专利名称：提高微生物发酵生产乙醇的方法
技术领域：
本发明针对改进用厌氧(或兼性)产乙酸菌，从含有至少一种还原性气体的气相底物生产乙醇的微生物发酵方法。
背景技术：
发明人公开了用某些厌氧菌，在含有合适的营养物和痕量矿物质的培养基中从气相底物的微生物发酵生产乙醇、其它有机酸、醇、氢和有机酸盐的方法。例如，发明人先前公开了将稀释的气体混合物引入含有一种或多种厌氧菌株的生物反应器，这些细菌通过直接途径利用废气成分产生所需的化合物。从独立容器或多个容器中用产生的化合物的合适回收方法，从水相中回收化合物。回收方法的例子包括提取、蒸馏或其组合物，或其它有效的回收方法。可从水相除去细菌，并再循环到生物反应器中，维持高细胞浓度，从而使产率最大化。如需要，通过离心、膜过滤或其它技术实现细胞分离。见例如国际专利申请号WO 98/00558，1998年1月8日出版；美国专利号5,807,722；美国专利号5,593,886和美国专利号5,821,111。
除了其主要产物乙酸以外，厌氧菌杨氏梭菌(Clostridium ljungdahlii)还能在转化一氧化碳(CO)、氢气(H2)和二氧化碳(CO2)中产生产物乙醇。下列总揽的化学计量的等式显示了从CO、CO2和H2生产乙酸(CH3COOH)和乙醇(C2H5OH)。
(1)(2)(3)(4)杨氏梭菌的几种示范性菌株包括菌株PETC(美国专利号5,173,429)；菌株ERI2(美国专利号5,593,886)和菌株C-01和0-52(美国专利号6,136,577)。这些菌株分别保藏在美国典型培养物保藏中心，10801 University Boulevard，Manassas，VA 20110-2209，登录号55383(先前是ATCC No.49587)、55380、55988和55989。杨氏梭菌的各菌株是厌氧性革兰氏阳性菌，具有约22mol％的鸟嘌呤和胸腺嘧啶(G+C)核苷酸含量。这些细菌使用各种底物以生长，但不使用甲醇或乳酸盐。这些菌株的CO耐受性、特异性气体吸收速率和单位生产率不同。在自然界发现的“野生”菌株中，注意到几乎没有乙醇产生。杨氏梭菌的菌株在37℃理想活动，通常产生的乙醇∶乙酰基(即指游离或分子中的乙酸和乙酸盐)生产比在野生状态是的1∶20(1份乙醇/20份乙酰基)。乙醇浓度通常仅为1-2g/L。虽然该产生乙醇的能力是感兴趣的，但是由于低乙醇产率“野生”细菌不能在商业规模上经济的生产乙醇。
使用小营养物操作，上述杨氏梭菌菌株被用于产生产率为1∶1(等份的乙醇和乙酰基)的乙醇∶乙酰基，但是乙醇浓度小于10g/L，水平导致低生产率低于10g/L·天。另外，培养稳定性是一个问题，主要是由于乙酰基(2.5-3g/L分子乙酸)在与乙醇联合存在中浓度相对高(8-10g/L)。另外，由于提高了气体速率，致力于产生更多乙醇，培养首先受到分子乙酸然后受到CO的抑制。结果，培养变得不稳定，不能吸收气体，并产生额外的产物。另外，发明人的早期研究显示了在稳态操作中产生2∶1以上的乙醇∶乙酰基的困难。见例如Klasson等，1990，AppliedBiochemistry and Biotechnology，Proceedings of the 11thSymposium onBiotechnology for Fuels and Chemicals，24/25857；Phillips等，1993，AppliedBiochemistry for Fuels and Chemicals，39/40559等。
许多文献描述了使用除了杨氏梭菌以外的厌氧菌，在不消耗CO、CO2和H2的糖发酵中产生溶剂。在提供乙醇的高产率的尝试中，许多参数已被改变，包括营养类型、微生物、还原剂的特定加入、pH改变和加入外源气体。见例如Rothstein等，1986，J.Bacteriol.，165(1)319-320；Lovitt等，1988，J.Bacteriol.，170(6)2809；Taherzadeh等，1996 Appl.Microbiol.Biotechnol.，46176。
在处理工业气体底物的领域中仍然需要从这些气体，尤其是废气，例如H2、CO和CO2提取有价值的商品的能力。需要增强乙醇相对于由在产乙酸菌发酵这些气体通常产生的其它产物的产量比。
发明简述为响应本领域的需要，本发明提供了连续、稳态的新颖方法，该方法产生高于10g/L的乙醇浓度，低于约8-10g/L的乙酸浓度，同时继续使培养物生长并维持良好的培养稳定性。
在一方面，本发明提供了一种从气相底物的厌氧菌发酵产生乙醇的稳定连续方法。该方法包括步骤在发酵生物反应器中的液体营养培养基中培养厌氧产乙酸菌，并对生物反应器提供含有至少一种选自CO和H2的还原性气体的气相底物。细菌在生物反应器中达到稳态，例如稳定的细胞浓度后，减低氧化还原电势，或提高发酵液中NAD(P)H对NAD(P)比例来操作生物反应器中的细菌。生物反应器中的游离乙酸浓度维持在低于5g/L游离酸。培养和操作步骤导致生物反应器中的细菌在发酵液中以高于每天10g/L的产率产生乙醇。在发酵液中产生的乙醇和乙酸的乙醇对乙酸比是1∶1-20∶1。
在该方法的一个实施例中，操作步骤包括下列步骤的一个或多个改变至少一个参数，选自营养培养基含量、营养物进料速率、水相进料速率、操作压力、操作pH、气相底物浓度、气相进料速率、发酵液搅拌速率、产物抑制步骤、细胞密度和底物抑制。
在本方法的另一个实施例中，操作步骤包括对所述生物反应器以吸收的所需速率提供所述气相底物(包括还原性气体CO)。该速率对于每分钟所述生物反应器中细菌干细胞每克0.3-2mmolCO是理想的。
在本方法的另一个实施例中，操作步骤包括在所述发酵生物反应器中加入所述营养培养基，含有限量的泛酸钙。泛酸钙在生物反应器中以0.5-50μg/g产生的细菌干细胞是理想的。
在另一方面，本发明提供了该方法的另一个实施例，包括在提供有限量的泛酸钙之前对所述生物反应器提供过量的H2还原性气体。
在另一个方面，本发明提供了一种方法，其中该方法的操作步骤包括在所述发酵生物反应器中加入含有限量的钴的所述营养培养基。理想的是，钴的量是每克所述生物反应器中产生的细菌干细胞为5-100μg钴。
在另一个实施例中，本发明的方法包括通过维持恒定的钴浓度并调节一个或多个参数，例如气体流速、液体流速、搅拌速率和H2气体分压，防止所述生物反应器中所述细菌对所述量的钴适应。
这些方法的其它可任选步骤包括将发酵液样品离心除去细胞，并进行气相色谱以监测比例和/或产率值的维持。
在另一个实施例中，该方法包括加入作为气相底物的一定量的H2，其量稍超过乙醇生产的化学计量。在另一个实施例中，气相底物还含有一定量的CO，其量稍超过细菌所需量，其中细菌对H2的摄取被抑制，发酵液中NAD(P)H对NAD(P)的比率增加。
在本方法的另一个实施例中，提供了一个步骤，其中当发酵液中的乙酸分子达到或超过2g/L时，通过提高水相进料速率减少了乙酸分子的抑制。
在本方法的另一个实施例中，操作步骤可以包括在生物反应器中以所选的搅拌速率搅拌培养基、细菌和气相底物。例如，搅拌速率的下降减少了传递到发酵液中的CO量。CO传递速率的下降导致H2转化增加，从而使还原性气体H2以超过细菌生长需要的量存在于生物反应器中。气体速率也可以类似降低，以减少传递的CO量，从而增加H2转化，使H2以超过细菌生长需要的量存在于生物反应器中。
在本方法的另一个实施例中，细菌培养物最初可在生物反应器中达到所需的细胞浓度，然后限制营养培养基中的泛酸钙或钴浓度。
在本发明的方法的另一个实施例中，使用二阶段CSTR(生物反应器)，它由加入发酵液的生长反应器和产生大部分乙醇的生产反应器组成。
在本发明的另一个方面，上述方法包括可任选的步骤通过从生物反应器除去发酵液回收乙醇；从了酵液蒸馏乙醇；和回收乙醇。另外或优选的，对肉汤的样品进行离心，以除去细胞；并用气相色谱监测比例的维持。
在另一个方面，本发明的方法可进一步使用额外的从乙醇产物将水回收到反应器中(含有达5g/L的酰基)，从而在反应器内的乙醇和乙酰基之间建立平衡的步骤。结果，更多的CO、CO2和H2被加入反应器并转化成乙醇生产的产物。
在下面的优选实施例详述中描述了本发明的其它方面和优点。
附图简述
图1是示意图，说明了本发明具有产物回收的连续发酵方法。气相底物1和液相营养培养基2被加入含有受试细菌培养物的生物反应器3。气相底物转化成乙醇和乙酸发生在生物反应器3中。从生物反应器3放出含有除了CO、O2和H2的废气4和未转化的CO、CO2和H2，作为燃料燃烧或点燃。随着细胞循环液体流出液5被送入细胞分离器6，其中分离细胞7和无细胞渗透液8。细胞7被送回生物反应器3，渗透液8被送到产物回收。可从渗透液8(或从流出液5，如果不使用细胞分离)中回收乙醇。在蒸馏柱9中分离渗透液8，以产生95％乙醇馏出物10和水11，后者循环回到生物反应器3。95％乙醇馏出物被送到分子筛12，其中从稀乙醇14中分离出无水乙醇13，稀乙醇14被送回到蒸馏柱9。
图2是二阶段连续搅拌反应器(CSTR)系统的示意图，用于改进培养稳定性。生长阶段CSTR1是加入液体培养基2。来自生产阶段的CSTR的未转化气体3被加入生长阶段CSTR1。生产阶段CSTR4是加入新鲜气体进料5和新鲜培养基进料6和来自生长阶段CSTR1的培养物进料7。细胞回收8是用于从进入生产阶段CSTR4的细胞9中产生最多的产物。细胞9不循环到生长阶段CSTR中。液体产物10由发酵液中的稀乙醇组成，它是作为最终蒸馏产物产生的，作为图1中的无水乙醇回收。
发明详述本发明涉及厌氧发酵含有至少一种还原性气体，特别是工业废气和合成气体(例如CO、CO2和H2)成分的气相底物，生产乙醇的方法。这些方法通过操作细菌的生物学途径，得到大于10g/L·天的乙醇产率。本发明的一个方法是使得NAD(P)H比NAD(P)丰富。NAD(P)对NAD(P)H的氧化导致培养物产生的乙酸还原成乙醇。另外，在本发明的厌氧发酵中产生高浓度乙醇的其它方法，涉及降低发酵液的氧化还原电势，从而将乙酸还原成乙醇。本发明的方法产生高乙醇浓度(即大于约10g/L，优选大于约15g/L)和低乙酸浓度(即在生物反应器中低于约5g/L游离乙酸)。这些方法还维持和控制连续乙醇和乙酸生产的方法条件，以帮助系统从方法干扰中迅速恢复。另外，本发明的方法帮助防止培养物适应低营养物浓度，它可能对培养物性能有害。本发明提供了一种乙醇生产的有价值的商业方法。
I.定义除非另外说明，本说明书中使用的下列术语定义如下本文所用的术语“连续方法”指一种发酵方法，它包括连续营养进料、底物进料、生物反应器中的细胞生产、从生物反应器中除去细胞(或消除)和产物移去。该连续进料、除去或细胞生产可在相同或不同的流路中发生。一种连续方法导致在生物反应器内实现稳态。“稳态”意味着所有这些可测量的变量(即进料速度、生物反应器中维持的底物和营养物浓度、生物反应器中的细胞浓度和从生物反应器除去细胞、从生物反应器中移去产物、和温度、压力等条件变量)不随时间改变。
本文所用的术语“气相底物”指单独的CO、CO和H2、CO2和H2或CO、CO2和H2，可任选的与其它元素或化合物，包括气态的氮气和甲烷。这些气相底物包括气体或气流，通常直接或通过燃烧释放或排到大气中。在本方法的一些实施例中气相底物含有CO。在本发明的其它实施例中，气相底物含有CO2和H2。在其它实施例中，气相底物含有CO和H2。在特定的优选实施例中，气相底物含有CO、CO2和H2。本发明的其它底物可含有上述提到的成分和氮气、CO2、乙烷和甲烷中的至少一种气体。因此，这些底物包括常规被称为“合成气体”或来自碳产品气化的合成的气体(包括甲烷)，和各种工业方法产生的废气。
