甜高粱茎秆汁液制取乙醇及酵母超氧化物歧化酶的方法

专利名称：甜高粱茎秆汁液制取乙醇及酵母超氧化物歧化酶的方法
技术领域：
本发明涉及的是一种化学工程技术领域的方法，具体的说，涉及的是一种甜 高粱茎秆汁液制取乙醇及酵母超氧化物歧化酶的方法。
背景技术：
甜高粱是一种具有较高生物产量的C4作物品种，每hm2甜高粱一般能产出 2250 7500kg粮食和55 75t富含糖分(15° 20° Brix)的茎秆。其茎秆糖 分含量15° 20° Brix，出汁率在55%以上，适合于采用液态发酵技术转化为乙 醇用于液体燃料，在制取燃料乙醇方面具有广阔的前景，被誉为21世纪的"绿 色能源"。有关研究者曾以发酵乙醇产率为主要目标，对甜高粱茎秆汁液添加氮 源、营养盐和发酵液初始糖浓度、接种量、温度、摇床(搅拌)转数等乙醇发酵 条件进行了较深入的研究，得到了较理想的乙醇产率。但由于甜高粱茎秆发酵制 取乙醇的产品单一，用甜高粱茎秆制取乙醇的成本较高，其优势没有充分显现， 产业化进程较慢。
超氧化物歧化酶(简称SOD)是生物体防御氧化损伤的一种主要酶，存在于 动植物和好氧微生物体内。S0D作用于底物超氧阴离子(0—2)，将其分解成02和 H202， 11202再经过氧化物酶与过氧化氢酶的催化变成&0，从而解除30—2(超氧阴离 子)对生物体细胞的损伤，起到保护作用。经过提取、纯化的SOD产品已经广泛 应用在医药、化妆品、食品等领域。以往，SOD主要从动物血液、肝脏等组织中 提取，由于所用原料有限，S0D质量不稳定。20世纪80年代后，美国和日本先 后开发了酵母发酵法生产SOD的技术，大大地降低了SOD的生产成本。目前，对 酵母菌SOD的研究主要集中于提取纯化方法、高产菌株选育，以及S0D形成的生 理学研究等方面。用甜高粱茎秆汁液发酵制取乙醇的同时制取酵母菌S0D的研究 还未见报道。
经对现有技术的文献检索发现，沈阳药科大学2002年硕士学位论文公开了
名称为"酵母SOD高产菌株的选育及其酶学性质的研究"，该技术从9株酵母菌 中筛选出一株Yu酵母，经过培养基配方及主要发酵条件的优化，得到湿菌体S0D 的最高含量为1263U g—、每升发酵液可以得到30g湿菌体，则每升发酵液酵母 菌SOD的最高产量为4. 789X 104U。该技术仅可得到SOD —种产品，且产量较低。

发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种甜高粱茎秆汁液同时制 取乙醇及酵母超氧化物歧化酶(SOD)的方法，具有一次发酵可以得到乙醇和SOD 两种产品的特点，制备设备及工艺简单，易于实现与现有甜高粱茎秆汁液态发酵 制取乙醇技术的对接。可以使乙醇产率达到90.3% 97.03%，每升发酵液的酵母 超氧化物岐化酶(SOD)产量达到3.64X104U 6 . 95X 104U。大大降低甜高粱茎 秆发酵制取乙醇的生产成本。
本发明是通过以下技术方案实现的，包括以下步骤
① 原、辅料准备将甜高粱茎秆汁液和发酵辅料原液灭菌、冷却备用。 所述的甜高粱茎秆汁液总糖含量为12% 18%。
所述的发酵辅料分别为(NH)2S04、 K2HP04、 MgS04*7H20、 Zn(CH3C00)2 2H20、 CuS04 5H20的水溶液。
所述的灭菌、冷却，是指于121°C， 0. IMPa高压灭菌15min，再冷却至40°C 以下。
② 发酵菌种准备取酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae CICC 1308)菌
