专利名称：新型治疗分子变体及其用途的制作方法
技术领域：
一般而言，本发明涉及展示催化活性降低的鞘氨醇激酶变体及其衍生物、类似物、化学等同物和模拟物；具体而言，本发明涉及展示将鞘氨醇磷酸化成鞘氨醇-1-磷酸的能力降低的鞘氨醇激酶变体。本发明还包括编码所述鞘氨醇激酶变体及其衍生物、类似物和模拟物的遗传序列。本发明的变体可用于广泛的治疗和预防应用。
背景技术：
作者在本说明书中提及的发表物的文献详情集中在描述的结尾。
本说明书对任何现有技术的提及并非承认或以任何形式暗示在澳大利亚现有技术构成普通常识的一部分，而且也不应当这样认为。
鞘氨醇激酶是多种细胞应答中的关键调控酶。已知鞘氨醇-1-磷酸是信号传导中重要的第二信使(Meyer等人，1997)。它在多种细胞类型中促进有丝分裂(Alessenko，1998)，而且似乎触发广泛的重要调控途径，包括防止由神经酰胺诱导的凋亡(Culliver等人，1996)、通过不依赖IP3的途径动员胞内钙、刺激DNA合成、激活促分裂原活化蛋白(MAP)激酶途径、激活磷脂酶D、和调控细胞动力(回顾可参阅Meyer等人，1997；Spiegal等人，1998；Igarashi，1997)。
最近的研究(Xia等人，1998)显示，鞘氨醇-1-磷酸是血管内皮细胞针对肿瘤坏死因子-α(TNFα)的炎症应答中的专性信号中间物。尽管它显然很重要，然而对控制细胞鞘氨醇-1-磷酸水平的机制知道得很少。已知细胞中的鞘氨醇-1-磷酸水平在很大程度上受到在鞘氨醇激酶作用下由鞘氨醇形成鞘氨醇-1-磷酸的介导，而且在较小程度上受到它在内质网相关鞘氨醇-1-磷酸裂解酶和鞘氨醇-1-磷酸磷酸酶的作用下发生的降解的介导(Spiegel等人，1998)。细胞中的鞘氨醇-1-磷酸基础水平通常较低，但是当细胞暴露于促有丝分裂剂时能够快速且短暂升高。这种应答似乎与胞质中鞘氨醇激酶活性升高有关，而且能够通过添加鞘氨醇激酶抑制分子N，N-二甲基鞘氨醇和DL-苏型-二氢鞘氨醇(DL-threo-dihydrosphingosine)来防止。这说明鞘氨醇激酶是负责调控细胞鞘氨醇-1-磷酸水平的重要分子。这将鞘氨醇激酶置于在细胞中介导可归于鞘氨醇-1-磷酸的效应的中枢和专性作用的地位。
推测鞘氨醇激酶在许多细胞活动中发挥作用，包括炎症、钙动员、细胞活力和粘附分子表达。因此，需要发展通过调控鞘氨醇激酶信号途径来调控这些细胞活动的机制。
在通向本发明的工作中，发明人判定，在由人鞘氨醇激酶蛋白质第16-153位氨基酸定义的氨基酸区域中导入氨基酸序列突变会导致鞘氨醇激酶变体的生成，该变体除了不展示鞘氨醇激酶基线功能活性之外，还遏制野生型鞘氨醇激酶分子的激活。因此，本发明的鞘氨醇激酶变体既提供了用于调控鞘氨醇激酶信号途径功能的新型分子，又推动了用于有效突变野生型鞘氨醇激酶分子或模拟鞘氨醇激酶变体分子活性的试剂的筛选和/或合理分析、设计和/或修饰。
发明概述贯穿本说明书和随后的权利要求书，除非文章另有要求，词语“包含”应理解为意谓包括所述整数或步骤或者一组整数或步骤，但不排除任何其它整数或步骤或者一组整数或步骤。
氨基酸序列中的具体突变在本文中表述为“Xaa1nXaa2”，其中Xaa1指突变前的原始氨基酸残基，n指残基编号，而Xaa2指突变后的氨基酸。缩写“Xaa”可以是三字母或单字母氨基酸代码。单字母代码的突变表述为例如X1nX2，其中X1和X2分别与Xaa1和Xaa2相同。鞘氨醇激酶氨基酸残基的编号以基序Asp Gly Leu Met(DGLM)中的甘氨酸残基为残基编号82。
本说明书包含使用程序PatentIn 2.0版准备的核苷酸和氨基酸序列信息，在本文中呈现于参考文献之后。在序列表中通过数字指示符<210>及随后的序列标识符(如<210>1、<210>2、等)识别了每一种核苷酸或氨基酸序列。分别通过在数字指示符域<211>、<212>和<213>中提供的信息说明了每一种核苷酸或氨基酸序列的长度、序列类型(DNA、蛋白质(PRT)、等)和生物体来源。通过在数字指示符域<400>及随后的序列标识符(如<400>1、<400>2、等)中提供的信息定义了本说明书中提及的核苷酸和氨基酸序列。
本发明的一个方面致力于在由第16-153位氨基酸确定的区域或功能等同区域中包含突变的鞘氨醇激酶变体或所述鞘氨醇激酶变体的衍生物、同系物、类似物、化学等同物或模拟物，其中所述变体展示催化活性相对于野生型鞘氨醇激酶而消除或降低。
本发明的另一个方面提供了在由第16-153位氨基酸确定的区域或功能等同区域中包含突变的人鞘氨醇激酶变体或所述鞘氨醇激酶变体的衍生物、同系物、类似物、化学等同物或模拟物，其中所述变体展示催化活性相对于野生型人鞘氨醇激酶而消除或降低。
在一个优选的实施方案中，提供了包含在由第16-153位氨基酸确定的区域或功能等同区域中具有单个或多个氨基酸替代、添加和/或删除的氨基酸序列的人鞘氨醇激酶变体或所述鞘氨醇激酶变体的衍生物、同系物、类似物、化学等同物或模拟物，其中所述变体展示催化活性相对于野生型鞘氨醇激酶而消除或降低。
在还有一个更优选的实施方案中，提供了包含在由第70-90位、更优选第79-84位氨基酸确定的区域或功能等同区域中具有单个或多个氨基酸替代、添加和/或删除的氨基酸序列的人鞘氨醇激酶变体或所述鞘氨醇激酶变体的衍生物、同系物、类似物、化学等同物或模拟物，其中所述变体展示催化活性相对于野生型鞘氨醇激酶而消除或降低。
在另一个优选的实施方案中，提供了包含在由第16-153位氨基酸确定的区域或功能等同区域中具有单个或多个氨基酸替代、添加和/或删除的氨基酸序列的人鞘氨醇激酶变体或所述鞘氨醇激酶变体的衍生物、同系物、类似物、化学等同物或模拟物，其中所述变体展示催化活性相对于野生型鞘氨醇激酶而消除。
在一个最优选的实施方案中，目的鞘氨醇激酶变体包含选自下表的一处或多处氨基酸替代(i) G82D(ii) Gg2A(iii) G26D(iv) S79D(v) G80D(vi) K103A(vii) G111D(viii)G113D(ix) G26A(x) K27A(xi) K29A(xii) S79A(xiii)G80A(xiv) K103R(xv) G111A本发明的另一个方面致力于在ATP结合位点区域或功能等同区域中包含突变的鞘氨醇激酶变体或所述鞘氨醇激酶变体的衍生物、同系物、类似物、化学等同物或模拟物，其中所述变体展示催化活性相对于野生型鞘氨醇激酶而消除或降低。
本发明的另一个方面致力于选自下表的分离核酸分子1)包含编码鞘氨醇激酶变体或其衍生物、同系物、类似物、化学等同物或模拟物的核苷酸序列或其互补序列的分离核酸分子或其衍生物或等同物，所述变体在由第16-153位氨基酸确定的区域或功能等同区域中包含突变，其中所述变体展示催化活性相对于野生型鞘氨醇激酶而消除或降低。
2)包含编码人鞘氨醇激酶变体或其衍生物、同系物、类似物、化学等同物或模拟物的核苷酸序列或其互补序列的分离核酸分子或其衍生物或等同物，所述变体在由第16-153位氨基酸确定的区域或功能等同区域中包含突变，其中所述变体展示催化活性相对于野生型人鞘氨醇激酶而消除或降低。
3)包含编码人鞘氨醇激酶变体或其衍生物、同系物、类似物、化学等同物或模拟物的核苷酸序列或其互补序列的分离核酸分子或其衍生物或等同物，所述变体包含在由第16-153位氨基酸确定的区域或功能等同区域中具有单个或多个氨基酸替代、添加和/或删除的氨基酸序列，其中所述变体展示催化活性相对于野生型鞘氨醇激酶而消除或降低。