术语“还原性气体”指CO和/或H2。词组“多于细菌生长所需的一定量的还原性气体”指超过细菌生长或代谢所用的量的还原性气体量，如果营养培养基成分确定的话。该量可通过增加还原性气体净含量，或减少关键的营养成分实现，从而实现气体过量而不增加气体，或通过提高气体传递给细菌的速率确定。当细菌接触比生长所需更多的还原性气体时，细菌通过增加乙醇的产生而响应。
“主要细菌”是产乙酸厌氧(或兼性)细菌，能将CO和水或H2和CO2转化成乙醇和乙酸产物。本发明的有用的细菌包括但不限于凯氏产醋菌(Acetogeniumkivui)、伍氏醋酸杆菌(Acetobacterium woodii)、潮湿厌氧醋菌(Acetoanaerobiumnoterae)、醋酸梭菌(Clostridium aceticum)、食甲基丁酸杆菌(Butyribacteriummethylotrophicum)、丙酮丁酸梭菌(C.acetobutylicum)、热醋酸梭菌(C.thermoaceticum)、粘液真杆菌(Eubacterium limosum)、杨氏梭菌PETC、杨氏梭菌ERI2、杨氏梭菌C-01、杨氏梭菌0-52和产生消化链球菌(Peptostreptococcusproductus。本领域技术人员可选择其它产乙酸厌氧菌用于这些方法。
术语“混合的菌株”指两种或多种主要细菌的混合培养物。本发明的方法中利用了本文阐述的该细菌的“混合菌株”。
术语“生物反应器”、“反应器”或“发酵生物反应器”包括发酵装置由一个或多个容器和/或发酵塔或管道装置组成，包括连续搅拌罐式反应器(CSTR)、固定化细胞反应器(ICR)、滴流床反应器(TBR)、泡罩塔、气升发酵罐、静态混合器或其它适合气-液接触的装置。本发明的优选方法、发酵生物反应器包括一个生长反应器，它将发酵液送入第二个发酵生物反应器，其中产生大部分产物乙醇。
“营养培养基”通常用于描述常规的细菌生长培养基，它含有维生素和矿物质，足够使选择的受试细菌生长。糖不包括在这些培养基中。各种适用于本发明的营养培养基的成分是已知的，在先前的出版物，包括发明人的那些出版物中有报道。见例如国际专利申请号WO98/00558；美国专利号5,807,722；美国专利号5,593,886和美国专利号5,821,111和上述出版物中所述的营养培养基配方。根据本发明，从CO、CO2和H2中产生乙酸的典型实验室营养培养基含有0.9mg/L泛酸钙。然而，从CO、CO2和H2产生乙醇的典型实验室营养培养基含有0.02mg/L泛酸钙。
术语“限制性底物”或“限制性营养物”限定了营养培养基或气相底物中的一种物质，它在生物反应器中的细菌培养生长期间被培养物消耗到一个水平，即不再支持生物反应器中的稳态或稳定细菌生长。因此营养培养基或气相底物中的所有其它物质过量存在，是“非限制性的”。限制的证据是提高加入限制性底物的速率，即提高对培养物的营养物进料速率或气体进料速率，导致由于细胞密度增加而气体吸收速率的相应增加(mmol/min气体)。除非另外说明，术语“乙酸”用于描述存在于发酵液中的分子或游离乙酸和乙酸盐的混合物。分子乙酸对乙酸盐的比依赖于系统的pH，即在恒定的“乙酸”浓度下，pH越低，分子乙酸对乙酸盐的相对浓度越高。
本说明书中的“细胞浓度”基于每升样品的细菌干重。细胞浓度直接或通过与光密度有关的校正测定。
术语“天然状态”描述了正常存在的不具有额外电子或质子的任何化合物、元素或通道。相反，术语“还原态”描述了具有过量的一个或多个电子的任何化合物、元素或通道。“还原态”是通过对“天然态”加上一个或多个电子，即通过降低发酵液的氧化还原电势实现的。
“乙醇产率”是乙醇的体积产率，计算成稳态乙醇浓度和连续系统中液体保留时间(LRT)的比值，或乙醇浓度和在分批系统中产生该浓度所需的时间的比值。词组“高乙醇产率”描述了大于10g/L·天的体积乙醇产率。
词组“高浓度乙醇”指发酵液中高于约10g/l，优选大于15g/L乙醇，或5∶1或以上的乙醇对乙酸产量比。
当进料气体中H2的摩尔对转化的CO的摩尔的两倍和转化的CO2的摩尔的三倍之和的比大于1.0时，乙醇生产达到“过量的H2”。如果该比值小于1.0，未达到过量的H2，乙醇仅可通过不同的控制机制产生。
II.本发明方法中所用的生物学途径不希望受理论约束，本发明人建立了理论，提高本文所述的厌氧菌生产乙醇的方法是基于与自养生长的产乙酸途径的基本途径循环中NAD(P)H转化到NAD(P)的生物学途径。本发明涉及操作这些途径，使得在稳定的操作条件下连续生产并维持高浓度的乙醇和低乙酸浓度，从而提高从工业气体产生乙醇的商业有用的方法。
下面描述了生物途径中NAD(P)H转化成NAD(P)的主要内容从气相成分，例如CO、CO2和H2产生乙醇发生在三步生物学方法中。在第一步，底物CO和H2被氧化，释放NAD(P)HNAD(P)→NAD(P)H
步骤1的产物然后被转化成乙酸，步骤需要NAD(P)HNAD(P)H→NAD(P)
最后，如果达到过量NAD(P)H，因为步骤1的反应比步骤2的反应速度快，乙酸被还原成乙醇。
NAD(P)H→NAD(P)
因此，从底物氧化实现过量的NAD(P)H导致从乙酸产生乙醇。
在产乙酸途径中有两种已知的基础途径循环(1)乙酰辅酶A循环和(2)THF循环，其中CO2被还原成甲基。J.R.Philips等，1994，Applied Biochemistry andBiotechnology，45/46145说明了乙醇和乙酸产生的顺序。乙酰辅酶A循环是内循环，本文称为CO循环。由于CO循环通常顺时针反应，还原了铁氧还蛋白。当其在氢化酶上氧化时，铁氧还蛋白被H2还原。结果，乙酰辅酶A也顺时针反应，铁氧还蛋白被氧化。如果内部CO循环和乙酰辅酶A循环以相同速率反应，铁氧还蛋白处于氧化还原态平衡。如果这两个循环不是以相同速率发生，即CO循环比乙酰辅酶A循环反应的速度快，还原的铁氧还蛋白增加。对于过量H2，也可产生过量的还原的铁氧还蛋白。该过量还原的铁氧还蛋白导致NAD(P)再生(还原)成NAD(P)H，它产生的过量必须被释放到平衡，从而将乙酸还原成乙醇。
THF循环对于细胞生长起作用，是连续培养必需的；因此不能完全停止。还原THF循环还用作引起更高的NAD(P)H对NAD(P)比例。NAD(P)H在两处被氧化。通过限制该氧化，维持总细胞NAD(P)H对NAD(P)比平衡，用NAD(P)H将乙酸还原成乙醇。
使乙酸还原成乙醇的第二种基本方法是直接降低发酵液的氧化还原电势。比培养物的天然状态足够低的还原态导致NAD(P)H富集并促进乙酸还原成乙醇。
III.本发明的方法该方法的基础步骤包括下列参照图1和下文实施例1给出的例子描述了具有产物回收的连续发酵方法。以所选的气体进料速率提供含有至少一种还原性气体，例如CO或H2的气相底物1的连续流，对含有受试细菌的发酵生物反应器3提供所选营养物进料速率的液相营养培养基2的连续流。在生物反应器3中，通过细菌发酵培养基和气相底物产生乙醇和乙酸。一旦在稳态条件下实现稳定的细胞浓度，操作连续系统的成分在发酵液中降低氧化还原电势，或增加NAD(P)H对NAD(P)的比，同时保持生物反应器中的游离乙酸浓度小于5g/L。设计本发明的该方法，允许并维持发酵液中的乙醇和乙酸生产，从而使乙醇产率在1∶1-20∶1的乙醇对乙酸比时大于10g/L·天。在一个实施例中，比例大于3∶1.在另一个实施例中，比例大于5∶1。在另一个实施例中，比例大于10∶1。在另一个实施例中，比例大于15∶1。本发明的方法还能有效地提高高乙醇浓度(15-35g/L乙醇)和低乙酸浓度(0-5g/L乙酸)从CO、CO2和H2稳定连续(稳态)生产，即乙醇∶乙酸产物比例为3∶1或以且具有良好的方法稳定性。
周期性的，在本发明的方法过程中，除去发酵液的样品，用常规测定方法确定比例。例如，通过离心从样品中分离细胞，然后对无细胞样品进行测定，例如优选气相色谱法。然而，本领域技术人员可选择其它常规测定方法。加入方法的其它可任选步骤以实现和/或维持比例。实施例2显示了这样的测定方法。
用于操作系统组分和维持和/或实现所需乙醇产率或乙醇对乙酸比例的步骤包括至少一个，和理想的是下列步骤的组合改变营养培养基含量、营养物进料速率、水相进料速率、操作压力、操作pH、气相底物含量、气相进料速率、发酵液搅拌速率、避免产物抑制步骤、降低生物反应器中的细胞密度、或防止底物抑制。一些优选的操作包括对生物反应器提供液相营养物(泛酸盐或钴)限制，进料气体中稍过量的CO和H2，使乙酸浓度最小化，避免培养物对低液相营养物浓度适应，使培养物以相对快的速度达到合适的细胞浓度，将培养物pH提高到4.5以上，从生物反应器中除去细菌细胞，到达低于稳定的稳态浓度的细胞浓度，当存在于生物反应器发酵液中的乙酸的游离乙酸部分超过2g/L时，利用生物反应器中的所有还原性气体或营养底物，和提高水相进料速率，从而抑制游离乙酸浓度中任何不需要的增加。下文详细描述了所有这些步骤。
含有除CO、CO2和H2以外的气体和来自反应器的未转化的CO、CO2和H2的废气4从反应器中被排出，并利用其燃料价值。如果使用过量的H2作为控制机制，那么在排出气体中的H2分压和排气中的H2分压对CO2分压的比例将用于通过该步骤鉴定乙醇对乙酸比的控制。使用细胞循环(但不是必需的)以提高生物反应器内的细胞浓度，从而提供更多的CO、CO2和H2转化的生物催化剂。使用细胞循环，将来自反应器5的液体流出物送到细胞分离器6，其中分离细胞7和渗透液(无细胞液体)8。将细胞7送回到生物反应器，渗透液8送到产物回收。
用连续离心、空心纤维或缠绕式过滤系统、陶瓷过滤器系统或其它固/液分离器实现细胞分离。可用各种技术，包括蒸馏和吸附从渗透液(或反应器5的洗脱液，如果不使用细胞分离)中回收乙醇。在蒸馏塔中分离渗透液8以产生95％乙醇塔顶馏出物10和循环回到反应器3的水11。循环水11含有发酵中未使用的过量营养物，但热蒸馏将破坏来自发酵或细胞裂解液的任何过量维生素。将95％乙醇塔顶馏出物10送到分子筛12，其中所需的终产物无水乙醇13从稀乙醇14中分离，送回到蒸馏塔9。
生长、死亡和细胞清除的连续组合维持恒定的细胞浓度，从而通过加入CO、CO2和H2以及营养物，而不补充任何额外的培养物，用于生产乙醇(和少量乙酸)的连续方法可操作许多月。本发明的方法维持和控制连续乙醇和乙酸生产的条件，并防止或迅速纠正方法异常。本发明的方法还帮助防止培养物对于低营养物浓度适应，这对于培养物性能有害。在下面的描述和实施例中，除非另外说明，所用的压力是一个大气压，所用的温度在36-41℃之间。所需的温度和压力可由本领域技术人员确定，取决用于生物反应器中所选的微生物。
下文专门描述的附加于本发明的基本步骤上的各种操作，它们能增加乙醇的生产。优选液相营养限制(泛酸盐或钴)或使用过量的H2或CO是本发明的方法的步骤，在下文详述，用于实现和维持所需的乙醇产率，并允许在发酵液中产生稳定的乙醇对乙酸的浓度和比例。这些条件允许在发酵液中生产稳定浓度的乙醇和乙酸。在优选实施例中，发酵液中产生的乙醇对乙酸产率比大于10∶1，乙醇浓度大于15g/L。
A.泛酸钙限制在本发明的一个具体实施例中，操作生物学途径以利于乙醇生产和限制乙酸生产的方法涉及将营养培养基中的泛酸钙量限制到比将细菌维持在稳定、稳态浓度可需的量少，在该浓度下，细菌将充分利用所提供的泛酸钙。泛酸钙是乙酰辅酶A的一种成分，因此通过限制营养培养基中的泛酸钙，相对于CO循环速率的乙酰辅酶A循环速率下降了。这导致还原的铁氧还蛋白增加和NAD(P)对NAD(P)H的比例下降，因此提高了最终产物乙醇的生产。