种逐级扩增培养至每毫升细胞数达到1.0X1(T个以上。
酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae CICC 1308)可以直接购买获得，购买
渠道中国工业微生物菌种保藏管理中心，编号CICC 1308，商品名称酿酒
酵母，属名Saccharomyces,禾中名cerevisiae。
③ 乙醇发酵在无菌条件下，将甜高粱茎秆汁和发酵辅料混合，接入如②所 述的发酵菌种，进行乙醇发酵。
所述的发酵辅料在发酵液中的使用剂量分别为
(NH) 2S04 20-25g L—1 ;
K2HP04 2. 0-2. 5 g L—1 ;
MgS04'7H20 0. 5-0. 65g L—1 ;
Zn (CH3C00) 2 2H20 5 . 0-6. 5mg L—1 ; CuS04 5H20 12-15mg L—、
所述的发酵菌种接种量为发酵液体积的10% 15% (v/v)。 所述甜高粱茎秆汁和发酵辅料混合后，用6mol L"HC1无菌溶液调整pH值 至4. 0 5. 0。
所述的乙醇发酵温度为30 35°C，且伴有搅拌，搅拌速率为110 150r min—、
④ 乙醇蒸馏及菌体收集乙醇发酵结束后，将发酵液冷冻离心，取上清液进 行乙醇蒸馏，收集沉淀菌体，再水洗并离心收集菌体备用。
所述的发酵液冷冻离心，是指将发酵液于5 7°C， 3000 5000 r min—1 离心15min。
所述的水洗菌体、离心收集菌体，是指用无菌水洗菌体1 2次， 3000r min—'常温离心10 min收集菌体。
⑤ 菌体活化及超氧化物歧化酶提取加入菌体活化液，在水浴中振荡活化后， 破坏酵母菌细胞壁，湿酵母加入磷酸盐缓冲液，置于水浴中振荡提取，用离心或 抽滤法收集上清液，即为酵母超氧化物歧化酶提取液。
所述在水浴中振荡活化，是指在3(TC水浴中120r .min—'振荡活化30 60min;
所述的磷酸盐缓冲液，其添加量为每lg湿酵母加入15mL; 所述置于水浴中振荡提取，是指置于30'C水浴中120r ，min—i条件下振荡 提取5h。
本发明的原理是，酵母菌利用甜高粱茎秆中的糖分进行自身繁殖，产生大量 菌体细胞，在缺氧条件下，菌体细胞代谢产生乙醇和C02，酵母细胞为维持正常 的代谢活动，会通过合成包括超氧化物歧化酶(SOD)在内的细胞保护性物质， 对外界刺激或逆境环境产生应激反应，以提高其自身的适应能力。在一定范围内， 酵母细胞受到的胁迫刺激增大，产生的SOD量亦随之增高。本发明根据这一原理， 以提高乙醇和酵母SOD产率为目标，选择适当的菌种，调整优化发酵液的营养环
境和发酵工艺条件，使乙醇产率和酵母SOD产率均达到较高水平。
本发明在现有技术基础上，通过乙醇发酵菌种筛选、营养盐种类及添加剂量 选择和优化发酵工艺参数的方法，在保证较高乙醇产率的同时，使酵母菌体中 SOD的含量也达到较高水平。酵母SOD作为具有高附加值的乙醇发酵副产品可以 显著降低甜高粱茎秆汁液制取乙醇的成本。
本发明适用于以甜高粱茎秆汁液为原料，以市售的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiaeCICC 1308)为发酵菌种进行乙醇发酵，同时制取乙醇和酵母菌SOD两 种产品，发酵结束时乙醇产率可以达到90. 3% 97. 03%，每升发酵液酵母菌SOD 产量可达到3. 64X 104U 6. 95X 104U。
具体实施例方式