4)包含编码人鞘氨醇激酶变体或其衍生物、同系物、类似物、化学等同物或模拟物的核苷酸序列或其互补序列的分离核酸分子或其衍生物或等同物，所述变体包含在由第70-90位氨基酸确定的区域或功能等同区域中具有单个或多个氨基酸替代、添加和/或删除的氨基酸序列，其中所述变体展示催化活性相对于野生型鞘氨醇激酶而消除或降低。
5)包含编码人鞘氨醇激酶变体或其衍生物、同系物、类似物、化学等同物或模拟物的核苷酸序列或其互补序列的分离核酸分子或其衍生物或等同物，所述变体包含在由第79-84位氨基酸确定的区域或功能等同区域中具有单个或多个氨基酸替代、添加和/或删除的氨基酸序列，其中所述变体展示催化活性相对于野生型鞘氨醇激酶而消除或降低。
6)包含编码鞘氨醇激酶变体或其衍生物、同系物、类似物、化学等同物或模拟物的核苷酸序列或其互补序列的分离核酸分子或其衍生物或等同物，所述变体包含选自下表的一处或多处氨基酸替代(1)G82D(2)G82A(3)G26D(4)S79D(5)G80D
(6) K103A(7) G111D(8) G113D(9) G26A(10) K27A(11) K29A(12) S79A(13) G80A(14) K103R(15) G111A7)包含编码鞘氨醇激酶变体或其衍生物、同系物、类似物、化学等同物或模拟物的核苷酸序列或其互补序列的分离核酸分子或其衍生物或类似物，所述变体在ATP结合位点区域或功能等同区域中包含突变，其中所述变体展示催化活性相对于野生型鞘氨醇激酶而消除或降低。
因此，本发明的另一个方面提供了用于检测能够调控FOSK与鞘氨醇激酶或其功能等同物或衍生物的相互作用的试剂的方法，所述方法包括使包含所述鞘氨醇激酶和FOSK或其功能等同物或衍生物的细胞或其提取物接触推定试剂，并检测与所述相互作用有关的表达表型的改变。
本发明的还有一个方面提供了用于检测能够结合或以其它方式联合由第16-153位氨基酸定义的鞘氨醇激酶区域或其功能等同物或衍生物的试剂的方法，所述方法包括使包含所述氨基酸区域或其功能等同物或衍生物的细胞接触推定试剂，并检测与鞘氨醇激酶或其功能等同物或衍生物的功能调控有关的表达表型的改变。
因此，本发明的另一个方面致力于用于分析、设计和/或修饰能够与由第16-153位氨基酸定义的鞘氨醇激酶区域或其衍生物相互作用并调控与所述鞘氨醇激酶有关的至少一种功能活性的试剂的方法，所述方法包括使所述鞘氨醇激酶或其衍生物接触推定试剂，并评估所述试剂与所述结合位点相互作用的互补性程度。
在一个相关方面中，本发明应当理解为延伸至使用上文定义的任何方法鉴定的试剂。在这个方面中，提及试剂时应当理解为提及能够调控至少一种鞘氨醇激酶功能活性的任何蛋白质性质或非蛋白质性质分子。
本发明的另一个方面包括用于在哺乳动物中调控细胞功能活性的方法，所述方法包括在足以抑制、降低或下调野生型鞘氨醇激酶的至少一种功能活性的时间和条件下对所述哺乳动物施用有效量的上文定义的鞘氨醇激酶变体或试剂。
本发明的另一个方面涉及哺乳动物中特征为异常的、不需要的或不适当的细胞活动的状况的治疗和/或预防，所述方法包括在足以抑制、降低或下调野生型鞘氨醇激酶的至少一种功能活性的时间和条件下对所述哺乳动物施用有效量的上文定义的鞘氨醇激酶变体或试剂，其中所述下调导致对细胞功能活性的调控。
本发明的另一个方面涉及上文定义的鞘氨醇激酶变体或试剂在制造用于调控细胞功能活性的药物中的用途。
本发明的另一个方面涉及用于调控细胞功能活性的上文定义的鞘氨醇激酶变体或试剂。
在还有一个方面中，本发明包括包含上文定义的鞘氨醇激酶变体或试剂以及一种或多种制药学可接受载体和/或稀释剂的药物组合物。
表1定义了贯穿本说明书所用的单字母和三字母缩写。
表1单字母和三字母氨基酸缩写氨基酸 三字母缩写 单字母符号丙氨酸 Ala A精氨酸 Arg R天冬酰胺 Asn N天冬氨酸 Asp D半胱氨酸 Cys C谷氨酰胺 Gln Q谷氨酸 Glu E甘氨酸 Gly G组氨酸 His H异亮氨酸 Ile I亮氨酸 Leu L赖氨酸 Lys K甲硫氨酸 Met M苯丙氨酸 Phe F脯氨酸 Pro P丝氨酸 Ser S苏氨酸 Thr T色氨酸 Trp W酪氨酸 Tyr Y缬氨酸 Val V任何残基 Xaa X图的简述
图1是一些二酰甘油激酶与鞘氨醇激酶的推定催化结构域的序列比对的示意图。突出了二酰甘油激酶推定催化结构域中的高度保守残基。标记(●)残基指示了这三种二酰甘油激酶中诱变(Gly→Asp)后将消除催化活性的位点。
图2是人鞘氨醇激酶的定点诱变的示意图和图像。收获经pcDNA3-SK、pcDNA3-G26DSK、pcDNA3-S79DSK、pcDNA3-G80DSK、pcDNA3-G82DSK、pcDNA3-K103ASK、pcDNA3-G111DSK、pcDNA3-G113DSK或空pcDNA3载体转染的HEK293细胞，并分析(A)蛋白质表达水平(使用M2抗FLAG抗体通过Western印迹进行)和(B)鞘氨醇激酶活性。
图3是演示G82D SK在HEK293细胞中的表达阻断将TNFα、PMA和IL-1对内源鞘氨醇激酶活性的激活的示意图。将经pcDNA3-G82DSK或空pcDNA3载体转染的HEK293细胞用1ng/ml TNFα和100U/ml IL-1处理10分钟和用100ng/ml PMA处理30分钟。
图4是TNFα在表达G82D SK的HEK293细胞中鞘氨醇激酶激活的时程的示意图。用1ng/ml TNFα处理经pcDNA3-G82DSK或空pcDNA3载体转染的HEK293细胞。在45分钟的TNFα处理过程中在不同时间收获细胞，并对细胞裂解物测定鞘氨醇激酶活性。
图5是演示G82D SK在HEK293细胞中的表达将降低TNFα对过度表达的野生型鞘氨醇激酶活性的激活的示意图。将经pcDNA3-SK转染或经等比例pcDNA3-SK与pcDNA3-G82DSK共转染的HEK293细胞用1ng/ml TNFα处理10分钟。然后收获细胞并测定细胞裂解物中的SK活性。
图6是显示G82D SK在3T3成纤维细胞中的表达会抑制癌基因Ras激活SK的示意图。
图7是显示G82D SK在HEK293细胞中的表达不影响TNFα或PMA激活蛋白激酶C活性的示意图。
图8是演示G82D SK在HEK293细胞中的表达不抑制TNF激活鞘磷脂酶的图像。
图9是演示G82D SK在HEK293细胞中的表达会防止TNFα激活ERK的示意图。
图10是依照本发明的开发能够鉴定和/或开发的各类药物的示意图。
图11是演示G82D SK抑制Ras转化的示意图。A.用V12-Ras、v-Src或V12-Ras+G82D-SK转染NIH 3T3细胞，并在转染后48小时测量SphK活性。B.在经V12-Ras、v-Src、SphK或V12-Ras+G82D-SK转染的NIH 3T3细胞中在缺乏或存在DMS(2.5μM)时经两周进行转化灶形成测定。
图12显示了人鞘氨醇激酶的定点诱变。收获经pcDNA3-SKWT、pcDNA3-SKG82D、pcDNA3-SKG82A或空pcDNA3载体转染的HEK293T细胞，并分析(A)蛋白质表达水平(使用MT抗FLAG抗体通过Western印迹进行)和(B)鞘氨醇激酶活性。
图13显示了(A)hSKWT和(B)hSKG82A的ATP动力学分析。分别对hSKWT和hSKG82A进行浓度范围0-2mM和0-40mM的ATP动力学分析。鞘氨醇的浓度在这两种情况中都是100μM。