当对于每克加到生物反应器中的细胞(干重)，加到反应器中的泛酸钙(微克)在0.5-100范围内时，观察到泛酸盐限制。更理想的泛酸盐限制是在反应器中产生的每克干细胞2-75微克泛酸钙。优选的泛酸限制是在反应器中产生的每克细胞0.5-50微克泛酸钙。此限制的另一实施例是在反应器中产生的每克细胞约1-25微克泛酸钙。该限制的另一个实施例是在反应器中产生的每克细胞约10-30微克泛酸钙。该营养物量维持乙醇生产优先于乙酸生产。本方法的一个例子在实施例4中说明。
在该方法的另一个方面，通过调控或调节发酵参数，避免了细菌在发酵液中对于低限制性泛酸钙浓度的适应，从而维持了恒定的泛酸钙浓度，同时可调节气体进料速率、液体进料速率、搅拌速率或H2分压中至少一个，有时几个参数。避免了营养物中较大的改变，但是维持相对恒定的营养物进料浓度。如果使培养物对于低液相限制性营养物适应，将以不可逆的方式发生低产物比1.0g乙醇/g乙酸或更低。因此，反应器关闭，必须重新接种。优选通过首先对生物反应器在进料气体中提供过量的H2，然后如上所述限制营养培养基中的泛酸钙，控制生物学途径，以利于乙醇生产并限制乙酸生产。
事实上，在起始时，保持正常的限制性液相营养物泛酸钙过量，以避免对于低营养浓度的适应，该浓度将导致非常差的性能并使培养物丧失产生高于10g/L·天的高乙醇产率的能力，如果不使用过量的H2。对于特定的细菌培养物调节该发酵参数的例子在实施例17中说明。
B.钴限制在本发明的另一个实施例中，操作生物途径，以利于乙醇生产并限制乙酸产生的方法涉及将钴在营养培养基中的量限制到小于维持细菌在稳定的稳态浓度所需的量，该细菌浓度将充分利用提供的钴。当对于每克生物反应器中产生的细胞(干重)，加到反应器中的泛酸钙(微克)在5-100范围内时，观察到钴限制。优选钴限制涉及生物反应器中产生的每克细胞，在反应器中加入约20-50微克钴。该量的钴维持乙醇生产优先于乙酸生产。实施例18说明了在反应器中限制钴的方法的一个实施例。
在发酵液中限制钴也减少了乙酰辅酶A循环速率。由于用钴将甲基从THF循环转移到乙酰辅酶A循环，钴在发酵液中的限制量还通过不允许该转移降低了THF循环功能。钴限制降低了THF循环速率，也导致更高的NAD(P)H对NAD(P)比，从而产生乙醇。
还通过防止对于低限制性钴浓度适应而进一步操作该方法。以避免对低泛酸盐浓度适应的相同方法，维持稳定的钴盐浓度，同时调节一个或多个发酵参数(气体速率、液体速率、搅拌速率、CO2含量和H2气体分压)。避免了营养物中的主要改变，而相反维持相对恒定的营养物进料浓度。对于一种特定细菌培养物的发酵参数的调节在实施例19中说明。
优选通过首先在反应器中加入过量的H2，然后如上所述限制营养培养基中的钴控制生物途径，以利于乙醇生产并限制乙酸产生。在起始时，保持限制性液相营养物钴过量，以避免对于低营养浓度适应，该条件将导致非常差的培养物性能并使培养物丧失产生大于1∶1的产物比率的能力。
C.过量供应氢气在另一个实施例中，操作生物学途径，以利于乙醇生产和限制乙酸产生的方法涉及在进料气体中加入过量氢气，或限制导致过量H2的气相碳，使H2被生物学途径利用。优选H2还原性气体超过CO，过量的H2导致细菌在发酵液中产生高乙醇对乙酸比。如果H2与(进料气体的摩尔数)比CO(气体的摩尔数)的二倍和CO2(气体的摩尔数)的三倍之和的比值大于1，发酵罐是碳限制的。存在于排出气体中的H2分压优选高于0.4atm。最后，H2分压对CO2分压之比必须大于3.0，以确保有足够的H2来使用全部CO2。如果CO2分压大于0.1atm，看来生长受到其它限制。见实施例20对于该方法步骤的说明。
在起始过程中，过量H2的使用比营养物限制有利，主要是由于它较容易控制。使用过量H2的益处是避免了过量乙酸产生，可导致低产物比例和可能的乙酸抑制，以及对低营养物浓度的适应。
D.过量供应一氧化碳另一种操作本方法组成的途径涉及在用于该途径的气相底物中过量提供还原性气体CO，它直接降低了发酵液中的氧化还原电势。因此，根据该实施例，对生物反应器提供含有CO的气相底物，其中存在于生物反应器中的CO量高于将细菌维持在稳定的稳态浓度所需的量，在该细菌浓度下将充分利用提供的CO。当CO吸收比速(每分钟反应器内每克细胞(干重)的CO毫摩尔，或mmol/g细胞·分钟)大于0.3时，CO过量供应作为使乙醇生产高于乙酸生产的方法。更优选的，该步骤涉及CO吸收比速高于0.5。这意味着平均每个细胞在其代谢中以至少0.3mmol/g·分钟的速率，或理想的以至少0.5mmol/g·分钟的速率利用CO。优选提供CO的速率是CO吸收为0.3-2mmolCO/克细胞(干重)的细菌/分钟。在另一个实施例中，以0.5-1.5mmolCO/克细胞(干重)的细菌/分钟速率提供CO。实施例24提供了对于该方法步骤的一个实施例的说明。
该CO吸收速率维持乙醇生产优先于乙酸生产。如果提供的CO使发酵液中溶解的CO对于气体压力是显著的，或极好的物质传递，发酵液变得更还原。过度提供CO还有两个好处。过量的CO可导致CO循环以更快的速率进行，如果乙酰辅酶A循环被限制，并不能跟上CO循环，还原的铁氧还蛋白增加。CO还可以通过底物抑制使整个三步方法中的步骤2(中间物乙酸产生)变慢。步骤2对于步骤1中的该速率下降导致过量的NAD(P)H，导致乙醇生产有利于乙酸生产。
虽然过量的CO可通过直接降低发酵液的氧化还原电势，导致乙醇产量提高，过量CO的存在还通过抑制CO-脱氢酶，从而抑制H2的吸收抑制了生长。过量CO的存在不幸还导致差的H2转化，在经济上是不利的。在底物抑制下进一步操作的后果是差的H2吸收。这最终导致细胞裂解，必须重新启动反应器。在培养物的最初生长或其后，该方法对于CO底物抑制有不利的结果(在对有效细胞存在太多CO)，气体进料速率和/或搅拌速率下降，直到缓解底物抑制。实施例21说明了如何调节气体速率或搅拌速率以实现该作用的例子。
E.其它操作步骤除了上述增强步骤的主要方法外，在乙醇生产方法中包括几个方法步骤是理想的。
1.增加质量传递一个额外的实施例涉及确保CO或H2从气体进料质量传达到液体发酵液比细菌利用溶解气体的能力要快。例如，如果含有杨氏梭菌的生物反应器中加入CO、CO2和H2，并在没有营养物限制(例如泛酸盐或钴)，或过量H2存在下操作，细胞生长受到转移到液相中的气体量的限制，系统产生乙酸作为产物。如果培养物中加入稍超过培养物生长所需量的CO或H2，它产生乙醇。然而，如果在液相中转移了太多用于培养物的气体，将发生底物抑制，可导致培养物破坏和细胞死亡。因此对于过量质量传递具有很窄的操作范围。实施例22提供了该方法的说明。
根据乙酰-辅酶A循环，为了产生过量还原的铁氧还蛋白，CO循环或铁氧还蛋白通过氢化酶的还原必须比乙酰辅酶A循环快。本文描述的该方法通过限制主要营养物，例如泛酸钙或钴、或其它底物，例如CO2气体对于细菌可行的速率，或通过对培养物提供过量底物、H2或CO限制了微生物利用溶解气体的速率。
可计算出物质转移的理论速率(比细菌可以利用底物的速率快，甚至在没有其它限制下)。当达到时，该速率受到微生物的自然生长速率的限制。因此，最具生产性的实施例是质量传递(气体流动速率或搅拌速率)比以细胞可利用底物而不受限制的最高可能浓度的速率快。由于底物抑制可很快导致细胞死亡和对培养物有毒的副产物浓度，可以操作范围很窄。
2.提供过量的CO和H2在本发明的方法的另一个实施例中，在方法中实现了高乙醇浓度/有限的乙酸产生的稳定性，它限制钴或泛酸钙，或提供大量的H2或CO。根据该步骤，由于培养物利用气相底物CO、H2和CO2作为碳源和能源，稍过量提供了CO和H2。通过达到稳定的操作，然后逐渐增加气体进料速率和/或搅拌速率(10％或更少的增加)，直到CO和H2转化刚开始下降，实现稍过量的CO和H2。这是一种避免质量传递限制(利于乙酸产生)，并提供过量还原的铁氧还蛋白以将NAD(P)还原为NAD(P)H并产生乙醇的方法。如果不是稍过量的提供CO和H2，发生质量传递限制，和途径平衡。这导致乙醇对乙酸产率比差(高乙酸浓度)。高乙酸浓度将最终导致乙酸抑制，它限制细菌摄取H2的能力，最终导致培养失败。
避免质量传递限制的步骤包括提高搅拌速率或气体速率，以将更多的CO和H2转移到液相中，从而回到存在稍过量的CO和H2。如果产物抑制是质量传递限制的结果，必须通过稀释到较低的乙酸浓度，提高液体进料速率以清除乙酸抑制。由于提高培养基进料速率将提高每克产生的细胞的微克泛酸盐或钴，这必须简单地进行或必须通过调节培养基浓度或提高水进料速率消除过量的泛酸盐或钴。
3.控制乙酸产物抑制在上述方法中，如果在生物反应器中聚集过多的分子乙酸，即大于2g/L用于细胞生长和乙醇产生，可发生乙酸产物抑制。用另一个操作步骤防止培养失败。一种修改涉及简单提高液体或水相进料速率以降低抑制性乙酸的液相浓度到2g/L以下。反应器中对于特定培养物的该步骤的一个例子在实施例23中说明。
4.水回收步骤另一个可任选的用于维持稳定的培养物的方法步骤，该步骤产生乙醇作为唯一的产物，在本发明的方法中没有净乙酸产生，该方法涉及将蒸馏得到的水回收物加回发酵反应器中(见实施例15)。如前所述，水(含有达5g/L的乙酸)回收物有益于将产生的乙酸回收入反应器，从而不产生净乙酸。因此在反应器中的乙醇和乙酸之间建立了平衡。结果，加入反应器并转化为产物的全部CO、CO2和H2导致乙醇产生，除了用于维持培养物的那些外。
5.降低细胞密度用于该方法的另一个操作步骤是从生物反应器中定期或连续除去细菌细胞，以降低生物反应器中的细胞浓度。该操作能将细胞浓度降低到利用生物反应器中的全部还原性气体或营养底物的小于稳定的稳态细胞浓度。因此，通过改变细胞密度，生物反应器中的乙醇生产高于乙酸生产。见例如实施例25。
6.两阶段CSTR与培养基限制乙醇生产有关的问题之一是培养物最终适应限制性条件的能力和倾向，而在操作几个月后不再继续产生乙醇。相反最终乙酸成为主要产物。这种对于低限制性营养物浓度的适应导致培养物产生的乙酸比乙醇多，(乙醇对乙酸产物比为1.0或以下)，并得到低乙醇浓度(有时低至1g/L)。当起始时(生长速率比乙醇生产速率更重要)没有对培养物提供足量营养物时，最可能发生适应。另外，在稳态操作过程中有培养物适应低限制性营养物浓度的危险，特别是限制性营养物浓度被下调，以除去乙酸反应系统。
当使用上述泛酸盐或钴限制步骤而不是用可得到的营养物使培养物生长时，为了避免该适应和上述危险，可使用该方法的另一种改进。该方法的另一种改进是二阶段CSTR系统，其中主要的良好培养生长在第一阶段中，在稍过量的限制性营养物上发生(可能伴有乙酸产生)，然后是生产阶段，其中限制性营养物限制了来自第一阶段的培养物，并用于产生高浓度的乙醇。该改进能维持稳定培养，它不适应减少的泛酸盐或钴浓度。该改进涉及操纵二阶段CSTR，其中生长反应器(阶段1)送到生产反应器(阶段2)，其中发生大量乙醇生产。不用上述营养限制步骤操作生长反应器，从而使培养物不易于对限制的条件适应。
图2显示了该二阶段CSTR系统的示意图，下面是参考该图的说明。根据该实施例，生长阶段在约24小时的液体保留时间操作。在生长阶段CSTR1中在培养基2中加入足量的泛酸盐或钴，以得到健康的培养物(也可产生一些乙酸)。因此，在反应器中产生过量乙酸，但稳定性提高了。该泛酸盐或钴浓度超过通常加到单CSTR中用于产生乙醇的浓度。加到该反应器中的气体是来自生产阶段4的未转化的气体3，液体进料是新鲜培养基2。生长阶段CSTR的操作不包括细胞循环。该生长阶段反应器的目的是提供健康的培养物，以用于随后的乙醇生产，而不对低泛酸盐浓度适应。