下面对本发明的实施例作详细说明。本实施例在以本发明技术方案为前提下 进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限 于下述的实施例。
本发明以下实施例中采用的各种培养以及培养基均采用常用操作
所述的酿酒酵母逐级扩增培养，是指用常规操作方法由斜面试管菌种逐级扩
大培养成发酵种子。具体方法是在无菌操作条件下，取一环斜面试管菌种接种
于新鲜固体斜面培养基上，3(TC培养12 h后，取1 2环接种于lOOmL液体种子 培养基，28°C， 120 r min—1摇床培养12-18 h，取5mL转接于500mL液体种子 培养基中培养12 18h，当细胞数达到1. OX 108以上时即可用于乙醇发酵。
所述的液体种子培养基和固体斜面培养基为酵母菌培养常用配方，具体组分 见表l。
表1液体种子培养基和固体斜面培养基组分
培养基成分 液体斜面培养基 固体种子培养基 葡萄糖或蔗糖(g)5.0 5.0 酵母膏(g) 0.5 0.5 蛋白胨(g) 0.5 0.5 K2HP04 (g) 0. 1 0. 1
MgS04 7H20 (g) 0. 1 0. 1
明胶 无菌水(mL)
0
100
2. 0
100
所述的菌体活化液组分与液体种子培养基组分相同，添加量为湿菌体重量的 腦(w/w)。
所述的磷酸盐缓冲液，是指按常规方法配制的pH值为7.8并含有 0. lramol L—1乙二胺四乙基酸二钠(EDTA-2Na)的水溶液，其添加量为每lg 湿酵母加入15mL。
实施例1
量取灭菌后的甜高粱茎秆汁(总糖含量为12%),在无菌条件下添加(NH)2S04 20g L—1 ， K2HP042. 0g L—1 ， MgS(V7H20 0. 5g L—1 ， Zn(CH3C00)2 2H20 5. Omg L—1 ， CuS04 5H20 12mg L—';用6mol L—'HC1无菌溶液调整pH值为 4.0;按发酵液总体积的10% (v/v)接入酵母菌种——酿酒酵母。在3(TC， 110 r .mirf'的搅拌速率下发酵。乙醇发酵结束后，将发酵液于5°C， 5000 r min—1 离心15min，取上清液用于蒸馏提取乙醇。沉淀菌体用无菌水洗1次，3000 r .min—i常温离心收集菌体。按湿菌体重量的10% (w/w)加入菌体活化液，在 30'C水浴中120r *min—'振荡活化60min后，用常规方法破坏酵母菌细胞壁，按 每lg湿酵母加入15mLpH7.8的磷酸盐缓冲液(含0. lmmol L—1 EDTA-2Na)，置30。C 水浴中振荡(120r*min—。提取5h，用离心法收集上清液，即为酵母SOD提取 液。乙醇产率为97.03%，酵母SOD产量为6.417X104U L—'发酵液。
实施例2
量取灭菌后的甜高粱茎秆汁(总糖含量为12%)，在无菌条件下添加(NH)2S(X 25g L—1 ， K2HP042. 5g L—1 ， MgS04'7H20 0. 65g L—1 ， Zn(CH3COO)2 2H20 5. 7mg L—1 ， CuS04 5H20 12mg L—N用6mol L—力C1无菌溶液调整pH值为 4.0;按发酵液总体积的10% (v/v)接入酵母菌种——酿酒酵母。在3(TC， 130 r'mir^的搅拌速率下发酵。发酵结束后，将发酵液于7'C， 3000 r min—1离心 15min，取上清液进行酒精蒸馏。用无菌水洗菌体2次，3000 r min—'常温离心 收集菌体。按湿菌体重量的10% (w/w)加入菌体活化液，在30'C水浴中