图14显示了(A)hSKWT和(B)hSKG82A的鞘氨醇动力学分析。对hSKWT和hSKG82A都进行浓度范围0-2mM的鞘氨醇动力学分析。ATP的浓度在hSKWT和hSKG82A中分别是1mM和40mM。
图15是人鞘氨醇激酶的定点诱变的示意图。收获经空pcDNA3载体、pcDNA3-SKWT或pcDNA3-突变型hSK转染的HEK293T细胞，并分析鞘氨醇激酶活性。
发明详述可以通过在由第16-153位氨基酸定义的氨基酸区域内导入突变来实现人鞘氨醇激酶催化活性的消除，本发明部分依据这个判定。另外，导入这种突变不仅生成展示基线功能水平消除、降低或有限的鞘氨醇激酶变体，而且生成因能够抑制野生型鞘氨醇激酶的激活而在体外或在体内作为显性失活鞘氨醇激酶发挥功能的变体。这个判定推动了用于治疗和预防特征为异常的、不需要的或不适当的鞘氨醇激酶信号的状况的产品和方法学的合理设计。
因此，本发明的一个方面致力于在由第16-153位氨基酸确定的区域或功能等同区域中包含突变的鞘氨醇激酶变体或所述鞘氨醇激酶变体的衍生物、同系物、类似物、化学等同物或模拟物，其中所述变体展示催化活性相对于野生型鞘氨醇激酶而消除或降低。
提及“鞘氨醇激酶”应当理解为包括提及所有形式的鞘氨醇激酶蛋白质或其衍生物、同系物、类似物、等同物或模拟物。在这个方面中，“鞘氨醇激酶”应当理解为指在鞘氨醇激酶信号途径的激活过程中参与鞘氨醇-1-磷酸生成的分子。这包括例如所有蛋白质形式的鞘氨醇激酶或其功能衍生物、同系物、类似物、等同物或模拟物，包括例如由鞘氨醇激酶mRNA的可变剪接生成的任何同种型或者鞘氨醇激酶的等位基因或多态性变体。优选的是，所述鞘氨醇激酶指人鞘氨醇激酶。
因此，更具体的提供了在由第16-153位氨基酸确定的区域或功能等同区域中包含突变的人鞘氨醇激酶变体或所述鞘氨醇激酶变体的衍生物、同系物、类似物、化学等同物或模拟物，其中所述变体展示催化活性相对于野生型人鞘氨醇激酶而消除或降低。
术语蛋白质”应当理解为涵盖肽、多肽和蛋白质。蛋白质可以是糖基化或未糖基化的，和/或可以包含广泛的其它分子与该蛋白质融合、连接、结合或联合的诸如氨基酸、脂质、碳水化合物或者其它肽、多肽或蛋白质。下文提及“蛋白质”包括包含氨基酸序列的蛋白质以及与其它分子诸如氨基酸、脂质、碳水化合物或者其它肽、多肽或蛋白质有关的蛋白质。
提及“突变”应当理解为提及使得鞘氨醇激酶分子催化失活或只具有较低水平催化活性的任何变化、改变或其它修饰，无论是天然或非天然存在的。在这个方面中，短语催化活性”在鞘氨醇激酶活性的内容中应当理解为指鞘氨醇激酶将鞘氨醇磷酸化成鞘氨醇-1-磷酸的能力。
变化、改变或其它修饰可以采取任何形式，包括但不限于结构修饰(诸如鞘氨醇激酶分子二级、三级或四级结构的改变)、分子修饰(诸如鞘氨醇激酶蛋白质中-个或多个氨基酸的添加、替代或删除)或化学修饰。所述修饰还应当理解为延伸至蛋白质性质或非蛋白质性质分子与鞘氨醇激酶蛋白质或编码鞘氨醇激酶蛋白质的核酸分子的融合、连接或结合，使得表达产物或是催化失活或是只具有较低催化活性。还应当理解，尽管必需通过鞘氨醇激酶表达产物来表示突变，然而可以通过任何合适手段来实现突变的生成，包括突变野生型鞘氨醇激酶蛋白质、合成鞘氨醇激酶变体、或修饰编码野生型鞘氨醇激酶蛋白质的核酸分子，使得所述突变核酸分子的表达产物是鞘氨醇激酶蛋白质变体。优选的是，所述突变是单个或多个氨基酸序列突变、添加和/或删除。
依照这个优选实施方案，提供了包含在由第16-153位氨基酸确定的区域或功能等同区域中具有单个或多个氨基酸替代、添加和/或删除的氨基酸序列的人鞘氨醇激酶变体或所述鞘氨醇激酶变体的衍生物、同系物、类似物、化学等同物或模拟物，其中所述变体展示的催化活性相对于野生型鞘氨醇激酶而消除或降低。
就本发明而言，提及“野生型”鞘氨醇激酶即指指定群体中由大多数个体表达的鞘氨醇激酶形式，其中该鞘氨醇激酶在上文讨论的情况中具有催化活性。可能存在超过一种野生型鞘氨醇激酶(例如由于等位基因或同种型变异)，而且由所述野生型鞘氨醇激酶分子展示的催化活性水平可能落在一定水平范围内。然而，应当理解，“野生型”不包括不具有催化活性的鞘氨醇激酶天然存在形式。这种鞘氨醇激酶变体形式事实上可能在本发明的内容中构成鞘氨醇激酶的天然存在突变型。
在还有一个更优选的实施方案中，提供了包含在由第70-90位、更优选第79-84位氨基酸确定的区域或功能等同区域中具有单个或多个氨基酸替代、添加和/或删除的氨基酸序列的人鞘氨醇激酶变体或所述鞘氨醇激酶变体的衍生物、同系物、类似物、化学等同物或模拟物，其中所述变体展示的催化活性相对于野生型鞘氨醇激酶而消除或降低。
在一个最优选的实施方案中，目的鞘氨醇激酶变体包含氨基酸替代即用天冬氨酸替代第82位甘氨酸。
并非将本发明限制于任何一种作用理论或模式，认为鞘氨醇激酶展示两种水平的催化活性。在第一种水平，鞘氨醇激酶展示基线催化活性。在第二种水平，可以激活展示基线活性的鞘氨醇激酶，使得酶的Vmax升高。在本发明的内容中，将实现鞘氨醇激酶催化活性的消除或降低，其中鞘氨醇激酶的基线活性和/或超过基线活性的激活被消除或降低。优选的是，两种活性水平都被消除或降低，甚至更优选的是，两种活性水平都被消除。
在另一个优选的实施方案中，提供了包含在由第16-153位氨基酸确定的区域或功能等同区域中具有单个或多个氨基酸替代、添加和/或删除的氨基酸序列的人鞘氨醇激酶变体或所述鞘氨醇激酶变体的衍生物、同系物、类似物、化学等同物或模拟物，其中所述变体展示的催化活性相对于野生型鞘氨醇激酶而消除。
优选的是，所述目的人鞘氨醇激酶变体在由第70-90位、甚至更优选第79-84位氨基酸确定的区域中包含氨基酸添加、替代和/或删除。
在一个最优选的实施方案中，目的鞘氨醇激酶变体包含选自下表的一处或多处氨基酸替代(1) G82D(2) G82A(3) G26D(4) S79D(5) G80D(6) K103A(7) G111D(8) G113D(9) G26A(10) K27A(11) K29A(12) S79A(13) G80A(14) K103R(15) G111A“衍生物”包括来自天然、合成或重组来源(包括融合蛋白)的片段、部分、分、变体和模拟物。部分或片段包括例如鞘氨醇激酶的活性区。衍生物可以衍生自氨基酸插入、删除或替代。氨基酸插入衍生物包括氨基和/或羧基末端融合以及单个或多个氨基酸的序列内插入。插入氨基酸序列变体指将一个或多个氨基酸残基导入蛋白质中的预定位点，尽管通过适当筛选所得产物，随机插入也是可能的。删除变体的特征是由序列中消除一个或多个氨基酸。替代氨基酸变体指由序列中除去至少一个残基并在该位置插入不同的残基。替代氨基酸变体的范例是保守氨基酸替代。保守氨基酸替代通常包括下列组内替代甘氨酸和丙氨酸；缬氨酸、异亮氨酸和亮氨酸；天冬氨酸和谷氨酸；天冬酰胺和谷氨酰胺；丝氨酸和苏氨酸；赖氨酸和精氨酸；及苯丙氨酸和酪氨酸。添加氨基酸序列包括与其它肽、多肽或蛋白质的融合。
提及“同系物”应当理解为指由正在处理的物种以外的物种衍生的鞘氨醇激酶核酸分子或蛋白质。
鞘氨醇激酶核酸分子或蛋白质分子的化学或功能等同物应当理解为展示这些分子的任何一种或多种功能活性的分子，可以衍生自任何来源诸如化学合成，或经筛选方法(诸如天然产物筛选)鉴定。
衍生物包括具有完整蛋白质的特定表位或部分的片段并与肽、多肽或其它蛋白质性质或非蛋白质性质分子相融合。
