独的碳源。尽管本文呈现的实施例和说明将酵母用作能够利用需氧发酵和厌氧发酵的示例 性生物体，但是能够使用五碳和六碳底物作为养料(fuel)的其它兼性的生物体可受益于 本发明。本发明的实施方案基于不同养料对于不同种类的发酵的用途，提供了使用厌氧发 酵的含碳副产物作为需氧发酵的底物的方法。除酵母之外，可利用这些方法的生物体可 包括，例如兼性厌氧菌，诸如变形杆菌属(Proteus)、沙雷氏菌属(Serratia)、欧文氏弧菌 (Erwinia Vibrio)、气单胞菌属(Aeromonas)和发光菌属(Photobacterium)中的成员。本教导提供了超出现有技术工艺的若干优点。当然，这些优点不应当被解释为必 要条件或者限制，除非它们被明确地包含于权利要求中。第一，其降低必须被处理为含水废 物的OAG和其它组分的量。第二，其通过将乙醇发酵的另外的负值有机酸和甘油副产物转 化为较高值的DDG或更多酵母从而以基于非碳水化合物的接种物的形式进行进一步乙醇 生产，而从另外的负值有机酸和甘油副产物捕获(capture)价值。最后，其降低了将太多的 OAG回流加入于最初的第二发酵中而伴生的抑制作用，同时捕获和再使用系统中的水的一 些。在图3中，将本发明的实施方案与现有技术工艺进行比较。通常，引向接种菌株的被再 循环的水的部分小于引向第二发酵的部分。实施例1实施例1报告了利用有机酸和甘油的酿酒酵母的分批发酵罐培养，所述有机酸和 甘油是作为来自干磨乙醇生产设备的回流的蒸发的副产物而获得。在两个3. 5L发酵罐中 进行了分批酵母繁殖。将OAG浓缩为最初的OAG浓度的5至10倍之间。使用氢氧化钠将培养物的pH调节为4. 4。还以铵盐的形式将氮加入到混合物中， 直到氮的浓度(以氨计)为2. 5g/L。接种比率为ν/ν。结果示于图4中。有机酸为酵母的优选的代谢产物。对甘油的优选为次要的。有 机酸耗尽通过溶解氧浓度的显著增加来指示，所述溶解氧浓度未显示于图中。培养物在24小时内达到约9Χ108细胞/ml并且在该时间期间使用15_17g/L的碳 源。乳酸和醋酸被消除至检测阈值之下，并且约40%的甘油主要在有机酸被耗尽时和运行 终点之间被利用了。初始的培养物培养可通过将氨同时用作氮源和用于PH调节来增强。实施例2
实施例2报告了利用有机酸和甘油的酿酒酵母的培养，所述有机酸和甘油是作为 来自干磨乙醇生产设备的回流的蒸发的副产物而获得。发酵在初始作为分批工艺而进行， 然后在达到了被认为是充足的超过5X108的酵母量(yeast mass)之后被移至连续发酵罐。在被移至连续发酵模式之后，发酵以5至6小时的保留时间快速地达到了稳态条 件。如图5所示，如通过光密度(在660nm的0D)或者通过活酵母细胞计数表示的培养物密 度在连续的进料/滴落相(drop phase)的持续时间里保持了稳定，这维持了 90小时。在 这期间产生了约16发酵罐体积。在连续相期间的平均酵母浓度为1. 2X IO9细胞/ml。
图6显示本实施例中所描述的发酵的一致性。保留时间上的较小变化主要地是运 行的发酵罐体积的不同评估的结果。如同实施例1，在该实施例中的酵母繁殖要求碳源和添 加的氮源。也希望将PH调节为最佳的培养水平(约4. 0至5. 5)。实施例3实施例3显示根据本发明的另一个实施方案利用有机酸的酵母培养。条件与实施 例2相同，但是有机酸未被浓缩。本实施例的结果显示于图7。培养受到低的底物浓度限 制，如当相比于实施例2的结果时低的光密度和酵母浓度所指示的。本文所引用的或者所提及的专利、专利申请、出版物、科技论文、书籍以及其它文 献和材料，从每个出版物成文的日期起，表示了本发明所属技术领域技术人员的技术水平， 并且全部通过参考并入，如同完全重写于本文中。在本说明书中包含文献并不是承认所述 文献因为任何目的而代表了先前的发明或者为现有技术。本文所采用的术语和表达用作说明性术语而非限制性术语，并且不企图将该术语 和表达、或者其任何部分用于排除任何已知的或后来发展的同等物，无论这样的同等物是 否在本文中被阐述或者被显示或者被描述，也无论这样的同等物是否被视为可预测的；但 是应当认识到，各种的修改落入所要求保护的本发明的范围，不论那些发布的权利要求是 否以任何理由进行或没有进行过变更或者修正。因此，应该理解，尽管已通过优选实施方案 和任选的特征具体公开了本发明，但本领域技术人员可采用其中具体化的或者本文所公开 的本发明的修改和变化，并且这样的修改和变化被认为是落入本文所公开的和所要求保护 的本发明的范围。本文所描述的具体方法和组合物代表了优选实施方案，并且是示例性的而不预期 用于限制本发明的范围。本领域技术人员在考虑本说明书之后可以明白其它对象、方面和 实施方案，并且这些其它对象、方面和实施方案被包含在权利要求的范围界定的本发明的 精神内。在给出的实施例中，所述说明应该解释为包括但不仅限于那些实施例。本领域技术人员可以容易地明显看出，可对本文公开的发明进行变化的替换和修 改，而不脱离本发明的范围和精神，并且不脱离本发明的说明，所述说明包括那些本文例证 性地阐述的说明，很明显，各种的修饰和同等物可用于实现本发明的思想而不脱离其范围。 本领域普通技术人员将会认识到，可在形式上和在具体上做出变化而不脱离本发明的精神 和范围。所描述的实施方案应在所有方面被考虑为例证性的而非限制性的。因此，例如，其 它的实施方案落入本发明的范围并且落入下面的权利要求。