120r'mirf'振荡活化30min后，用常规方法破坏酵母菌细胞壁，按每lg湿酵母 加入15mLpH7. 8的磷酸盐缓冲液(含0. l國l L—1 EDTA-2Na)，置3(TC水浴中振 荡(120r*min—')提取5h，用离心法收集上清液，即为酵母SOD提取液。乙醇 产率为91.59%，酵母SOD产量为6. 95X104U L—'发酵液。 实施例3
量取灭菌后的甜高粱茎秆汁(总糖含量为15%)，在无菌条件下添加(NH)2S(X 22. 5g L—1 ， K2HP042. 0g L—1 ， MgS04*7H20 0 . 6g L—1 ， Zn(CH3C00)2 2H20
5. Omg L—1 ， CuS04 5H20 15mg L—、用6mol L—力C1无菌溶液调整pH值为 5.0;按发酵液总体积的15% (v/v)接入酵母菌种——酿酒酵母。在35。C， 150 r'min—'的搅拌速率下发酵。发酵结束后，将发酵液于5°C， 5000 r min—'离心 15min，取上清液进行酒精蒸馏。用无菌水洗菌体2次，3000 r min—1常温离心 收集菌体。按湿菌体重量的10% U/w)加入菌体活化液，在3(TC水浴中 120r min'振荡活化60min后，用常规方法破坏酵母菌细胞壁，按每lg湿酵母 加入15mLpH7. 8的磷酸盐缓冲液(含0. 1,1 L-1 EDTA-2Na)，置30。C水浴中振 荡(120r*rain—。提取5h，用抽滤法收集滤液，即为酵母SOD提取液。乙醇产 率为94. 33%,酵母SOD产量为5 . 92X104U L—'发酵液。
实施例4
量取灭菌后的甜高粱茎秆汁(总糖含量为18%)，在无菌条件下添加(NH)2S04 25g 「1 ， K2HP042. 5g L—1 ， MgS04*7H20 0 . 65g L—1 ， Zn(CH3C00)2 2H20
6. 5mg L-1 ， CuS04 5H20 15mg L1;用6mol L—'HC1无菌溶液调整pH值为 4.5;按发酵液总体积的15% (v/v)接入酵母菌种——酿酒酵母。在32.5'C， 150 r'min'的搅拌速率下发酵。发酵结束后，将发酵液于5°C， 5000 r min—1 离心15min，取上清液进行酒精蒸馏。用无菌水洗菌体2次，3000 r min—1常温 离心收集菌体。按湿菌体重量的10% (w/w)加入菌体活化液，在30'C水浴中 120i"*min—'振荡活化45min后，用常规方法破坏酵母菌细胞壁，按每lg湿酵母 加入15mLpH7. 8的磷酸盐缓冲液(含0. l腿ol L-1 EDTA-2Na)，置30。C水浴中振 荡(120r.min1)提取5h，用离心法收集酵母菌SOD提取液。乙醇产率为90. 3 %，酵母SOD产量为6. 92 X104U L—'发酵液。
实施例5
量取灭菌后的甜高粱茎秆汁(总糖含量为15%)，在无菌条件下添加(NH)2S04 22. 5g'L—1 ， K2HP042. 25g L—1 ， MgS04'7H20 0 . 575g L—1 ， Zn(CH3C00)2 2H20 5. 75mg L-1 ， CuS04 5H20 13. 5mg L-、用6mol L—'HC1无菌溶液调整pH值 为4. 5;按发酵液总体积的12. 5% (v/v)接入酵母菌种——酿酒酵母。在35°C， 150 r min 1的搅拌速率下发酵。发酵结束后，将发酵液于5°C， 4000 r min—1 离心15min，取上清液进行酒精蒸馏。