生产阶段反应器4以正常的LRT或小于20小时操作。该具有细胞循环的CSTR中加入新鲜气体进料5，并可具有低转化。加入新鲜培养基进料6和来自生长阶段的培养物进料7。在该反应器中加入最低的泛酸盐或钴，因为可得到来自生长阶段的过量泛酸盐或钴。在该反应器使用细胞循环8，以便从回到反应器9的细胞中得到最大的产量。液体产物10中排出的乙醇浓度应高于20g/L。二阶段CSTR的特征包括对于低泛酸盐或钴浓度的适应几乎没有改变；总的LRT小于或等于30小时；比相同规模的单CSTR预计大的乙醇产率和更高的乙醇浓度。
7.起始的变化优选用于本发明实施的其它方法步骤涉及在发酵培养的最初起始阶段中的细胞产生。生物反应器的起始阶段加入CO、CO2和H2，以产生乙醇和乙酸，该阶段是通过从原种培养物的批量接种(实施例11)，或通过使用现存的反应器的连续接种作为培养物进料(实施例12)实现的。如以前在讨论避免培养物对低泛酸盐或钴浓度适应中所注意到的，培养物最理想在限制营养物，但在培养物中加入过量H2之前达到高细胞浓度。该快速起始避免了培养物适应，并得到良好的产物比(高乙醇和低乙酸浓度)。如果不使用快速起始，可发生差的产物比，培养物将适应低液相营养物浓度，并需要重新对反应器进行接种。
用批量液相(培养液最初不连续加到反应器中)、低搅拌速率(在实验室NewBrunswick Scientific Bioflo反应器中大约400-600rpm)和在所需的pH下开始反应。反应器中的液相由一批含有维生素和盐的营养培养基、正常浓度的限制性营养物，泛酸钙或钴(例如20微克/L泛酸盐或75ppb钴)组成。如果使用从现存的反应器连续接种，看来不需要批量液相操作。在这种情况下，在最初的起始过程中气体以慢速连续加到反应器中。理想的，起始阶段的气体将是无CO2，富含H2的，气体速率和搅拌速率将维持在低水平以防止CO底物抑制。
从CO、CO2和H2生产和维持商业上可行的乙醇浓度的示范性一般起始方案由三个不同阶段组成(a)最初起始，其中细胞生产是关键的；(b)起始，其中生产速率变得关键；(c)稳态操作。主要是最初起始的特征是接种一批液体，含有标称的限制性营养物，选自钴(75ppb)或泛酸钙(20微克/L)，在所需的pH(通常4.5-5.5)。为了促进起始，气体进料速率和搅拌速率优选保持低，而H2进料过量。在起始阶段导致乙醇生产的是过量H2；营养物限制以后发生。因此，过量的液体营养物事实上在起始阶段存在，以避免对低营养物的不良培养物适应。随着发酵在接种后进行了数小时，产生CO2，消耗H2。这些比例的改变表明搅拌速率应该名义上缓慢增加(可能在实验室反应器中经2-3天或许不低于200-300rpm)，以避免质量传递限制。
该CO2产生的开始在使用与原种培养物批量接种相反的连续接种系统中发生更加迅速。然而，如果搅拌速率增加得太快，发生CO底物抑制。观察H2(或CO2产生)，同时以相对快的速率名义上增加搅拌速率的步骤，直到达到目标搅拌速率。在批量液体培养物中提高搅拌速率的过程中，最重要的是细胞生产而不是产物形成。
一旦达到目标搅拌速率(在实验室New Brunswick Scientific Bioflo反应器中800-1000rpm)，使培养物稳定，以确保H2吸收。起始转换到另一模式，其中生产速率变得重要。理想的是CO转换超过80％，在排出的气体中具有高H2分压(至少0.55atm)，以确保乙醇生产，同时限制乙酸和游离的分子乙酸浓度。然后开始液体培养基进料(对于具有原种培养物批量接种的系统)，以引发连续液体进料，气体速率向目标流速增加10％。H2保持过量，以避免过量乙酸产生。随着气体速率上升，限制液相营养物(泛酸钙或钴)，该限制的作用是在目标生产时，H2转换稍稍下降。
在稳态操作时，达到15-35g/L乙醇和0-5g/L乙酸的产量。在该阶段，需要稍调节限制营养物、液体进料速率和气体进料速率，并由本领域技术人员根据本领域现有技术和本发明的指导进行选择。如果对乙醇生产方法增加细胞循环，在此时增加并伴有气体速率(上升)和营养物浓度(下降)的调节。
在稳定操作条件下连续生产和维持高乙醇浓度，低副产品乙酸浓度的上述方法增强了受试细菌在商业规模的乙醇生产上的用途。上述方法中描述的步骤克服了利用受试细菌从CO、CO2和H2商业生产乙醇的限制。优选该方法使用连续生物反应器，虽然也可用批量和进料批量发酵法，但对于大规模乙醇生产看来不是经济上可行的。
以下实施例说明了本发明的各种方面、方法和方法步骤。这些实施例不限制本发明，其范围体现在权利要求中。
实施例1 本发明的一种示范性方法含有CO和/或CO2/H2的合成或废气和含有维生素、痕量金属和盐的常规液体培养基连续引入含有杨氏梭菌的搅拌罐生物反应器。下文表1报道了一种理想的营养培养基。
在使用10％或更少的培养接种物的起始的方法中，反应器以批量液相操作，其中培养液不连续加入反应器。反应器中的液相由一批具有限制性营养物，泛酸钙或钴的标定浓度的营养培养基组成。另外，还可使用含有酵母抽提物、胰蛋白酶或其它复合营养物的丰富培养基。
理想的是，起始时的气相是无CO2的，并含有过量H2。气体速率和搅拌速率维持在低水平(在New Brunswick Scientific Bioflo反应器中小于500rpm)，得到稍过量的CO和H2，但同时避免了CO底物抑制。在例如1升的实验室NewBrunswick Scientific Bioflo发酵生物反应器中，进料气体组成是63％H2、32％CO和5％CH4，引发起始的搅拌速率是400rpm，气体速率是20ml/min。在起始过程中导致乙醇产生的是过量H2；对营养物的限制以后发生。因此，过量的液体营养物(泛酸盐、钴)实际上在起始过程中存在，以避免培养物对于低营养物的不良适应。
随着发酵在接种后经过几个小时的一段时间，从CO转化产生CO2，H2与CO2一起被消耗，是名义上提高搅拌速率，以避免气体质量传递限制的信号。在NewBrunswick Scientific BiofloCSTR中，排出的气体是25％CO、67％H2、2％CO2和6％CH4。如果搅拌速率提高的太快，CO底物抑制发生，由搅拌增加后甲烷浓度的下降证明。因此，搅拌速率通常在24小时内增加到200rpm。该监测CO2产生(或H2转换)，同时名义上提高搅拌速率的过程以相对快的速度发生，直到达到目标搅拌速率。New Brunswick Scientific Bioflo发酵生物反应器中的典型目标搅拌速率是900rpm。在该批量液体培养中提高搅拌速率的过程中，细胞生产而不是产物形成是最重要的。因此，获得约1.5g/L的细胞浓度，同时来自批量培养的典型产物浓度是10g/L乙醇和2g/L乙酸。
一旦达到目标搅拌速率，使系统生长至最大H2吸收。理想的是具有非常高的H2排出浓度(通常＞60％)，以确保乙醇生产同时限制乙酸产生。然后开始培养液进料(对于从原种培养物批量接种的系统)，以引发连续液体进料，和向目标流速提高气体进料速率。在实验室New Brunswick Scientific Bioflo发酵生物反应器中，液体进料速率通常是0.5ml/min，而气体流速每24小时向125ml/min的目标速度增加10-15％。
重要的是在进料气体中提供过量H2，以避免过量乙酸产生。随着气流速度增加，细胞产生增加直到反应器最终受到液相营养物(泛酸钙或钴)限制，如H2转化在目标产率时稍稍下降所证明的。在New Brunswick Scientific Bioflo CSTR中，这由20g/L·天的目标产率时H2的转化下降10％所识别。
然后生产方法和反应器系统维持在稳态，产生15-35g/L乙醇和0-5g/L乙酸作为产物，仅偶尔稍稍调节限制性营养物、液体速率和气体速率。通常在实验室New Brunswick Scientific Bioflo发酵生物反应器中的稳态条件(不包括细胞回收)是20分钟的气体保留时间(气体流速/反应器液体体积)、30小时的液体保留时间(液体流速/反应器液体体积)和900rpm的搅拌速率，得到92％的CO转化和60％的H2转化，伴有泛酸盐限制。
在该方法的一个实施例中，其中对于反应器系统加入细胞回收，此时它与气体速率(增加)和营养物浓度(下降)一起加入。伴随New Brunswick ScientificBioflo CSTR中的细胞回收，气体保留时间通常是8分钟，液体保留时间通常是12小时，细胞保留时间是40小时，搅拌速率是900rpm。这些条件通常得到92％的CO转化和50％H2转化，伴有泛酸盐限制。
实施例2 通过气相色谱对样品进行分析为了实现和/或维持准确的生产率和比例，必须定期对发酵生物反应器中的发酵液样品取样分析。从生物反应器中的培养物取得大于1.5ml培养物的样品。将样品置于微量离心管中，将管置于Fisher Scientific Micro 14离心机上，用压载物平衡。样品于8000rpm离心1.5分钟。将0.500ml上清液样品置于1.5ml设计用于气相色谱自动取样器的试管中。内标溶液的0.5ml样品含有5g/L正丙醇和5％ v/v、85％磷酸的去离子水溶液。磷酸确保所有乙酸盐转化成乙酸，用气相色谱检测。
然后用自动取样器将1微升制备的样品注射入装有007 FFA Quadrex 25m x0.53mm ID融合硅毛细柱的Hewlett-Packard 5890系列II气相色谱中。该分析是通过氦载体气体以分流模式进行的，具有66ml/min的分流和7.93ml/min的注射器净化。柱头压设定于4 psig，得到7ml/min的柱载体流动。温度程序是75℃0.2分钟，以30℃/分钟达到190℃，在190℃保留5.17分钟。得到的运行时间是8分钟。仪器对于乙醇(0-25g/L)、乙酸(0-25g/L)、正丁醇(0-5g/L)和丁酸(0-5g/L)标定。用5种从试剂级物质制备的标准标定。如果样品在浓度的标定范围外(例如＞25g/L乙醇)，在试管中加入0.250ml样品和0.250ml去离子水，使用0.500ml的内部标准，在分析中包括稀释因子。
实施例3 具有细胞回收的实验室CSTR中的酸生产用杨氏梭菌菌株ERI2，ATCC55380从CO、CO2和H2生产乙酸，操作具有细胞回收的New Brunswick Scientific Bioflo实验室发酵生物反应器。气体进料含有40％H2、50％CO和10％N2，对于1升反应器的气体保留时间是7.7-8.6分钟。以2.6-2.9小时的液体保留时间加入含有维生素、盐和痕量元素的液体培养基。pH是5.1-5.2，搅拌速率是1000rpm，细胞保留时间是约40小时。在这些物质转移限制(不是营养限制)条件下，CO转化是94％-98％，H2转化是80-97％。细胞浓度是4-8g/L，乙酸以10-13g/L产生。不产生乙醇。虽然反应器在物质转移限制(受到将气体转移给培养物的能力的限制)下操作，因此仅产生乙酸作为产物，监测通过泛酸盐限制、钴限制或过量H2或CO的存在生产乙醇的参数，作为当产生乙醇作为主要产物时的比较。
如表2所示，Ca-d-泛酸盐进料/单位产生的细胞是1575-3150微克/克产生的细胞(μg/g产生的细胞)。类似的，每克产生的细胞的钴进料是1734-3468(微克/g产生的细胞)。比CO摄取率是0.35-0.61mmol/g细胞·分钟。H2进料的摩尔数对转化的CO摩尔数的两倍和转化的CO2摩尔数的三倍之和的比例小于0.46。因此，没有参数在培养物生产乙醇的所需操作范围内。