权利要求
一种通过发酵制备乙醇的方法，所述方法包括(a)在第一培养条件下在第一培养基中培养产乙醇微生物，所述第一培养基包括含有选自由有机酸和甘油组成的组的至少一种成分的碳源，所述有机酸和甘油作为在第二培养基中培养所述微生物以通过发酵来生产乙醇的副产物而获得，所述第二培养基包括含有由具有至少5个碳原子的糖或多糖组成的组的至少一种成分的碳源；以及(b)在所述第二培养基中培养所述微生物，产生乙醇和所述副产物。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述产乙醇微生物为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，所述第一培养基基本上由水、醋酸、乳酸和甘油组成，并且所述第二培养基基 本上由水和右旋糖组成。
3.—种通过发酵制备乙醇的方法，所述方法包括(a)在需氧条件下在第一培养基中培养产乙醇微生物以形成接种肉汤，所述第一培养 基包括含有由有机酸和甘油组成的组的至少一种成分的碳源；(b)将所述接种肉汤与第二培养基混合，所述第二培养基包括含有由具有至少5个碳 原子的糖和多糖组成的组的至少一种成分的碳源；以及(c)在厌氧条件下培养所述微生物以生产乙醇和副产物，所述副产物包含由有机酸和 甘油组成的组的至少一种成分。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述微生物为酿酒酵母，所述第一培养基基本上 由乳酸、醋酸、甘油和水组成，并且所述第二培养基基本上由水和右旋糖组成。
5.一种通过发酵制备主产物的方法，所述方法包括(a)在第一发酵条件下在第一培养基中培养生产所述主产物的微生物培养物，所述第 一培养基包含相同微生物培养物在第二条件下发酵的副产物，所述第二条件被选择为生产 所述主产物；(b)在第二发酵条件下在第二培养基中培养所述微生物培养物以生产所述主产物和包 含来自步骤(a)的主要营养素源的副产物；(c)将包含所述主要营养素源的副产物与所述主产物和所述第二培养基分离以获得副 产物流；以及(d)提供所述副产物流，以根据步骤(a)培养所述微生物培养物。
6.根据权利要求5所述的方法，所述方法包括如下步骤在所述第一培养基中培养所 述微生物培养物之前，浓缩所述副产物流。
7.根据权利要求5所述的方法，其中所述第一发酵条件是需氧的，并且所述第二发酵 条件为厌氧的。
8.根据权利要求5所述的方法，其中所述第一培养基基本上由乳酸、醋酸、水和甘油组成。
9.根据权利要求5所述的方法，其中所述第二培养基基本上由水和右旋糖组成。
10.根据权利要求5所述的方法，其中所述主产物为乙醇，并且所述微生物培养物为酵 母培养物。
11.根据权利要求6所述的方法，其中所述第一发酵条件为需氧的，所述第二发酵条件 为厌氧的，所述第一培养基基本上由乳酸、醋酸、水和甘油组成，所述第二培养基基本上由 水和右旋糖组成，所述主产物为乙醇，并且所述微生物培养物为酿酒酵母培养物。
12.根据权利要求5所述的方法，其中所述微生物培养物选自由酿酒酵母培养物、 棒状杆菌(Corynebacterium)培养物、葡萄球菌(Staphylococcus)培养物和李斯特菌 (Listeria)培养物组成的组。
13.根据权利要求5所述的方法，其中所述微生物培养物为酿酒酵母培养物。
14.根据权利要求2所述的方法，所述方法包括在连续发酵罐中进行步骤(a)的培养 步骤，其中所述酵母浓度为至少1. 5X109细胞/ml，并且生长速率为至少3X 108g/L/hr。
15.根据权利要求1所述的方法，其中所述发酵选自由连续发酵和分批发酵组成的组。
全文摘要
本发明的实施方案涉及，例如，降低被再循环到发酵工艺的水中的有机酸和甘油的加载量的方法。在乙醇发酵期间生产的有机酸和甘油用作酵母繁殖的碳水化合物的替代物。酵母可作为进料产物来出售或者应用于后续的发酵。
文档编号C12P7/06GK101842491SQ200880114348
公开日2010年9月22日 申请日期2008年10月31日 优先权日2007年11月2日
发明者加迪·斯泰纳 申请人:阿彻-丹尼尔斯-米德兰德公司