本文关注的类似物包括但不限于侧链修饰、掺入非天然氨基酸和/或它们在肽、多肽或蛋白质合成过程中的衍生物，以及交联剂和对蛋白质性质分子或其类似物施加构象约束的其它方法的使用。
核酸序列的衍生物可以相似的衍生自单个或多个核苷酸替代、删除和/或添加，包括与其它核酸分子的融合。本发明的核酸分子衍生物包括寡核苷酸、PCR引物、反义分子、适用于共遏制的分子和核酸分子的融合。核酸序列的衍生物还包括简并变体。
本发明关注的侧链修饰的范例包括氨基修饰，诸如通过与醛反应及随后NaBH4还原而进行的还原性烷化；与乙酰亚氨酸甲酯(methylacetimidate)的脒化；与乙酸酐的酰化；氰酸盐对氨基的甲氨酰化；2，4，6-三硝基苯磺酸(TNBS)对氨基的三硝基苄化；琥珀酸酐和四氢苯二甲酸酐对氨基的酰化；及吡哆醛-5-磷酸对赖氨酸的吡哆醇羟化(pyridoxylation)及随后NaBH4的还原。
可以通过与诸如2，3-丁二酮、苯乙二醛和乙二醛等试剂形成杂环缩合产物来修饰精氨酸残基的胍基。
可以通过碳二亚胺活化经形成0-酰基异脲及随后衍生成例如相应的酰胺来修饰羧基。
可以通过诸如碘乙酸或碘乙酰胺的羧甲基化；过甲酸氧化成磺基丙氨酸；与其它硫化合物形成混合的二硫化物；与马来酰亚胺、马来酸酐或其它取代马来酰亚胺的反应；使用4-氯汞苯甲酸、4-氯汞苯磺酸、苯基氯化汞、2-氯汞-4-硝基苯酚和其它汞制剂形成汞衍生物；氰酸盐在碱性pH的甲氨酰化等方法来修饰巯基。
可以通过例如N-溴琥珀酰亚胺的氧化或者用2-羟基-5-硝基苯溴化物或氧硫基卤烷化吲哚环来修饰色氨酸残基。另一方面，可以通过四硝基甲烷的硝化而形成3-硝基酪氨酸衍生物来改变酪氨酸残基。
可以通过用碘乙酸衍生物进行烷化或用焦碳酸二乙酯进行N-碳乙氧基化来实现组氨酸残基咪唑环的修饰。
在蛋白质合成过程中掺入非天然氨基酸和衍生物的范例包括但不限于使用正亮氨酸、4-氨基丁酸、4-氨基-3-羟基-5-苯基戊酸、6-氨基己酸、叔丁基甘氨酸、正缬氨酸、苯甘氨酸、鸟氨酸、肌氨酸、4-氨基-3-羟基-6-甲基庚酸、2-噻吩丙氨酸和/或氨基酸的D型异构体。表2显示了本文关注的非天然氨基酸的列表。
表2表1非常见氨基酸 代码非常见氨基酸 代码α-氨基丁酸 Abu L-N-甲基丙氨酸 Nmalaα-氨基-α-甲基丁酸酯Mgabu L-N-甲基精氨酸 Nmarg氨基环丙羧酸 CproL-N-甲基天冬酰胺 Nmasn氨基异丁酸 Aib L-N-甲基天冬氨酸 Nmasp氨基降冰片基羧酸 NorbL-N-甲基半胱氨酸 Nmcys环己基丙氨 Chexa L-N-甲基谷氨酰胺 Nmgln环戊基丙氨酸 CpenL-N-甲基谷氨酸 NmgluD-丙氨酸 Dal L-N-甲基组氨酸 NmhisD-精氨酸 DargL-N-甲基异亮氨酸 NmileD-天冬氨酸 DaspL-N-甲基亮氨酸 NmleuD-半胱氨酸 DcysL-N-甲基赖氨酸 NmlysD-谷氨酰胺 DglnL-N-甲基甲硫氨酸 NmmetD-谷氨酸 DgluL-N-甲基正亮氨酸 NmnleD-组氨酸 DhisL-N-甲基正缬氨酸 NmnvaD-异亮氨酸 DileL-N-甲基鸟氨酸NmornD-亮氨酸DieuL-N-甲基苯丙氨酸 NmpheD-赖氨酸DlysL-N-甲基脯氨酸NmproD-甲硫氨酸 DmetL-N-甲基丝氨酸NmserD-鸟氨酸DornL-N-甲基苏氨酸NmthrD-苯丙氨酸 DpheL-N-甲基色氨酸NmtrpD-脯氨酸DproL-N-甲基酪氨酸NmtyrD-丝氨酸DserL-N-甲基缬氨酸NmvalD-苏氨酸DthrL-N-甲基乙基甘氨酸NmetgD-色氨酸DtrpL-N-甲基-叔丁基甘氨酸 NmtbugD-酪氨酸DtyrL-正亮氨酸NleD-缬氨酸DvalL-正缬氨酸NvaD-α-甲基丙氨酸 Dmala α-甲基-氨基异丁酸酯 MaibD-α-甲基精氨酸 Dmarg α-甲基-氨基丁酸酯MgabuD-α-甲基天冬酰胺 Dmasn α-甲基环己基丙氨酸 MchexaD-α-甲基天冬氨酸 Dmasp α-甲基环戊基丙氨酸 McpenD-α-甲基半胱氨酸 Dmcys α-甲基-α-萘基丙氨酸 ManapD-α-甲基谷氨酰胺 Dmgln α-甲基青霉胺 MpenD-α-甲基组氨酸 Dmhis N-(4-氨基丁基)甘氨酸 NgluD-α-甲基异亮氨酸 Dmile N-(2-氨基乙基)甘氨酸 NaegD-α-甲基亮氨酸 Dmleu N-(3-氨基丙基)甘氨酸 ornD-α-甲基赖氨酸 Dmlys N-氨基-α-甲基丁酸酯 NmaabuD-α-甲基甲硫氨酸 Dmmet α-萘基丙氨酸 AnapD-α-甲基鸟氨酸 Dmorn N-苄基甘氨酸 NpheD-α-甲基苯丙氨酸 Dmphe N-(2-氨甲酰乙基)甘氨酸NglnD-α-甲基脯氨酸 Dmpro N-(氨甲酰甲基)甘氨酸 NasnD-α-甲基丝氨酸 Dmser N-(2-羧乙基)甘氨酸NgluD-α-甲基苏氨酸 Dmthr N-(羧甲基)甘氨酸 NaspD-α-甲基色氨酸 Dmtrp N-环丁基甘氨酸NcbutD-α-甲基酪氨酸 DmtyrN-环庚基甘氨酸 NchepD-α-甲基缬氨酸 DmvalN-环己基甘氨酸 NchexD-N-甲基丙氨酸Dnmala N-环癸基甘氨酸 NcdecD-N-甲基精氨酸Dnmarg N-环十二烷基甘氨酸 NcdodD-N-甲基天冬酰胺 Dnmasn N-环辛基甘氨酸 NcoctD-N-甲基天冬氨酸 Dnmasp N-环丙基甘氨酸 NcproD-N-甲基半胱氨酸 Dnmcys N-环十一烷基甘氨酸 NcundD-N-甲基谷氨酰胺 Dnmgln N-(2，2-二苯乙基)甘氨酸NbhmD-N-甲基谷氨酸Dnmglu N-(3，3-二苯丙基)甘氨酸NbheD-N-甲基组氨酸Dnmhis N-(3-胍丙基)甘氨酸 NargD-N-甲基异亮氨酸 Dnmile N-(1-羟乙基)甘氨酸 NthrD-N-甲基亮氨酸Dnmleu N-(羟乙基)甘氨酸 NserD-N-甲基赖氨酸Dnmlys N-(咪唑乙基)甘氨酸 NhisN-甲基环己基丙氨酸Nmchexa N-(3-吲哚乙基)甘氨酸 NhtrpD-N-甲基鸟氨酸Dnmorn N-甲基-γ-氨基丁酸酯 NmgabuN-甲基甘氨酸 Nala D-N-甲基甲硫氨酸 DnmmetN-甲基氨基异丁酸酯NmaibN-甲基环戊基丙氨酸 NmcpenN-(1-甲基丙基)甘氨酸 Nile D-N-甲基苯丙氨酸 DnmpheN-(2-甲基丙基)甘氨酸 Nleu D-N-甲基脯氨酸 DnmproD-N-甲基色氨酸Dnmtrp D-N-甲基丝氨酸 DnmserD-N-甲基酪氨酸Dnmtyr D-N-甲基苏氨酸 DnmthrD-N-甲基缬氨酸Dnmval N-(1-甲基乙基)甘氨酸 Nvalγ-氨基丁酸 Gabu N-甲基-α-萘基丙氨酸 NmanapL-叔丁基甘氨酸Tbug N-甲基青霉胺 NmpenL-乙基甘氨酸 Etg N-(对羟基苯基)甘氨酸 NhtyrL-同型苯丙氨酸Hphe N-(硫甲基)甘氨酸 NcysL-α-甲基精氨酸 Marg 青霉胺 PenL-α-甲基天冬氨酸 Masp L-α-甲基丙氨酸MalaL-α-甲基半胱氨酸 Mcys L-α-甲基天冬酰胺 MasnL-α-甲基谷氨酰胺 MglnL-α-甲基-叔丁基甘氨酸MtbugL-α-甲基组氨酸 