意识到在物质转移限制下产生乙酸作为产物时，泛酸盐和钴以大的过量加到上述反应器中。即可以显著降低泛酸盐和/或钴的水平，而仍然在泛酸盐或钴限制的水平之上。为了说明这一点，改变加到1升New Brunswick Scientific Bioflo发酵生物反应器中的培养基，明显地降低加入的钴刚好高于钴限制的钴浓度的水平。反应器仍含有杨氏梭菌菌株ERI2以从CO、CO2和H2产生乙酸。气体进料含有55％H2、25％CO、15％CO2和5％CH4(参比气体)，气体保留时间是7.5-8.0分钟。含有盐、维生素和痕量元素的液体培养基以3.0-3.5小时的液体保留时间加入，细胞保留时间是40小时。pH是5.0-5.3，搅拌速率是900-1000rpm。是在这些条件下，CO转化是95-99％，H2转化是94-98％。细胞浓度是2.5-4.0g/L，乙酸是唯一的产物，浓度为10-14g/L。
加到反应物中的每克细胞的Ca-d-泛酸盐是2250-3600微克泛酸盐/g产生的细胞。每单位产生的细胞加入的钴减少到62.0-99.2微克钴/g产生的细胞。比CO摄取速率是0.325-0.4mmole/g细胞·分钟。加入的H2对于转化的CO的两倍和转化的CO2的三倍之和的比是0.875。
实施例4 具有泛酸盐限制的实验室CSTR中的乙醇生产用杨氏梭菌株C-01 ATCC55988操作New Brunswick Scientific Bioflo实验室发酵生物反应器，作为直通CSTR(不具有细胞回收)，从CO、CO2和H2生产乙醇，受到泛酸盐限制。反应器中的气体进料含有63.3％H2、31.4％CO和5.3％C2H6(参比气体)；以27分钟的气体保留时间进料。含有过量的盐和痕量元素，以及有限量的泛酸盐的液体培养基以31.4小时的液体保留时间加到1.55升反应器中。pH是4.6-4.7，搅拌速率是650rpm。在这些操作条件下，CO转化是98％，H2转化是83％，细胞浓度是1.5-2.0g/L，乙醇以15-19g/L浓度产生，而乙酸以1.5g/L产生。乙醇产率为11.5-14.5g/L·天。
在分析乙醇生产的参数中，通过用泛酸盐进料对细胞生产比为17.7-23.6微克泛酸盐/g产生的细胞操作，观察到泛酸盐限制。将该比值与2250-3600微克泛酸盐/g产生的细胞以及实施例3中1575-3150微克泛酸盐/g产生的细胞的酸产生比较。每单位产生的细胞的钴进料是5000-6000微克钴/克产生的细胞，比实施例3中的水平更高，确保没有钴限制。比CO摄取率是0.23-0.30mmole/g产生的细胞·分钟。H2进料对转换的CO的二倍和转换的CO2的三倍之和的比值是1.03，排出的气体中H2分压是0.55-0.64atm。可能过量H2或限制的泛酸盐导致乙醇产生。
在另一个具有细胞回收，使用杨氏梭菌菌株C-01 ATCC55988的New BrunswickScientific Bioflo实验室反应器中也说明了乙醇生产的泛酸盐限制。该反应器中加入含有61.7％H2、30.6％CO和5.2％C2H6(参比气体)的进料气体，气体保留时间是12.3分钟。含有有限供应的泛酸盐和过量的盐和痕量金属的液体培养基加到2.4升反应器中，液体保留时间是24.8小时。使用0.2微米空心纤维膜提供细胞回收，细胞保留时间是69小时。pH是4.6，搅拌速率是650rpm。在这些条件下，CO转化是90％，H2转化是53％，细胞浓度是2.5g/L。乙醇浓度是18g/L，乙酸浓度是3g/L。乙醇产率是17.4g/L·天。
在分析乙醇生产的参数中(表2)，每单位产生的细胞的泛酸盐进料比例是8.08微克泛酸盐/克产生的细胞。另外，也通过在比乙酸生产所需的水平低得多的水平操作来确保泛酸盐限制。每单位产生的细胞的钴进料是3960微克钴/g产生的细胞。比CO摄取率是0.33mmole/g-细胞·分钟。H2进料对转化的CO的二倍和转化的CO2的三倍之和的比值是1.14，排出的气体中H2分压是0.60-0.65atm。过量的H2可能是乙醇产生的潜在原因；然而，排出的气体中高含量的CO2显示生长受到泛酸盐限制。
在另一个实验中，在从CO、CO2和H2产生乙酸的过程中，对杨氏梭菌菌株ERI2供给1500-3600微克泛酸盐/g产生的细胞，该条件是反应器不受泛酸盐(或任何其它限制，除了将气体转移给培养物的能力)限制，在产物流中未发现乙醇。
在对泛酸盐限制从CO、CO2和H2产生乙醇的过程中，以8-24微克泛酸盐/g产生的细胞供给杨氏梭菌菌株C-01，同时维持其它营养物过量。在这些条件下，菌株C-01产生15-19g/L乙醇和1.5-3.0g/L乙酸。
实施例5 具有钴限制的实验室CSTR中的乙醇生产用杨氏梭菌株C-01 ATCC55988操作New Brunswick Scientific Bioflo II实验室发酵生物反应器，作为直通CSTR(不具有细胞回收)，从CO、CO2和H2生产乙醇，受到钴限制。反应器中的气体进料含有60％H2、35％CO和5％CH4(参比气体)；以14分钟的气体保留时间进料。含有过量的盐、维生素和痕量金属(除了钴，它是限制性的)的液体培养基以40小时的液体保留时间加到2.5升反应器中。pH是4.9，搅拌速率是650rpm。在这些操作条件下，CO转化是91％，H2转化是20-80％，但名义上是50％。乙醇以26g/L产生，而乙酸以4g/L产生，细胞浓度是2.5g/L。乙醇产率为15.6g/L·天。
在分析乙醇生产的参数中，泛酸盐进料对细胞生产比为15.2微克泛酸盐/g产生的细胞。该水平非常低，因此钴限制不能确保有利于泛酸盐限制。通过用33.3微克钴/克产生的细胞操作观察到钴限制，该水平比用于没有钴限制的反应器低100倍。H2进料对转化的CO的二倍和转化的CO2的三倍之和的比值是0.94。比CO摄取率是0.37mmole/g细胞·分钟。
在用杨氏梭菌菌株C-01ATCC 55988的具有细胞回收的CSTR中也证明了乙醇生产的钴限制。该实验用于证明在过量泛酸盐存在下的钴限制，与该实施例中的先前反应器相反。在具有0.2微米空心纤维膜用于细胞回收的New BrunswickScientific Bioflo 2000实验室发酵生物反应器中加入含有60％H2、35％CO和5％CH4(参比气体)的气体，气体保留时间是5分钟。含有过量盐、维生素和痕量金属(还是除了限制性的钴)的液体培养基以16小时的液体保留时间加到1.2升的反应器中。pH是5.1，搅拌速率是825rpm。该具有空心纤维用于细胞回收的CSTR中的细胞保留时间是40小时。在这些条件下，CO转化是83％，H2转化是50％，细胞浓度是4.2g/L。乙醇浓度是18g/L，乙酸浓度是4g/L。乙醇产率是27g/L·天。
在确定该反应器中乙醇生产的参数中(表2)，泛酸盐进料对细胞生产的比例是85.7微克泛酸盐/g产生的细胞，该水平比本实施例中前一反应器中的水平高5.5倍。用47.6微克钴/g产生的细胞操作观察到钴限制。H2进料对于转化的CO的两倍和转化的CO2的三倍之和的比值是1.03，排出的气体中H2分压是0.60atm。过量的H2仍然可能是乙醇生产的潜在原因；然而排出的气体中的高CO2含量(0.1-0.15atm)显示了生长受到钴的限制。比CO摄取率是0.50mmol/g细胞·分钟。
实施例6 当在过量CO存在下操作时，实验室CSTR中的乙醇生产操作高压AUTOKLAVTM反应器(Buchi)，作为具有培养物循环和细胞回收的CSTR，使用杨氏梭菌株C-01用于从CO、CO2和H2在过量CO存在下生产乙醇50小时。反应器在25psig下操作，进料气体含有57％H2、36％CO和6％C2H6。气体保留时间是可变的，但名义上为3.0分钟。将含有过量盐、维生素(包括泛酸盐)和痕量金属的液体培养基加到600ml反应器中，液体保留时间是8.2小时。将反应器洗脱液通过陶瓷空心纤维滤膜获得的细胞保留时间是18.5小时。pH是4.5，搅拌速率是450rpm，液体再循环速率是0.4-0.5gpm。在这些条件下，气体转化是可变的，但CO转化是72％，H2转化是12％。细胞浓度是2.7g/L。产生的乙醇是9.9g/L，产生的乙酸是2.6g/L。乙醇产率是29.0g/L·天。
在分析乙醇生产的参数中，泛酸盐进料对细胞生产的比例是97微克泛酸盐/g产生的细胞。该水平足够高，以确保泛酸盐不是限制性的。钴进料对细胞生产的比例是836微克钴/g产生的细胞，该水平也确保钴不是限制性的。H2进料对转化的CO的两倍与转化的CO2的三倍之和的比例是1.09，H2分压是1.6atm。排出的气体中的高CO2含量(0.5atm)确保过量的H2不导致乙醇生产。比CO摄取率是1.34mmol/g细胞·分钟，该水平确保过量的CO是产生乙醇的方法。
用过量的CO生产乙醇的技术也在在AUTOKLAVTM反应器(Buchi)系统中使用杨氏梭菌株C-01的另一实验中得到证明，该系统也具有细胞回收和培养循环，时间是24小时。在该实验中，在600ml反应器中加入含有15.8％H2、36.5％CO、38.4％N2和9.3％CO2的气体，气体保留时间是1.4分钟。反应压力维持在40psig。含有过量盐、维生素和痕量金属的液体培养基以液体保留时间4.8小时加入，将洗脱液通过陶瓷空心纤维滤膜获得的细胞保留时间是19.2小时。pH是4.5，搅拌速率是1000rpm，液体再循环率是0.4-0.5gpm。在这些条件下，CO转化是71.6％，H2转化是11.8％。细胞浓度是7.1g/L，乙醇以12.0g/L产生，乙酸以2.7g/L产生。乙醇产率是60g/L·天。
在分析乙醇生产的参数(表2)中，泛酸盐进料对细胞生产的比例是294微克泛酸盐/g产生的细胞。该水平大大超过了由于泛酸盐限制导致乙醇生产所需的最低水平。钴进料对细胞生产的比例是735微克钴/g产生的细胞，该水平也确保钴进料过量。H2进料对转化的CO的两倍与转化的CO2的三倍之和的比例是0.3。CO摄取率是0.67mmol/g细胞·分钟，该水平再次确保过量的CO是产生乙醇的方法。
实施例7 过量H2存在下的乙醇生产操作New Brunswick Scientific Bioflo实验室发酵生物反应器，作为直通CSTR(没有细胞回收)，使用杨氏梭菌菌株C-01 ATCC 55988，用于在过量H2存在下从CO、CO2和H2生产乙醇。加到反应器中的气体含有77％H2、19％CO和4％CH4(参比气体)，以30分钟的气体保留时间加入。含有过量盐、维生素和痕量元素的液体培养基以36小时的液体保留时间加到反应器中。pH是5.0，搅拌速率是1000rpm。在这些操作条件下，CO转化是97-99％，H2转化是60-80％。细胞浓度是0.8-1.0g/L，乙醇浓度是10g/L，乙酸浓度是3.3g/L。乙醇产率是6.7g/L·天。
在分析乙醇生产的参数中，泛酸盐进料对细胞生产的比例是900-1125微克泛酸盐/g产生的细胞，因此确保过量泛酸盐存在。类似的，钴进料对细胞生产的比例是991-1239微克钴/g产生的细胞，该水平也确保过量的钴存在。比CO摄取率是0.28-0.35mmol/g细胞·分钟，过量CO水平不导致乙醇产生。H2进料对转化的CO的两倍与转化的CO2的三倍之和的比例是1.96，比例大于1.0，该水平表明存在过量H2，并且能够控制乙醇生产。排出的气体中H2的分压是0.70-0.87atm，而排出气体中H2分压对CO2分压的比例是65。因此，该反应器由于过量H2的存在生产乙醇。