用无菌水洗菌体l次，3000 r min—'常温 离心收集菌体。按湿菌体重量的10% (w/w)加入菌体活化液，在3CTC水浴中 120r min—'振荡活化60min后，用常规方法破坏酵母菌细胞壁，按每lg湿酵母 加入15mLpH7. 8的磷酸盐缓冲液(含0. 1,1 L-1 EDTA-2Na)，置30。C水浴中振 荡(120r min—1)提取5h，用离心法收集酵母菌SOD提取液。乙醇产率为93. 40 %，酵母SOD产量为3.92X10U L—'发酵液。
实施例6
量取灭菌后的甜高粱茎秆汁(总糖含量为18%)，在无菌条件下添加(NH)2S04 20g L—1 ， K2HP042 . 5g L—1 ， MgS04*7H20 0. 5g L—1 ， Zn(CH3COO)2 2H20 5. 75mg. L—1 ， CuS04.5H20 12mg L-';用6mol L—'HC1无菌溶液调整pH值为 4.5;按发酵液总体积的15% (v/v)接入酵母菌种——酿酒酵母。在30。C， 130 r'mirf'的搅拌速率下发酵。发酵结束后，将发酵液于6°C， 4000 r min—1离心 15min，取上清液进行酒精蒸馏。用无菌水洗菌体2次，3000 r mir^常温离心 收集菌体。按湿菌体重量的10% (w/V)加入菌体活化液，在30。C水浴中 120r .min—'振荡活化50min后，用常规方法破坏酵母菌细胞壁，按每lg湿酵母 加入15mLpH7. 8的磷酸盐缓冲液(含0. 1,1 L-1 EDTA-2Na)，置30。C水浴中振 荡(120r'mirT1)提取5h，用离心法收集酵母菌SOD提取液。乙醇产率为91. 12 %，酵母SOD产量为3. 64X104U L—1发酵液。
实施例7
量取灭菌后的甜高粱茎秆汁(总糖含量为12.2%)，在无菌条件下添加 (NH)2S0424. 8g'L—1，K2HP042. 25g L—1，MgS04'7H200. 56g L—1 ， Zn(CH3C00)2 2H20 5. 8mg L—1 ， CuS04 5H20 13. 5mgL—、用6mol L—'HC1无 菌溶液调整pH值为4. 5;按发酵液总体积的13. 1% (v/v)接入酵母菌种——酿 酒酵母。在32.5匸，130r^mi一的搅拌速率下发酵。发酵结束后，将发酵液于 6°C， 5000r "min—'离心15min，取上清液进行酒精蒸馏。用无菌水洗菌体2次， 3000 r min—'常温离心收集菌体。按湿菌体重量的10% (w/w)加入菌体活化液， 在3(TC水浴中120r mi一振荡活化60min后，用常规方法破坏酵母菌细胞壁， 按每lg湿酵母加入15mLpH7. 8的磷酸盐缓冲液(含0. lmmol L—1 EDTA-2Na)，置 30'C水浴中振荡(120r.min—')提取5h，用离心法收集酵母菌SOD提取液。乙 醇产率为90.6%，酵母SOD产量为6.91X104U L—'发酵液。
权利要求
1、一种甜高粱茎秆汁液制取乙醇及酵母超氧化物歧化酶的方法，其特征在于，包括以下步骤①将甜高粱茎秆汁液和发酵辅料原液，灭菌、冷却备用；②取酿酒酵母逐级扩增培养至每毫升细胞数达到1.0×108个以上；③在无菌条件下，将甜高粱茎秆汁和发酵辅料混合，接入如②所述的酿酒酵母，进行乙醇发酵；④乙醇发酵结束后，将发酵液冷冻离心，取上清液进行乙醇蒸馏，收集沉淀菌体，再水洗并离心收集菌体备用；⑤加入菌体活化液，在水浴中振荡活化后，破坏酵母菌细胞壁，湿酵母加入磷酸盐缓冲液，置于水浴中振荡提取，用离心或抽滤法收集上清液，即为酵母超氧化物歧化酶提取液。