MhisL-甲基乙基甘氨酸 MetgL-α-甲基异亮氨酸 MileL-α-甲基谷氨 MgluL-α-甲基亮氨 MleuL-α-甲基同型苯丙氨 MhpheL-α-甲基甲硫氨酸 MmetN-(2-甲基硫乙基)甘氨 NmetL-α-甲基正缬氨酸 MnvaL-α-甲基赖氨酸 MlysL-α-甲基苯丙氨 MpheL-α-甲基正亮氨 MnleL-α-甲基丝氨 MserL-α-甲基鸟氨 MornL-α-甲基色氨 MtrpL-α-甲基脯氨酸 MproL-α-甲基缬氨 MvalL-α-甲基苏氨酸 MthrN-(N-(2，2-二苯基乙基)Nnbhm L-α-甲基酪氨酸 Mtyr氨甲酰甲基)甘氨酸 L-N-甲基同型苯丙氨酸 Mnhphe1-羧基-1-(2，2-二苯基 NmbcN-(N-(3，3-二苯丙基) Nnbhe乙基氨基)环丙烷 氨甲酰甲基)甘氨酸例如，可以使用交联剂来稳定3D构象，使用诸如具有(CH2)n(n＝1-6)间隔基团的双功能亚氨酯、戊二醛、N-羟基琥珀酰亚胺酯等同型双功能交联剂，和通常包含氨基反应性模块诸如N-羟基琥珀酰亚胺和其它基团特异反应性模块的异型双功能试剂。
仍然并非将本发明限制于任何一种作用理论或模式，认为由第16-153位氨基酸残基定义的人野生型鞘氨醇激酶蛋白质区域包含整个或部分ATP结合位点。因此，认为通过阻断ATP结合位点，可以使得受试鞘氨醇激酶在将鞘氨醇磷酸化成鞘氨醇-1-磷酸的能力方面催化失活。因此，短语“功能等同区域”应当理解为指展示可归于由第16-153位氨基酸残基确定的区域的至少一种功能活性的任何鞘氨醇激酶氨基酸序列区域。
因此，本发明的另一个方面致力于在ATP结合位点区域或功能等同区域中包含突变的鞘氨醇激酶变体或所述鞘氨醇激酶变体的衍生物、同系物、类似物、化学等同物或模拟物，其中所述变体展示催化活性相对于野生型鞘氨醇激酶而消除或降低。
优选的是，所述鞘氨醇激酶指人鞘氨醇激酶。
仍然更优选的是，所述突变是由第16-153位、更优选第70-90位、仍然更优选第79-84位氨基酸残基确定的区域中的一个或多个氨基酸的替代、删除和/或添加。
在一个最优选的实施方案中，所述突变包括选自下表的一处或多处氨基酸替代(1) G82D(2) G82A(3) G26D(4) S79D(5) G80D(6) K103A(7) G111D(8) G113D(9) G26A(10) K27A(11) K29A(12) S79A(13) G80A(14) K103R(15) G111A就本发明涉及包含一个或多个氨基酸添加、替代和/或删除的鞘氨醇激酶变体而言，还应当理解为延伸至编码所述变体的核酸分子。
因此，本发明的另一个方面致力于选自下表的分离核酸分子1)包含编码鞘氨醇激酶变体或其衍生物、同系物、类似物、化学等同物或模拟物的核苷酸序列或其互补序列的分离核酸分子或其衍生物或等同物，所述变体在由第16-153位氨基酸确定的区域或功能等同区域中包含突变，其中所述变体展示催化活性相对于野生型鞘氨醇激酶而消除或降低。
2)包含编码人鞘氨醇激酶变体或其衍生物、同系物、类似物、化学等同物或模拟物的核苷酸序列或其互补序列的分离核酸分子或其衍生物或等同物，所述变体在由第16-153位氨基酸确定的区域或功能等同区域中包含突变，其中所述变体展示催化活性相对于野生型人鞘氨醇激酶而消除或降低。
3)包含编码人鞘氨醇激酶变体或其衍生物、同系物、类似物、化学等同物或模拟物的核苷酸序列或其互补序列的分离核酸分子或其衍生物或等同物，所述变体包含在由第16-153位氨基酸确定的区域或功能等同区域中具有单个或多个氨基酸替代、添加和/或删除的氨基酸序列，其中所述变体展示催化活性相对于野生型鞘氨醇激酶而消除或降低。
4)包含编码人鞘氨醇激酶变体或其衍生物、同系物、类似物、化学等同物或模拟物的核苷酸序列或其互补序列的分离核酸分子或其衍生物或等同物，所述变体包含在由第70-90位氨基酸确定的区域或功能等同区域中具有单个或多个氨基酸替代、添加和/或删除的氨基酸序列，其中所述变体展示催化活性相对于野生型鞘氨醇激酶而消除或降低。
5)包含编码人鞘氨醇激酶变体或其衍生物、同系物、类似物、化学等同物或模拟物的核苷酸序列或其互补序列的分离核酸分子或其衍生物或等同物，所述变体包含在由第79-84位氨基酸确定的区域或功能等同区域中具有单个或多个氨基酸替代、添加和/或删除的氨基酸序列，其中所述变体展示催化活性相对于野生型鞘氨醇激酶而消除或降低。
6)包含编码鞘氨醇激酶变体或其衍生物、同系物、类似物、化学等同物或模拟物的核苷酸序列或其互补序列的分离核酸分子或其衍生物或等同物，所述变体包含选自下表的一处或多处氨基酸替代(1) G82D(2) G82A
(3) G26D(4) S79D(5) G80D(6) K103A(7) G111D(8) G113D(9) G26A(10) K27A(11) K29A(12) S79A(13) G80A(14) K103R(15) G111A7)包含编码鞘氨醇激酶变体或其衍生物、同系物、类似物、化学等同物或模拟物的核苷酸序列或其互补序列的分离核酸分子或其衍生物或等同物，所述变体在ATP结合位点区域或功能等同区域中包含突变，其中所述变体展示催化活性相对于野生型鞘氨醇激酶而消除或降低。
可以将本发明的核酸分子连接能够在原核细胞(如大肠杆菌)或真核细胞(如酵母细胞、真菌细胞、昆虫细胞、哺乳动物细胞或植物细胞)中表达的表达载体。可以将核酸分子连接、融合或联合编码另一种实体诸如信号肽的核酸分子。它还可以包含额外的核苷酸序列信息，该序列信息在其3’或5’末端或两端与其相融合、连接或联合。核酸分子还可以是载体诸如表达载体的一部分。后一种实施方案推动本发明所涵盖的重组形式变异鞘氨醇激酶的生成。
本发明的变异鞘氨醇激酶可以衍生自天然或重组来源，或者可以是化学合成的。用于生成这些分子的方法对于本领域技术人员而言是众所周知的。
除了便于合成鞘氨醇激酶变体本身，本发明鞘氨醇激酶变体的功能机制的鉴定还有助于设计用于消除或降低野生型鞘氨醇激酶蛋白质的催化活性的方法学。例如，使野生型鞘氨醇激酶蛋白质接触能够结合或联合由第16-153位氨基酸确定的区域或功能等同区域的试剂，有可能有效的将野生型鞘氨醇激酶蛋白质转变成催化失活变体。另一方面，所述试剂能够结合或联合鞘氨醇激酶ATP结合位点。
并非以任何方式限制本发明，认为基线鞘氨醇激酶活性是所有野生型鞘氨醇激酶蛋白质的组成性特性。然而，为了激活这种分子，必须提高酶的Vmax，如通过将更多的酶转运至需要它的位置或者通过在翻译后改变它的功能。这需要另一种分子或另一类分子(诸如蛋白质或脂质)发挥功能来联合受试鞘氨醇激酶，这些分子推定性地称为FOSK即鞘氨醇激酶助手(Friends of Sphingosine Kinase)。提及“FOSK”应当理解为包括鞘氨醇激酶相互作用分子(sphingosine kinaseinteracting molecule)即SKIM。例如，认为G82D鞘氨醇激酶变体结合FOSK分子，从而防止它激活野生型鞘氨醇激酶。
因此，本发明不仅提供了鞘氨醇激酶变体本身作为潜在药物，还提供了用于进一步开发药物的机制。例如，预计可结合鞘氨醇激酶变体分子中作为突变对象的区域的小分子能够将野生型鞘氨醇激酶蛋白质转变成不仅丧失其基线鞘氨醇激酶活性而且促使其转变成显性失活鞘氨醇激酶变体的抑制剂，即鞘氨醇激酶活性的两种水平都被消除。或者，筛选能够防止野生型鞘氨醇激酶与FOSK相互作用的试剂将再现显性失活表型，其中不干扰基线鞘氨醇激酶活性，而只抑制激活。当细胞存活需要一些鞘氨醇激酶活性时，这是潜在的理想情况。