在第二个实验中，操作高压AUTOKLAVTM反应器(Buchi)作为CSTR，具有培养物循环和细胞回收，使用杨氏梭菌菌株C-01在过量H2存在下，从CO、CO2和H2生产乙醇。加到反应器中的气体含有81％H2、16％CO和3％CH4(参比气体)，以气体保留时间2.21分钟加入。含有过量的盐、维生素和痕量元素的液体培养基以液体保留时间8.97小时加入。细胞保留时间是22.7小时，pH是4.5，搅拌速率是800rpm。在这些操作条件下，CO转化是91.5％，H2转化是43.4％。细胞浓度是5.5g/L，乙酸浓度是2.85g/L。反应器中的乙醇产率是215-240g/L·天。
在分析乙醇生产的参数中，泛酸盐进料对细胞生产的比例是46微克泛酸盐/g产生的细胞，该水平可能表明泛酸盐限制。钴进料对细胞生产的比例是460微克钴/g产生的细胞，该水平确保钴不是限制性的。比CO摄取率是1.68mmol/g细胞·分钟，该水平能表明存在过量CO，如果不是由于4.14mmol/g细胞·分钟的高H2摄取率(表明对H2转化的底物抑制不存在)。H2进料摩尔数对转化的摩尔CO的两倍与转化的摩尔CO2的三倍之和的比例是5.67，该比例大大超过过量H2存在所需的比例1.0。排出的气体中H2的分压是2.61atm，而排出气体中H2分压对CO2分压的比例是10.9。因此，该反应器由于过量H2的存在生产乙醇。
表2显示了对于实施例3-7的方法参数和结果的总比较。
实施例8 用培养基配方对杨氏梭菌菌株ERI2、C-01和PETC的产物变化本发明的方法可用于任何杨氏梭菌菌株。表3显示了使用菌株ERI2、C-01和PETC的培养基操作实验的结果。这些实验的目的是证明各菌株可仅通过操作培养基从乙酸生产转换到乙醇生产。因此，在培养物中加入过量营养物(包括泛酸盐和钴)，以产生作为主要产物的乙酸，然后限制泛酸盐或钴以产生作为主要产物的乙醇。应强调这些实验的唯一目的是证明培养基操作可导致对于各菌株的产物变化。因此，获得高产物浓度和产率不是这些实验的目的。
对于各培养实验，操作各反应器作为直通CSTR(无细胞回收)。气体保留时间标定为50分钟，液体保留时间标定为40小时，搅拌速率标定为1000rpm。选择这些条件以比较菌株，但未实现高产率。
如表3中注意的，菌株ERI2的培养基有5个改变，将产物在乙酸作为主要产物和乙醇作为主要产物来回改变。该菌株证明了对于乙醇生产的泛酸盐限制和钴限制。菌株C-01用培养基操作改变三次，泛酸盐限制和钴限制再次证明是乙醇生产的机制。菌株PETC仅改变1次，乙醇生产是由于钴限制。各菌株显示当产生乙酸而不是乙醇作为主要产物时H2转化较高。这是由于乙酸是在物质转移限制(限制气体转移到培养物的量)下生产的，而乙醇是在限制营养物时产生的，因此提供的过量气体对气体转换产生负影响。当主要产物是乙醇时，在产物流中总是存在少量乙酸。然而当乙酸是主要产物时，乙醇通常不以可检测的浓度存在。在通过营养物操作将主要产物从乙醇转变为乙酸时，显示非常难除去所有的痕量乙醇。完全除去乙醇仅在乙酸增强性培养基上连续操作数周后发生。
实施例9 有/没有细胞回收的稳态操作从CO、CO2和H2产生乙醇的最终商业目标是实现高稳态浓度的乙醇，同时获得高乙醇对乙酸比和高产率。表4显示了从含有20％H2、65％CO、10％CO2和5％CH4的富含CO的气体，使用杨氏梭菌菌株C-01在直通CSTR(无细胞回收)中生产乙醇的稳态数据。在该表中，GRT指气体保留时间(液体体积对进入的气体流速比)，LRT指液体保留时间(液体体积对液体流速比)，XRT指细胞保留时间(在反应器中细胞度过的平均时间量)。如表4所示，获得17.5-33g/L的乙醇浓度，乙醇产率的范围是14.4-21.1g/L·天。
从不像上述那样富含CO的气体生产乙醇也获得了相似的结果。用于使用杨氏梭菌株C-01而不回收的实验中的气体含有16％H2、27％CO、6％CO2和51％N2，其结果报道于表5。用该气体获得11-26g/L的乙醇浓度，存在2.0-5.0g/L的乙酸作为第二产物。乙醇产率为11.1-20.1g/L·天。*细胞浓度基于表5中的干细胞重量。
最后，表6显示了使用杨氏梭菌株0-52(ATCC登录号55989)，在具有细胞回收的CSTR中转化含有50％H2、45％CO和5％CH4的气体的稳态数据。获得18-23.5g/L的乙醇浓度和3.0-5.7g/L的乙酸浓度。乙醇产率范围是21.1-39.0g/L·天。
实施例10 具有细胞回收和压力的CSTR中的高乙醇产率操作高压AUTOKLAVTM反应器(Buchi)作为具有培养物循环和细胞回收的CSTR，使用杨氏梭菌菌株C-01从CO、CO2和H2生产乙醇。反应器在30psig操作，进料气体含有62％H2、31％CO和5％C2H6。气体保留时间是1.14分钟(大气压基础)，实际气体保留时间是3.5分钟。液体培养基含有过量盐、维生素和痕量金属，以3.6小时的液体保留时间加到600毫升反应器中，pH是4.5，搅拌速率是825rpm。在这些条件下，细胞浓度是8g/L，CO转化是90％，H2转化是40％。产物流含有20g/L乙醇和2.75g/L乙酸。乙醇产率是150g/L·天。
操作另一个高压AUTOKLAVTM反应器(Buchi)作为具有培养物循环和细胞回收的CSTR，使用杨氏梭菌菌株C-01，反应器在6atm(75psig)下操作，进料的合成气体含有55％H2、30％CO、5％CH4和10％CO2。气体保留时间是1分钟(大气压力基础)，实际气体保留时间是6.0分钟。含有过量盐、维生素和痕量金属的液体培养基以1.62小时的液体保留时间加到反应器中。细胞保留时间是24小时，pH是4.5，搅拌速率是800rpm。在这些条件下，细胞浓度是2.0g/L，CO转化是95％，H2转化是60％。产物流含有25g/L乙醇和3g/L乙酸。乙醇产率是369g/L·天。
实施例11 在过量H2存在下从原种培养物起始用来自原种培养物的批量接种起始确保无污染物的健康接种，但作为接种方法并不总是成功的，因为使用的细胞密度太低，尤其是如果方法参数，例如气体速率和搅拌速率在刚接种后上升得太快。
在该实施例中讨论了使用来自原种培养物的批量接种的起始。为了制备用于反应器接种的原种培养物，在150ml血清瓶中，在含有1g/L酵母提取物和1g/L胰蛋白酶的丰富培养基中，盐和维生素中，在CO、CO2和H2下培养杨氏梭菌菌株C-01(ATCC登录号55988)的培养物。使用的维生素浓度是0.4ml/L含有50.5mg/L泛酸钙、20.6mg/L d-生物素和50.6mg/L硫胺HCl的水溶液的培养基。37℃在摇床培养箱中培养瓶。培养物长到对数生长期，如目测确定的。对于每次接种，从血清瓶中转移出约90ml的原种培养物到1升培养基中，代表9％接种体积。下面描述了成功的接种。描绘的方法可重复数次以获得成功接种。
为了获得成功的接种，在含有0.4ml/L维生素和盐的1升批量的基础培养基(表1所述)中加入90ml/L的接种物(t＝0)。搅拌速率是240rpm，pH是5.3，温度是38.5℃，气体保留时间(连续气流)是110分钟。气体进料含有62％H2、31％CO和7％C2H6。13小时(t＝13小时)后，注意到一些CO转化，在t＝23小时时，搅拌速率从240rpm增加到300rpm。气体保留时间在t＝27小时下降到100分钟，在t＝46小时气体保留时间进一步下降。搅拌速率在t＝28小时、59小时、72小时和85小时时也上升100rpm。
到t＝110小时为止，系统用80分钟的气体保留时间和600rpm的搅拌速率操作。细胞浓度是0.5g/L，CO转化是35％。无H2转化，但在批量培养液中有少量乙醇和乙酸(各约1g/L)聚集。直到此时的效果强调了反应器中的细胞生长。
在t＝120hr时以0.4ml/min开始与基础培养基中浓度相同的培养液流动。然后开始气体速率、搅拌速率和培养基速率标定增加的程序，同时小心地将系统维持在过量H2下。在t＝210小时时，乙醇浓度是17g/L，乙酸浓度是1g/L，细胞浓度是1.6g/L，CO转化接近100％，H2转化是90％。乙醇产率达到11.4g/L·天。
再次开始逐渐增加气体速率的程序。进行共存的维生素(见表1)增加将维生素添加速率提高到0.7ml/L培养基。在t＝610小时时，反应器产生20g/L乙醇和约2g/L乙酸。CO转化接近100％，H2转化是85％。乙醇产率达到14g/L·天。
实施例12 用来自现存CSTR的接种物起始从现存CSTR的连续接种起始CSTR快得多，而且比从原种培养物的批量瓶起始更可靠。用来自现存CSTR的连续接种重新开始CSTR，它含有分离的杨氏梭菌菌株C-01(ATCC登录号55988)，它接近停止乙醇生产，产生2-3g/L乙醇，7-8g/L乙酸和约0.3g/L丁醇作为液相产物。
取得接种物的CSTR产生约17g/L乙醇和1-2g/L乙酸，同时以25分钟的气体保留时间、32小时的液体保留时间和650rpm的搅拌速率，38.5℃的温度和pH4.66操作。细胞浓度是1.7g/L，CO转化基本是100％，H2转化是85％。
开始连续接种物加入(t＝0)，此时搅拌速率降到500rpm，气体保留时间定为38分钟。生产反应器的洗脱液(0.5ml/min)作为被接种的CSTR的连续接种物，连续接种进行数小时。在t＝5小时(开始连续接种后5小时)，注意到气体转化，搅拌速率提高到700rpm。连续接种在t＝28小时时停止。气体转化稳定提高，使气体速率稳步上升(气体保留时间下降)，搅拌速率上升到750rpm。在t＝30小时时，CO转化是95％，H2转化是80％。乙醇浓度是13g/L，乙酸浓度是1.5g/L，它稳定在1.4g/L达100小时以上。在此时，乙醇产率是15g/L·天。
实施例13 从严重方法搅乱中恢复由于方法条件中不可预见的变化，例如反应器中的机械问题，一个具有细胞回收，使用杨氏梭菌菌株C-01，连续加入气体和液体营养物并以稳态产生15-35g/L乙醇和0-5g/L乙酸的CSTR(例如实施例1)被搅乱。反应系统的搅乱可能是轻微的，例如气体速率简单提高，导致短期底物抑制，或大的，例如气体速率长期提高，最终导致乙酸产量增加和更严重的分子乙酸产物抑制。
短期搅乱容易改正，仅需重新调节搅乱的参数(例如将气体速率降到原来的水平)，并监测反应器的进程，以确保搅乱未引起长期的问题。
然而乙酸产物抑制是一个更严重的问题。如果由于长期底物抑制、过量营养物加入、CO2累积或许多类型的机械问题，培养物产生过量分子乙酸，必须首先纠正导致过量乙酸的问题。然后通过提高液体速率来从系统中洗去乙酸(和不适宜的乙醇)从系统中清除，迅速导致产物抑制的过量乙酸。一旦乙酸水平低于3-5g/L，重设液体速率，将反应器重新置于过量H2进料，或维生素或钴限制(具有或不具有细胞循环)的情况下。恢复反应器涉及降低气体速率以避免底物抑制和/或搅拌速率，然后洗去细胞和裂解发生。然后提高搅拌速率或气体速率，如实施例1所述。
在一个具体实施例中，具有细胞循环的含杨氏梭菌菌株C-01，从CO、CO2和H2产生乙醇和乙酸的CSTR由于机械问题开始产生乙酸。在2100ml的反应器中以15分钟的气体保留时间加入含有62％H2、31％CO和7％C2H6，以600rpm的搅拌速率操作，pH为4.86。液体保留时间是23小时，细胞保留时间是68小时。B-维生素溶液(50.5mg/l泛酸钙、20.6mg/L d-生物素和50.6mg/L硫胺HCl的水混合物)存在于含有盐和维生素的液体营养培养基中，其中维生素的浓度是0.4ml维生素溶液/升培养基(见表2)。乙醇浓度跌到7g/L，而乙酸浓度升至7g/L，这些条件对于操作反应器不稳定，对于生产乙醇也不经济。细胞浓度是2.4g/L，CO转化是85％，H2转化是25％。