2、 根据权利要求1所述的甜高粱茎秆汁液制取乙醇及酵母超氧化物歧化酶 的方法，其特征是，所述的甜高粱茎秆汁液总糖含量为12% 18%。
3、 根据权利要求1所述的甜高粱茎秆汁液制取乙醇及酵母超氧化物歧化酶 的方法，其特征是，所述的发酵辅料分别为(NH)2S04、 K2HP04、 MgS04*7H20、 Zn(CH3COO)2 2H20、 CuS04 5H20水溶液。
4、 根据权利要求3所述的甜高粱茎秆汁液制取乙醇及酵母超氧化物歧化酶 的方法，其特征是，所述的发酵辅料在发酵液中的使用剂量分别为(NH) 2S04 20-25g L—1 ;K2HP04 2. 0-2. 5 g L—1 ;MgS04*7H20 0 . 5-0. 65g L—1 ;Zn(CH3C00) 2 2H20 5 . 0-6 . 5mg L—1 ; CuS04 5H20 12-15mg L—、
5、 根据权利要求1所述的甜高粱茎秆汁液制取乙醇及酵母超氧化物歧化酶 的方法，其特征是，所述的酿酒酵母接种量为发酵液体积的10% 15%。
6、 根据权利要求1所述的甜高粱茎秆汁液制取乙醇及酵母超氧化物歧化酶 的方法，其特征是，所述甜高粱茎秆汁和发酵辅料混合后，用6mol L—'HC1无菌溶液调整pH值为4.0 5.0。
7、 根据权利要求1所述的甜高粱茎秆汁液制取乙醇及酵母超氧化物歧化酶 的方法，其特征是，所述进行乙醇发酵，其发酵温度为30 35'C，且伴有搅拌， 搅拌速率为110 150r min—'。
8、 根据权利要求1所述的甜高梁茎秆汁液制取乙醇及酵母超氧化物歧化酶 的方法，其特征是，所述的发酵液冷冻离心，是指将发酵液于5 7'C， 3000 5000 r min—'离心15min;所述的水洗菌体、离心收集菌体，是指用无菌水洗菌体1 2次， 3000r min—'常温离心10 min收集菌体。
9、 根据权利要求1所述的甜高粱茎秆汁液制取乙醇及酵母超氧化物歧化酶的 方法，其特征是，所述的菌体活化液组成为，葡萄糖或蔗糖5.0g，酵母膏0.5g， 蛋白胨0.5g， K2HPO40.1g， MgSO4'7H2O0.1g，无菌水100mL;所述在水浴中振荡活化，是指在30。C水浴中120r *min—'振荡活化30 60min。
10、 根据权利要求1所述的甜高粱茎秆汁液制取乙醇及酵母超氧化物歧化酶 的方法，其特征是，所述的磷酸盐缓冲液，其添加量为每lg湿酵母加入15mL;所述的置于水浴中振荡提取，是指置于3(TC水浴中120r'min—'条件下振 荡提取5h。
全文摘要
一种甜高粱茎秆汁液制取乙醇及酵母超氧化物歧化酶的方法，属于生物质能源工程技术领域。步骤为①取甜高粱茎秆汁液原料和发酵辅料，灭菌、冷却备用；②取酿酒酵母逐级扩增培养至每毫升细胞数达到1.0×10⁸个以上；③将甜高粱茎秆汁和发酵辅料混合，接入酿酒酵母，进行乙醇发酵；④乙醇发酵结束后，将发酵液冷冻离心，取上清液用于蒸馏提取乙醇，菌体用于提取SOD；⑤将收集到的菌体活化后，破坏酵母菌细胞壁，用磷酸盐缓冲液保温提取，再进行固液分离，所得清液即为酵母SOD提取液。乙醇产率达到90.3％～97.03％，每升发酵液超氧化物岐化酶产量为3.64×10⁴U～6.95×10⁴U。
文档编号C12P7/10GK101168747SQ20071004768
公开日2008年4月30日 申请日期2007年11月1日 优先权日2007年11月1日
发明者刘荣厚, 梅晓岩 申请人:上海交通大学