因此，可以通过包括但不限于下列各项的许多技术中的任何一种来实现对鞘氨醇激酶活性的调控(1)将拮抗FOSK与鞘氨醇激酶之间相互作用的蛋白质性质或非蛋白质性质分子导入细胞。
(2)将与野生型鞘氨醇激酶中进行本文所述变体目的突变的区域的至少一部分相互作用的蛋白质性质或非蛋白质性质分子导入细胞。
因此，提及“试剂”应当理解为指能够调控鞘氨醇激酶与FOSK相互作用或与由鞘氨醇激酶第16-153位氨基酸确定的区域的至少一部分相互作用的任何蛋白质性质或非蛋白质性质分子，包括例如上文点(1)-(2)中详述的分子。可以将受试试剂连接、结合或联合任何蛋白质性质或非蛋白质性质分子。例如，可以将它联合将其靶向局部区域的分子。
因此，通过胞内施用所述试剂，既能够就其基线活性而言灭活内源生成的野生型鞘氨醇激酶，又能够诱导其作为显性失活鞘氨醇激酶分子而发挥功能，其中试剂相关野生型鞘氨醇激酶发挥消除或降低其它非试剂相关野生型鞘氨醇激酶分子的激活的功能。或者，既然在有些情况中必须维持胞内基线鞘氨醇激酶活性，那么可以在胞外将试剂联合野生型鞘氨醇激酶，然后胞内施用试剂-鞘氨醇激酶复合物。这些复合物(在本发明内容中为变异鞘氨醇激酶)将消除或降低野生型鞘氨醇激酶的激活，而不显著调控内源生成的野生型鞘氨醇激酶蛋白质的基线活性。这些分子的设计和生成提供了用于调控鞘氨醇激酶信号途径活性的独特的、先前无法获得的机制。具体而言，先前采用的化学抑制剂诸如N，N-二甲基鞘氨醇能够完全消除鞘氨醇激酶功能，而可以施用本发明的变体从而例如只降低或消除野生型鞘氨醇激酶的激活而不干扰基线机能。
受试试剂可以是由天然、重组或合成来源(包括融合蛋白)衍生的或者是例如天然产物筛选获得的、可实现本发明目标的任何蛋白质性质或非蛋白质性质的分子。所述试剂的合成来源包括例如化学合成分子。在其它范例中，可以对噬菌体展示文库筛选肽，可以对化学文库筛选现有小分子。可以通过进行结晶、进一步分析ATP结合位点和通过设计将分子拟合到该位点中来实现合理药物设计/基于结构的设计。
作为范例，可以筛选多样性文库，诸如随机组合肽或非肽文库。可以使用许多公用或商品化文库，诸如化学合成文库、重组(如噬菌体文库)和基于体外翻译的文库。
化学合成文库的范例描述于Foder等人，1991；Houghten等人，1991；Lam等人，1991；Medynski，1994；Gallop等人，1994；Ohlmeyer等人，1993；Erb等人，1994；Houghten等人，1992；Jayawickreme等人，1994；Salmon等人，1993；国际专利发布号WO93/20242；及Brenner和Lerner，1992。
噬菌体展示文库的范例描述于Scott和Smith，1990；Devlin等人，1990；Christian，R.B.等人，1992；Lenstra，1992；Kay等人，1993；及国际专利发布号WO94/18318。
基于体外翻译的文库包括但不限于Mattheakis等人，1994中所述。
可以通过众所周知的多种方法来实现文库筛选。参阅Parmley和Smith，1989；Scott和Smith，1990；Fowlkes等人，1992；Oldenburg等人，1992；Yu等人，1994；Staudt等人，1988；Bock等人，1992；Tuerk等人，1992；Ellington等人，1992；美国专利号5,096,815、美国专利号5,223,409和美国专利号5,198,346；Rebar和Pabo，1993；及国际专利发布号WO94/18318。
因此，本发明还应当理解为延伸至筛选能够调控鞘氨醇激酶与FOSK分子之间相互作用的试剂的方法。这可以通过例如采用能够监测鞘氨醇激酶激活的基于细胞的测定法来实现。因此，本发明提供了筛选能够采用多种方法之一来抑制鞘氨醇激酶的试剂的机制。例如，除了只能够抑制鞘氨醇激酶激活的分子(例如通过抑制鞘氨醇激酶与FOSK之间的相互作用)，还可以筛选能完全消除鞘氨醇激酶活性的两种水平的试剂。
可以通过数种合适方法之一来实现上文定义的调控试剂的筛选，包括但不限于使包含鞘氨醇激酶的细胞(与FOSK分开或一起)接触试剂，并筛选对鞘氨醇激酶/FOSK功能活性的调控或对下游鞘氨醇激酶或FOSK分子靶的表达或活性的调控。可以通过采用诸如Western印迹、电泳迁移率变动分析和/或鞘氨醇激酶或FOSK活性报道物诸如萤光素酶、CAT、等等的读数等技术来实现这种调控的检测。
应当理解，鞘氨醇激酶或FOSK蛋白质可能天然存在于作为测试对象的细胞中，或者可以为了测试目的而将它们的编码基因转染到宿主细胞中。另外，天然存在或转染的基因可以是组成性表达的，由此提供尤其可用于筛选能够下调鞘氨醇激酶与FOSK相互作用的试剂的模型；或者，基因可能需要激活，由此提供尤其可用于筛选能够在某些刺激条件下调控鞘氨醇激酶与FOSK相互作用的试剂的模型。另外，就将鞘氨醇激酶核酸分子转染到细胞中而言，该分子可以包含完整的鞘氨醇激酶基因，或者它可以仅仅包含部分基因诸如FOSK结合部分。
在另一个范例中，检测对象可以是下游鞘氨醇激酶调控靶，而非鞘氨醇激酶自身。还有一个范例包括连接最小报道物的鞘氨醇激酶结合位点。例如，可以通过筛选对TNF受激细胞的下游信号成分的调控来检测对鞘氨醇激酶与FOSK相互作用的调控。这是其中监测对特定分子的调控的系统的范例，其中鞘氨醇激酶和FOSK调节所述分子的活性。
因此，本发明的另一个方面提供了用于检测能够调控FOSK与鞘氨醇激酶或其功能等同物或衍生物相互作用的试剂的方法，所述方法包括使包含所述鞘氨醇激酶和FOSK或其功能等同物或衍生物的细胞或其提取物接触推定试剂，并检测与所述相互作用有关的表达表型的改变。
提及“鞘氨醇激酶”和‘FOSK”应当理解为或是指鞘氨醇激酶或FOSK表达产物，或是指鞘氨醇激酶或FOSK分子的部分或片段，诸如由鞘氨醇激酶蛋白质第16-153位氨基酸定义的FOSK区域。在这个方面中，在细胞中表达鞘氨醇激酶或FOSK表达产物。细胞可以是经鞘氨醇激酶或FOSK核酸分子转染的宿主细胞，或者它可以是天然包含鞘氨醇激酶基因的细胞。提及“其提取物”应当理解为指无细胞转录系统。
提及检测“与所述相互作用有关的表达表型的改变”应当理解为检测与对鞘氨醇激酶与FOSK相互作用的调控有关的细胞变化。这可以通过例如胞内变化或胞外能够观察到的变化来检测。例如，这包括但不限于检测下游产物水平或活性的变化。
本发明的还有一个方面提供了用于检测能够结合或联合由第16-153位氨基酸定义的鞘氨醇激酶区域或其功能等同物或衍生物的试剂的方法，所述方法包括使包含所述氨基酸区域或其功能等同物或衍生物的细胞接触推定试剂，并检测与鞘氨醇激酶或其功能等同物或衍生物的功能调控有关的表达表型的改变。
优选的是，所述区域是由第70-90位、甚至更优选第79-84位氨基酸确定的。
提及“鞘氨醇激酶结合位点”应当理解为提及由第16-153位、优选第70-90位、甚至更优选第79-84位氨基酸定义的鞘氨醇激酶区域。
除了采用上述类型的基于功能的测定法来筛选能够调控FOSK与鞘氨醇激酶相互作用的试剂，鞘氨醇激酶功能活性区域的鉴定还推动了用于调控FOSK与鞘氨醇激酶相互作用或鞘氨醇激酶活性的试剂的筛选、分析、合理设计和/或修饰，这是以对推定试剂或引导化合物与受试区域物理相互作用的分析为基础的。