用于恢复反应器的策略包括首先急剧降低对反应器的气体进料速率，然后在过量H2存在下逐渐恢复反应器。对反应器的液体速率不下降以清除该实施例中的产物抑制，因为乙酸浓度并不是很高。相反，利用气体流速的下降和随后在过量H2存在下操作，使乙酸浓度更逐渐的下降到非限制性水平。在下文中讨论了恢复反应器中的特定方案。
关闭细胞循环使气体速率急剧下降70％，到62分钟的气体保留时间，同时仅稍微的将液体保留时间从23小时调节到30小时(t＝0)。不改变培养基中的维生素浓度。随着该气体速率的改变，CO转化上升到98％，H2转化上升到80％。更重要的是系统中存在过量H2，如排出的气体中CO2从19降到5％所证明的。在过量H2开始时，乙酸浓度下降而乙醇浓度上升。在t＝66小时(关闭细胞回收后66小时)，例如，乙酸浓度跌至4g/L，乙醇浓度稍微上升到7.5g/L。
过量H2的存在(和下降的乙醇浓度)允许首先缓慢，然后以较快的速率提高气体速率。在t＝215小时，气体保留是29分钟，乙醇浓度是12g/L，乙酸浓度是3g/L。乙醇产率是8g/L·天。存在于出口的CO2是6％，CO转化是98％，H2转化是80％。t＝315小时，乙醇浓度是16g/L，乙酸浓度是4g/L，也具有良好的气体转化，气体保留时间是20分钟。乙醇产率是11g/L·天。在t＝465小时，乙醇浓度达到20g/L，也存在3.5-4g/L乙酸。乙醇产率是16g/L·天。气体保留时间跌至16分钟，CO和H2转化分别是95％和73％。这些条件对于连续操作维持接近200小时，证明反应系统恢复了其产生乙醇的能力，并基本上保持先前的操作状况。
实施例14 具有CO过度供应的乙醇生产在具有细胞循环的连续高压搅拌罐反应器中进行了一个简单实验，以证明从乙酸生产能到乙醇生产是由于存在高CO浓度。在该实验前，反应器含有杨氏梭菌菌株C-01，在20-25psig的压力，含有57％H2、36％CO和7％C2H6下操作。气体保留时间小于2分钟，液体保留时间是38小时，细胞保留时间是28小时，搅拌速率是600rpm，温度是38℃。在这些条件下，CO转化是可变的，平均是85％，H2转化是可变的，平均是20％。细胞浓度约2.5g/L，产物流含有9g/L乙醇和3g/L乙酸。
作为制备该测试的第一步，增加气体保留时间，以确保不存在过量CO。压力维持在23-24psig。使pH长时间继续足以确保在4.5-4.6的正常操作范围内是稳定的。然后将纯CO与常规进料气体混合，得到47％H2、47％CO和6％C2H6的气体进料，气体保留时间是2.3分钟。然后随时间监测反应器pH、排出的气体成分和产物流。
表7显示在系统中加入过量CO后随时间的pH改变和产物成分。加入CO后30分钟，反应器pH提高到5.25，培养物从1.54g./L(0.0257mole/L)乙酸变为1.12g/L(0.0243mole/L)乙醇。出现pH提高是由于游离乙酸转为乙醇的结果。伴随该变化是CO转化从91％降到71％。在培养物循环速率从0.4gpm降到0.15gpm时，反应器pH下降，但保持乙醇和乙酸浓度。
CO引入50分钟后，乙醇浓度是11.29g/L，乙酸浓度是1.75g/L。此时，过量CO停止，乙醇浓度和pH开始下降，乙酸浓度开始上升。pH的下降是由于乙醇被转化成分子乙酸。因此通过过量供应CO使乙醇-乙酸转变是可逆的。
实施例15 使乙酸生产最小化的水回收在蒸馏回收乙醇后将水再循环回到发酵生物反应器中，主要是使洗脱液产生最小化，并使反应器的乙醇产率最大化，并限制乙酸产生。已发现蒸馏对于将反应器获得的15-35g/L乙醇浓缩成95％乙醇是最经济的方法。然后用分子筛吸附进一步将乙醇浓缩成所需的浓度。在进行蒸馏中，产生95％的乙醇水溶液作为塔顶馏出物。水在蒸馏过程中作为塔底产物产生。塔底产物含有发酵过程中产生的来自反应器的乙酸(3-5g/L乙酸)和发酵过程中未用尽或被蒸馏的热量破坏的任何营养物，例如痕量金属和其它矿物。营养物的循环使洗脱液的量最小化，必须处理，同时营养物的量也必须随后加到发酵生物反应器中。乙酸的循环通过在乙醇和乙酸之间建立平衡，防止形成更多的乙酸。因此，没有纯乙酸随着水循环产生。循环多于3-5g/L的乙酸可导致反应器中的乙酸抑制。因此，作为含有乙酸循环的水的结果，底物CO、CO2和H2可转化成作为唯一产物的乙醇。
表8显示了含有50％CO、45％H2和5％CH4的气体发酵的结果；使用杨氏梭菌菌株0-52和水循环。在这些实验中，用于细胞循环的空心纤维过滤的渗透液被送去蒸馏。除去乙醇后，用0.2微米滤膜过滤水，除去任何沉淀的副产物。循环的水组分相对于加到反应器中的总的水(作为介质)在这些实验中是25％-100％。用100％水循环的实验持续接近500小时或约20个液体保留时间。如使用100％水循环的结果注意到的，未产生纯乙酸。事实上，少量乙酸最终被消耗。乙醇产率是12-27g/L·天。
实施例16 在生长阶段用泛酸盐进料的二阶段CSTR系统加到生长阶段的准确泛酸盐进料是一个必须优化的变量。实施例11和12描述了用杨氏梭菌株C-01的生长阶段反应器的典型结果，除了在该反应器中可能产生稍多一点的乙酸，因为在生长阶段加入了额外的泛酸盐或钴以确保健康和稳定的培养。使用的维生素浓度是0.7-0.8ml/L培养基，该培养基是含有50.5mg/L泛酸钙、20.6mg/L d-生物素和50.6mg/L硫胺HCl的水溶液。具有细胞回收的生产阶段CSTR中加入来自生长阶段反应器的流出液，并产生乙醇作为主要产物。加到该反应器中的泛酸盐浓度比生长阶段中低得多，仅0.1-0.2ml总维生素/L培养基，该培养基是含50.5mg/L泛酸钙、20.6mg/L d-生物素和50.6mg/L硫胺HCl的水溶液。生产阶段中的气体保留时间是11-30分钟，液体保留时间是约20小时，细胞保留时间是30-50小时，搅拌速率是800-900rpm。pH是5.0，温度是38℃。一旦反应器达到稳态，气体保留时间维持在11分钟，液体保留时间定于19小时，细胞保留时间维持在37小时，搅拌速率为900rpm。CO转化平均为96％，H2转化平均为60％。乙醇浓度稳定在25-30g/L，还存在约3g/L乙酸。乙醇产率是31.6-37.9g/L·天。
实施例17 调节发酵参数以避免对低限制性泛酸钙适应通过调节发酵参数(气体速率、液体速率、搅拌速率、H2分压)，同时避免营养物中的大改变，但仍然维持相对恒定的营养物进料浓度，以避免发酵生物反应器中的培养物对于低限制性泛酸钙浓度的适应。
在实验室New Brunswick Scientific Bioflo CSTR的起始过程中，杨氏梭菌菌株C-01中加入了对培养物提供营养必须的含有维生素、痕量矿物和盐的液体营养流。营养培养基中的泛酸盐浓度是20微克/升，当与培养物进料的缓慢速度联合时，该浓度确保每克产生的细胞中有100微克以上的泛酸钙进料(过量的泛酸盐)，因为生物反应器中细胞产生少。类似的，培养基中的钴浓度是1ppm，一种确保钴过量存在的浓度。相反，通过加入不含CO2、含63.3％H2、31.4％CO和5.3％C2H6的气体，使排出的气体中的H2分压维持高于0.55大气压，从而得到H2进料/(2CO转化+3CO2转化)的比大于1，并通过仔细调节气体进料速率和搅拌速率，以实现95％以上的CO转化，和大于80％的H2转化。随时间达到这些高转化，细胞浓度从最初接近0g/L的水平达到约1.5g/L。
由于泛酸盐浓度在该起始阶段中维持恒定，每克产生的细胞的泛酸盐微克数逐渐下降，直到小于1.5微克泛酸盐/g产生的细胞，该条件为泛酸盐限制。系统因此变成泛酸盐限制。通过过量的H2在整个起始阶段获得高乙醇/乙酸产物比。另外，在起始的早期阶段使反应器产生乙酸，随后在泛酸盐限制的控制下获得该产物比。
实施例18 对反应器限制钴在从CO、CO2和H2生产乙酸的过程中，对杨氏梭菌菌株ERI2供给62-3500微克钴/g产生的细胞，该条件是反应器不限制钴(或任何其它限制，除了对培养物转移气体的能力)，在产物流中未发现乙醇。在限制钴用于从CO、CO2和H2产生乙醇的过程中，对杨氏梭菌菌株C-01供给33-48微克钴/g产生的细胞，同时维持所有其它营养物过量。在这些条件下，菌株C-01产生18-26g/L乙醇和约4g/L乙酸。
实施例19 避免对低限制性钴浓度的适应通过调节发酵参数(气体速率、液体速率、搅拌速率、CO2含量)避免对低限制性钴浓度的适应，同时避免营养物中的大改变，但维持相对恒定的营养物进料浓度，如下。
在实验室New Brunswick Scientific Bioflo CSTR过程中，杨氏梭菌菌株C-01中加入了对培养物提供营养必需的含有维生素、痕量矿物和盐的液体营养流。营养培养基中的钴浓度是75ppb，当与培养物进料的缓慢速度联合时，该浓度确保每克产生的细胞中有50微克以上的钴进料(过量的钴)，因为生物反应器中细胞产生少。类似的，培养基中的泛酸盐浓度是20微克/升，一种确保泛酸盐过量存在的浓度。相反，通过加入含大量H2，不含CO2的气体，使排出的气体中的H2分压维持高于0.55大气压，并通过仔细调节气体进料速率和搅拌速率，以实现95％以上的CO转化，和大于80％的H2转化。随时间达到这些高转化，细胞浓度从最初接近0g/L的水平达到约1.5g/L。由于钴浓度在该起始阶段中维持恒定，每克产生的细胞的钴微克数逐渐下降，直到小于50微克钴/g产生的细胞，该条件为钴限制。系统因此变成钴限制。通过过量的H2在整个起始阶段获得高乙醇产量。另外，在起始的早期阶段使反应器产生乙酸，随后在泛酸盐限制的控制下获得产物比。
实施例20 过度供应氢在操作实验室AUTOKLAVTM反应器(Buchi)作为具有液体再循环和细胞循环的CSTR过程中，用必需的过量维生素、痕量矿物和盐操作杨氏梭菌对培养物提供营养。用存在于进料气体中的过量H2操作反应器，使得H2进料的摩尔数对于转化的CO摩尔数的两倍与转化的CO2摩尔数的三倍之和的比值是5.67。如果该比值不大于1.0，反应器中不能存在过量的H2，由于过量H2存在而产生乙醇不可能发生。另外，排出的气体中H2分压是2.61atm，该水平超过了由于过量H2产生乙醇的0.4atm的要求。最后，H2分压对于CO2分压在排出的气体中的比例是10.88，该水平大于3.0，确保了存在足够的H2，以利用所有可得到的碳。在这些条件下，反应器产生接近26g/L乙醇和3g/L以下乙酸。乙醇的产率大于200g/L·天。如果不符合上述任何条件，反应器不会由于过量H2存在产生乙醇。H2富集的另一个方面是它通过氢化酶的氧化产生额外的还原的铁氧还蛋白。
实施例21 减轻CO底物抑制在800rpm的搅拌速率操作的实验室New Brunswick Scientific Bioflo CSTR显示了10％的输出CO浓度，但先前操作时在气体输出中仅有5％CO。通过将搅拌速率降到600rpm，消除了CO抑制，输出的CO浓度回到5％。这导致H2摄取增加，这是有效利用所有加到反应器中的气体的必需条件。