具体而言，现在，就结合位点的结构而言，关于该位点的本质和定位的知识推动了通过诸如X射线结晶学对鞘氨醇激酶三级结构的分析。
因此，本发明的另一个方面致力于用于分析、设计和/或修饰能够与由第16-153位氨基酸定义的鞘氨醇激酶区域或其衍生物相互作用并调控与所述鞘氨醇激酶有关的至少一种功能活性的试剂的方法，所述方法包括使所述鞘氨醇激酶或其衍生物接触推定试剂，并评估所述试剂与所述结合位点相互作用的互补性程度。
优选的是，所述区域是由第70-90位、甚至更优选第79-84位氨基酸定义的。
应当理解，为了评估相互作用互补性而与推定试剂接触的鞘氨醇激酶可以是重组生成的。然而，还应当理解，受试鞘氨醇激酶可以采取以已经阐明的结合位点结构的图像为基础的形式，诸如电子密度图谱、分子模型(包括但不限于棍棒、球棍、空间填充或表面呈现模型)或者其它数字或非数字表面呈现模型或图像，这有助于采用本领域技术人员知道的技术和软件来分析鞘氨醇激酶位点与试剂的相互作用。例如，可以采用诸如关于配体结合的结合和解离速率及解离常熟的Biacore实时分析(Gardsvoll等人，1999；Hoyer-Hansen等人，1997；Ploug等人，1998；Ploug等人，1994；1995；1998)和NMR微扰研究(Stephens等人，1992)等技术来进行相互作用分析。
提及对试剂与受试鞘氨醇激酶结合位点“评估相互作用的互补性程度”应当理解为指阐明任何感兴趣的特征，包括但不限于受试鞘氨醇激酶结合位点与感兴趣试剂之间相互作用的本质和/或程度。如上所述，可以采用任何合适技术。这些技术对于本领域技术人员而言是知道的，而且可以用于这个方面。就目的相互作用的本质而言，可能希望评估任何指定试剂的特定残基与鞘氨醇激酶结合位点的特定残基之间发生的相互作用机制的类型(例如肽键键合或形成氢键、离子键、范德瓦耳斯力、等)和/或它们的相对强度。还可能希望评估感兴趣试剂与受试鞘氨醇激酶结合位点之间发生的相互作用的程度。例如，通过分析受试试剂与鞘氨醇激酶结合位点之间相互作用的活性位点的定位，有可能测定试剂拟合这个鞘氨醇激酶结合位点区域的质量以及该结合相互作用的相对强度和稳定性。例如，如果目的是阻断发挥功能的鞘氨醇激酶结合位点，那么就寻找能够与鞘氨醇激酶结合位点相互作用从而阻断或阻碍(例如从空间位阻上阻碍或者从化学或静电学上排斥)FOSK相互作用或下调鞘氨醇激酶活性的试剂。就调控鞘氨醇激酶功能而言所需要的联合形式可能不涉及形成任何化学相互作用键合机制的形成(正如传统上理解的)，但是可能涉及非键合机制诸如试剂的区域相对于鞘氨醇激酶结合位点受试结合区域的邻近定位，例如就激活分子的结合而言实现空间位阻。当相互作用采取妨碍或形成其它排斥力的形式时，这仍然应当理解为“相互作用”形式，尽管缺乏任何传统形式的键合机制的形成。
还应当理解，以上文讨论的物理或图像形式用于评估推定试剂的相互作用互补性的鞘氨醇激酶结合位点可以是鞘氨醇结合位点的天然存在形式，或者它可以是其衍生物、同系物、类似物、突变体、片段或等同物。其衍生物、同系物、类似物、突变体、片段或等同物可以采取物理或非物理(诸如图像)的形式。
鞘氨醇激酶结合区域的测定推动了鞘氨醇激酶结合位点的三维结构的测定以及可用于调控FOSK结合或鞘氨醇激酶功能发挥的试剂的鉴定和/或合理修饰和设计。
并非以任何方式限制本发明的应用，本发明的方法推动了可用于与由第16-153位氨基酸定义的鞘氨醇激酶位点相互作用的试剂的分析、设计和/或修饰。在这个方面中，提及试剂的“分析、设计和/或修饰”应当理解为其广义，包括(1)随机筛选(例如采用常规高通量筛选技术)以鉴定就鞘氨醇激酶功能活性和/或FOSK结合而言展示一些调控能力的试剂，然后采用本发明这个方面的方法来分析试剂的调控能力的精确本质和量级。在这个方面中，可以将已有晶体浸透所述试剂，或者可以进行共结晶。然后，可以进行例如局部化合物建模和合成修饰与鞘氨醇激酶结合位点诱变的组合。在筛选可以调控活性的试剂时，可以采用标准噬菌体展示方法以及组合化学(Goodson等人，1994；Terrett，2000)。还可以采用诸如Biacore分析和NMR微扰研究等技术来促进这些相互作用研究。就对蛋白质性质或非蛋白质性质分子随机筛选其发挥激动或拮抗功能的能力而言，这些试剂常常统称为“引导”试剂。另外，例如，可以通过修饰引导试剂使得与鞘氨醇激酶结合位点的相互作用最大化来增强结合亲和力和特异性。这些分析将推动最适用于指定目的的试剂的选择。由此，选择步骤不仅以体外数据为基础，就其频率、稳定性和对指定目的的适用性而言，还以试剂与鞘氨醇激酶相互作用位点的技术分析为基础。例如，这些分析可能揭示，就随机鉴定的试剂而言似乎可接受的体外活性，事实上是由归因于相距接近的试剂与鞘氨醇激酶位点的存在的高度不稳定相互作用诱导的，所述相距接近的试剂与鞘氨醇激酶位点展示显著的排斥力，从而使试剂与鞘氨醇激酶之间的整个相互作用去稳定。然后，这将有助于选择展示等同程度的体外活性但根据进一步分析不涉及这些去稳定排斥力的存在的另一种预期引导化合物。
可以通过数种合适方法来实现本文定义的调控试剂的筛选，包括insilico法，它对于本领域技术人员而言是众所周知的，它常规用于例如随机筛选蛋白质性质和非蛋白质性质分子，以期鉴定引导化合物。
这些方法提供了用于进行高通量筛选推定调控试剂的机制，诸如包含蛋白质性质或非蛋白质性质试剂的合成、重组、化学和天然文库。
(2)为了使与鞘氨醇激酶的期望相互作用(例如结合亲和力和特异性)最大化和使非期望相互作用(诸如排斥性或其它方式的去稳定性相互作用)最小化，可以修饰候选或引导试剂(例如依照(1)所述方法鉴定的试剂)。
依照本文所述目的修饰候选或引导试剂的方法对于本领域技术人员而言是众所周知的。例如，可以在这个方面中采用分子取代程序诸如Amore(Navaza，1994)。本发明的方法也推动了已知信号诱导剂的诱变，从而消除或改进信号活性。
(3)除了分析拟合和/或结构修饰现有分子，本发明的方法还有助于试剂的合理设计和合成，诸如激动剂或拮抗剂，它的基础是从理论上构建展示期望鞘氨醇激酶结合位点相互作用性结构特征的试剂模型，随后合成并测试该试剂。
应当理解，可以在鉴定具体试剂时采用上文应用(1)-(3)的任何一项或多项。
在一个相关方面中，本发明应当理解为延伸至采用上文定义的任何方法鉴定的试剂。在这个方面中，提及试剂应当理解为提及能够调控至少一种鞘氨醇激酶功能活性的任何蛋白质性质或非蛋白质性质分子。
并非限制本发明的作用理论或模式，鞘氨醇激酶是鞘氨醇激酶信号途径活性中的关键调控酶。
“鞘氨醇激酶信号途径”指利用鞘氨醇激酶和/或鞘氨醇-1-磷酸之一或二者的信号途径。认为鞘氨醇激酶信号途径级联可能采取下列形式(1)经S.Mase活性由鞘磷脂生成神经酰胺，所述神经酰胺再转变成鞘氨醇；(2)通过刺激鞘氨醇激酶来生成鞘氨醇-1-磷酸；和(3)鞘氨醇-1-磷酸生成后发生MEK/ERK激活和NF-κB核转位。
已知鞘氨醇激酶信号途径调节诸如那些导致炎症、凋亡和细胞增殖的细胞活动。例如，炎症介质诸如细胞因子、趋化因子、eNOS生成的上调和粘附分子表达的上调。所述上调可能是由许多刺激诱导的，包括例如炎症细胞因子诸如肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白介素-1(IL-1)、内毒素、氧化或修饰后的脂质、辐射、或组织损伤。