实施例22 质量传递作为导致乙醇生产的过量质量传递的例子，考虑具有细胞循环的实验室CSTR，它含有杨氏梭菌菌株ERI2，在没有营养物限制或在进料气体中没有过量H2或Co的情况下操作。即，泛酸盐以100微克以上的泛酸钙/g产生的细胞进料，钴以100微克以上/g产生的细胞进料。H2在输出气体中以约0.2atm存在，比CO摄取率小于0.3mmolCO/g细胞·分钟。搅拌速率是800rpm。在这些条件下，培养物仅产生乙酸(在产物流中不存在乙醇)。如果搅拌速率快速增加到900rpm，或气体速率增加约10％，在产物流中观察到乙醇，直到细胞浓度增加，以吸收气体或直到培养物由于底物抑制而死亡。
实施例23 控制乙酸产物抑制在产生8g/L乙酸和10g/L乙醇的实验室CSTR中，对于36小时的时间段，液体保留时间从24小时下降到12小时，尝试从反应器洗去过量乙酸，它限制培养物产生更多乙醇的能力。所有其它反应器操作和营养条件维持不变。在这段时间后，液体保留时间回到24小时，得到含有3g/L乙酸和15-25g/L乙醇的产物流。需要几次减少液体保留时间的尝试，以清除产物抑制。另外，在气体进料中加入H2，以实现过量H2控制，因为过量的CO2也可以导致乙酸生产有利于乙醇。这些修改防止产生过量乙酸，因此防止差的产物比和低乙醇生产率。其后，重新在进料气体中使用过量H2或限制液相营养浓度。
实施例24 过量供应一氧化碳当供给过量营养物(过量的泛酸盐和钴)，在进料气体中没有丰富的H2时，杨氏梭菌菌株ERI2具有0.23-0.48mmol/g·分钟的比CO摄取率，在产物流中未发现乙醇。然而当类似的供给杨氏梭菌菌株C-01过量营养物，而进料气体中没有丰富的H2，但在过量供应CO导致乙醇产生的条件下时，比CO摄取率是0.67-1.34mmol/g·min。在这些条件下，培养物产生9.9-12.0g/L乙醇和2.6-2.7g/L乙酸。
实施例25 用细胞清除控制产物比在利用杨氏梭菌菌株C-01，具有细胞循环(细胞保留时间＝40小时，液体保留时间＝6小时)的CSTR(pH＝5.0，温度＝38℃，压力＝20psig)中发生气相底物(30％CO、15％H2、10％CO2、45％N2)发酵，培养物的生长不受钴、泛酸钙或任何其它营养物的限制。随着培养物生长，获得的细胞密度为比摄取(mmolCO/g干细胞·分钟)低于0.5，产生的乙酸优于乙醇。为了防止这发生，提高细胞清除速率以防止细胞密度上升，从而使细胞保持低的稳定浓度，足以维持高于0.5mmolCO/g干细胞·分钟的比摄取。藉此，细胞保留时间下降到6-25小时之间。
表1 乙醇生产培养基
aMPFN痕量矿物含有(每升溶液)10ml 85％H3PO4、0.10gZnSO4·7H2O、0.03gMnCl2·4H2O、0.3gH3BO3、0.20gCoCl2·6H2O、0.02gCuCl2·H2O、0.04gNiCl2·6H2O、0.03g NaMoO4·2H2O、2.00g FeCl2·4H2O、0.01g Na2SeO3和0.10g Na2WO4·2H2O。
b维生素溶液含有20.6mg/L d-生物素、50.6mg/L硫胺HCl和50.5mg/L d-泛酸，钙盐。
c从接种时的0.3-0.5ml显著地变到高气体速率时的0.7-0.8ml。
表2 控制方法的例子用的方法参数和结果的总结比较
表3 杨氏梭菌菌株产物改变的总结
*基于细胞干重表4 用杨氏梭菌菌株C-01将富含CO的气体转化成乙醇的稳态数据
表5 用杨氏梭菌菌株C-01将含有27％CO、16％H2、51％N2的气体转化为乙醇的稳态数据(无细胞循环)
表6 用分离物0-52在具有细胞循环的CSTR中将含50％H2、45％CO和5％CH4的气体转化为乙醇的稳态数据
*基于细胞干重表7 在过量CO存在下，乙酸转变为乙醇的pH和液体样品分析
*基于细胞干重。
表8 具有细胞和水循环的分离物0-52的气体发酵数据
*基于细胞干重。
所有出版的文献在此引入以供参考。在上述说明书中包括了许多本发明的修改和变化，预计它们对于本领域技术人员是明显的。相信对于本发明的组合物和方法的这些修改和变化包括在权利要求的范围中。
权利要求
1.一种从气相底物的厌氧菌发酵产生乙醇的稳定连续方法，其特征在于，该方法包括在发酵生物反应器中的液体营养培养基中培养厌氧产乙酸菌，并对所述生物反应器提供含有至少一种选自CO和H2的还原性气体的气相底物；和细菌在生物反应器中达到稳定的细胞浓度后，通过在发酵液中减低氧化还原电势，或提高NAD(P)H对NAD(P)比，而操作所述生物反应器中的所述细菌，其中所述生物反应器中的游离乙酸浓度小于5g/L游离酸，所述培养和操作步骤导致所述生物反应器中的所述细菌在发酵液中以高于每天10g/L的产率产生乙醇，其中在所述发酵液中产生的乙醇和乙酸的乙醇对乙酸比是1∶1-20∶1。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述发酵生物反应器含有生长反应器，它将所述发酵液加到第二个发酵生物反应器中，并在第二个发酵生物反应器中产生大部分所述乙醇。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，该方法还包括从所述生物反应器移去所述发酵液，从所述发酵液蒸馏乙醇并回收所述乙醇的步骤。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，该方法还包括将来自所述蒸馏步骤的含有乙酸的水循环回到生物反应器中。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述细菌选自伍氏醋酸杆菌、食甲基丁酸杆菌、醋酸梭菌、丙酮丁酸梭菌、热醋酸梭菌、粘液真杆菌、杨氏梭菌和产生消化链球菌。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述杨氏梭菌选自PETC、ERI2、O-52和C-01菌株。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述气相底物选自(a)一氧化碳、(b)一氧化碳和氢气、(c)二氧化碳和氢气、和(d)一氧化碳、二氧化碳和氢气。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述底物还含有氮气或甲烷。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述操作步骤还包括改变至少一个参数，所述参数选自营养培养基含量、营养物进料速率、水相进料速率、操作压力、操作pH、气相底物浓度、气相进料速率、发酵液搅拌速率、产物抑制步骤、细胞密度底物抑制及其组合。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述操作步骤包括将所述培养物的pH提高到4.5以上。
11.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述操作步骤包括定期从所述生物反应器清除细菌细胞，使细胞浓度小于利用所述生物反应器中的全部还原性气体或营养底物的所述稳定浓度。
12.如权利要求9所述的方法，其特征在于，该方法包括当存在于发酵液中的乙酸的游离乙酸部分超过2g/L时，提高水相进料速率，从而抑制所述游离乙酸浓度的不利提高。
13.如权利要求9所述的方法，其特征在于，该方法包括降低所述气相底物进料速度，以除去过量一氧化碳，以缓解底物抑制和维持所述生产率。
14.如权利要求9所述的方法，其特征在于，降低所述搅拌速率，以除去过量一氧化碳，以缓解底物抑制并维持所述生产率。
15.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述操作步骤包括对所述生物反应器以0.3-2mmol CO/克所述生物反应器中的细菌干细胞/分钟的速率提供所述含有还原性气体一氧化碳的气相底物。
16.如权利要求15所述的方法，其特征在于，存在于所述生物反应器中的所述CO量，大于将所述细菌维持在完全利用所提供的CO的稳定细菌浓度所需的量。
17.如权利要求15所述的方法，其特征在于，存在于所述生物反应器中的所述CO量维持乙醇生产优先于乙酸生产。
18.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述速率在0.5-1.5mmol CO/克所述生物反应器中的细菌干细胞/分钟。
19.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述气相底物还含有相对于所述一氧化碳过量的还原性氢气，其中所述过量的氢气导致所述细菌在所述发酵液中产生高的乙醇对乙酸比。
20.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述操作步骤包括在所述发酵生物反应器中加入所述营养培养基，所述营养培养基含有0.5-50微克泛酸钙/克所述生物反应器中产生的细菌干细胞。
21.如权利要求20所述的方法，其特征在于，所述泛酸钙的量少于将所需细菌维持在完全利用所提供的泛酸钙的稳定细菌浓度所需的量。
22.如权利要求20所述的方法，其特征在于，所述泛酸钙的量维持乙醇生产优先于乙酸生产。
23.如权利要求20所述的方法，其特征在于，所述量是1-25微克泛酸钙/克产生的细菌干细胞。
24.如权利要求20所述的方法，其特征在于，所述量是2-25微克泛酸钙/克产生的细菌干细胞。
25.如权利要求20所述的方法，其特征在于，该方法还包括步骤通过维持恒定的泛酸钙浓度并调节选自气体速率、液体速率、搅拌速率和氢气分压的参数，防止所述生物反应器中的所述细菌对所述泛酸钙的量适应。
26.如权利要求20所述的方法，其特征在于，该方法还包括在提供所述量的泛酸钙之前，对所述生物反应器提供过量的还原性氢气。
27.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述操作步骤包括在所述发酵生物反应器中加入所述营养培养基，所述营养培养基含有5-100微克钴/克所述生物反应器中产生的细菌干细胞。
28.如权利要求27所述的方法，其特征在于，所述钴的量少于将所需细菌维持在完全利用所提供的钴的稳定细菌浓度所需的量。
29.如权利要求27所述的方法，其特征在于，所述钴的量维持乙醇生产优先于乙酸生产。
30.如权利要求27所述的方法，其特征在于，所述量是20-50微克钴/克产生的细菌干细胞。
31.如权利要求27所述的方法，其特征在于，该方法还包括步骤通过维持恒定的钴浓度并调节选自气体速率、液体速率、搅拌速率和氢气分压的参数，防止所述生物反应器中的所述细菌对所述钴的量适应。
全文摘要
一种从厌氧菌发酵含有至少一种还原性气体的气相底物生产乙醇的稳定连续方法，涉及培养发酵生物反应器中液相营养培养基中的厌氧、产乙酸菌；对生物反应器提供气相底物；和细菌在生物反应器中达到稳态和稳定的细胞浓度后，通过在发酵液中减少氧化还原电势，或提高NAD(P)H对NAD(P)比来操作生物反应器中的细菌。生物反应器中的游离乙酸浓度维持在小于5g/L游离酸。该方法在生物反应器的发酵液中每天能产生大于10g/L产率的乙醇。产生的乙醇对乙酸比是1∶1－20∶1。
文档编号C12R1/02GK1444658SQ01813372
公开日2003年9月24日 申请日期2001年7月23日 优先权日2000年7月25日
发明者J·L·加迪, D·K·阿罗拉, 柯庆桓, J·R·菲利浦斯, R·巴苏, C·V·维克斯特姆, E·C·克劳森 申请人:生物工程资源股份有限公司