现在，变异鞘氨醇激酶分子的生成提供了可用于特征为不需要的细胞活性的疾病的预防性和治疗性处理的额外分子，所述活性直接或间接受到鞘氨醇激酶信号途径活性的调控。涉及有不需要的鞘氨醇激酶调控细胞活性的疾病范例包括炎症状况(如类风湿性关节炎、炎症性肠病)、肿瘤状况(如实体癌)、哮喘、动脉硬化、脑膜炎、多发性硬化症和脓毒性休克。本发明的变体还可有助于对诸如动脉硬化、骨关节炎和炎症在其中发挥作用的其它退化疾病等疾病状况进行长期治疗。
因此，本发明关注变异鞘氨醇激酶分子用于调控细胞功能活性(诸如调控炎症)的治疗性和预防性用途。在这个方面中，可用于治疗和预防的变异分子包括突变型鞘氨醇激酶表达产物、编码突变型鞘氨醇激酶表达产物的核酸分子、上文定义的鞘氨醇激酶-试剂复合物或建议施用于受试者的试剂本身(其目的是在胞内与野生型鞘氨醇激酶复合，从而将野生型分子转变成变异鞘氨醇激酶分子)。为了易于提及且依照上文提供的定义，应当理解短语“鞘氨醇激酶变体”包括突变型鞘氨醇激酶蛋白质、编码所述蛋白质的核酸分子和鞘氨醇激酶-试剂复合物，而提及“试剂”意欲指在与鞘氨醇激酶蛋白质(诸如野生型蛋白质)接触时将使得该蛋白质变成本发明范围内的变体的试剂。
因此，本发明的另一个方面关注用于在哺乳动物中调控细胞功能活性的方法，所述方法包括在足以抑制、降低或下调野生型鞘氨醇激酶的至少一种功能活性的时间和条件下对所述哺乳动物施用有效量的上文定义的鞘氨醇激酶变体或试剂。
优选的是，所述功能活性指下调野生型鞘氨醇激酶基线活性和/或防止野生型鞘氨醇激酶激活。
提及“调控细胞功能活性”时即指上调、下调或改变任何一种或多种细胞能够进行的活动，诸如但不限于趋化因子的生成、细胞因子的生成、一氧化氮的合成、粘附分子的表达和其它炎症调控物的表达之一项或多项。
可以通过任何简便手段来进行变异鞘氨醇激酶或试剂以药物组合物形式的施用。在药物组合物中包含变异鞘氨醇激酶或试剂，从而在以依赖具体情况的量进行施用时展示治疗活性。施用量的变化取决于例如选择的人或动物和鞘氨醇激酶或试剂。可以应用广泛的剂量。例如，可以对患者施用大约0.1-大约1mg/公斤体重/天的鞘氨醇激酶或试剂。可以调整剂量方案以提供最佳治疗应答。例如，可以每天、每周、每月或其它合适时间间隔施用几个分剂量，或者可以根据紧急状况的指示成比例减小剂量。可以常规方式施用变异鞘氨醇激酶或试剂，诸如口服、静脉内(水溶性时)、鼻内、腹膜内、肌肉内、皮下、皮内或栓剂途径或者植入(如使用缓释分子)。在具体提及变异鞘氨醇激酶或试剂的用途时，可以制药学可接受无毒盐类的形式施用这些分子，诸如酸加成盐或金属复合物，如锌、铁、等等(被认为是用于该应用目的的盐类)。所述酸加成盐的范例是氢氯化物、氢溴化物、硫酸盐、磷酸盐、马来酸盐、醋酸盐、柠檬酸盐、苯甲酸盐、琥珀酸盐、苹果酸盐、抗坏血酸盐、酒石酸盐、等等。若以片剂形式施用活性成分，则片剂可以包含粘合剂，诸如黄蓍胶、玉米淀粉或明胶；崩解剂，诸如藻酸；及润滑剂，诸如硬脂酸镁。
本发明的另一个方面涉及本发明关于哺乳动物疾病状况的用途。例如，本发明具体可用于但绝非限于炎症疾病、肿瘤状况和退化疾病的治疗性或预防性处理。
因此，本发明的另一个方面涉及哺乳动物中特征为异常的、不需要的或不适当的细胞活性的状况的治疗和/或预防，所述方法包括在足以抑制、降低或下调野生型鞘氨醇激酶的至少一种功能活性的时间和条件下对所述哺乳动物施用有效量的上文定义的鞘氨醇激酶变体或试剂，其中所述下调导致对细胞功能活性的调控。
优选的是，所述功能活性指下调基线野生型鞘氨醇激酶活性和/或防止野生型鞘氨醇激酶激活。
提及“异常的、不需要的或不适当的”细胞活性应当理解为指过度活泼的细胞活性、不够活泼的细胞活性、或者不适当的或不需要的生理学正常细胞活性。
治疗或预防的受试者通常是哺乳动物，诸如但不限于人、灵长类、家畜(如绵羊、牛、马、驴、猪)、宠物(如狗、猫)、实验室测试动物(如小鼠、兔、大鼠、豚鼠、仓鼠)、捕获的野生动物(如狐狸、鹿)。优选的是，哺乳动物指人或灵长类。最优选的是，哺乳动物指人。
本文提及“治疗”和“预防”应当理解为其广义。术语“治疗”不必暗示治疗哺乳动物直至痊愈。相似的，“预防”不必意谓受试者最终不会感染疾病状况。因此，治疗和预防包括减轻具体状况的症状，或者防止或降低形成具体状况的风险。术语“预防”可以理解为降低具体状况的严重性或发作。“冶疗”也可以降低已有状况的严重性。
“有效量”指至少部分获得期望免疫应答或者迟滞发作或抑制发展或完全停止所必需的数量，它取决于待治疗个体中具体状况的发作或发展、待治疗个体的分类学分组、期望的保护程度、疫苗配方、对健康状况的评估、和其它相关因素。预计该数量将落在可以通过常规试验测定的较广范围内。
本发明的另一个方面涉及上文定义的鞘氨醇激酶变体或试剂在制造用于调控细胞功能活性的药物中的用途。
本发明的另一个方面涉及用于调控细胞功能活性的上文定义的鞘氨醇激酶变体或试剂。
在本发明的一个相关方面中，接受治疗的哺乳动物可以是需要治疗性或预防性处理的人或动物。
依照这些方法，可以将依照本发明定义的分子与一种或多种其它化合物或分子一起进行共施用。“共施用”指在相同配方中或在两个不同配方中(经相同或不同路径)的同时施用，或者通过相同或不同路径的相继施用。“相继”施用指两类分子施用之间的时间差异，可以秒、分、小时或天计。可以任何顺序施用这些分子。
在还有一个方面中，本发明关注包含上文定义的鞘氨醇激酶变体或试剂以及一种或多种制药学可接受载体和/或稀释剂的药物组合物。鞘氨醇激酶变体和试剂称为活性成分。
适用于注射用途的药物形式包括无菌水溶液(水溶性时)和用于临时配制无菌可注射溶液或悬浮液的无菌粉剂。在所有情况中，该形式必须是无菌的，而且流动性程度必须易于进行注射。它在制造和贮藏条件下必须是稳定的，而且必须防止微生物诸如细菌和真菌的污染作用。载体可以是包含例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、液态聚乙二醇、等等)及其合适混合物和植物油的溶剂或分散介质。可以通过例如使用涂层诸如卵磷脂、在分散剂的情况中维持所需颗粒大小、和使用表面活性剂来维持适当的流动性。可以通过多种抗细菌和抗真菌试剂来实现对微生物作用的预防，例如对羟基苯甲酸酯类、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等等。在许多情况中，优选包含等渗剂，例如糖或氯化钠。可以通过在组合物中使用延迟吸收的试剂来实现可注射组合物的延长吸收，例如单硬脂酸铝和明胶。
通过将所需量的活性成分掺入根据需要含有多种上文列举的其它成分的合适溶剂中、随后过滤除菌来制备无菌注射液。通常，通过将多种无菌活性成分掺入含有基本分散介质和上文列举的所需其它成分的无菌载体来制备分散液。在用于配制无菌注射液的无菌粉剂的情况中，优选的制备方法是真空干燥和冻干技术，它们能够由先前的过滤除菌溶液产生活性成分与任何额外所需成分的粉剂。
当活性成分受到适当保护时，可以与例如惰性稀释剂或可同化可食用载体一起进行口服施用，或者可以将它们装入硬壳或软壳明胶胶囊中，或者可以将它们压成片剂，或者可以将它们直接掺入日常饮食。对于口服治疗性施用，可以将活性成分混合赋形剂，并以吞咽片剂、口含片剂、锭剂、胶囊、酏剂、悬浮液、糖浆、糯米纸囊剂、等等的形式使用。这些组合物和制剂应当包含至少1％(以重量计)的活性化合物。组合物和制剂的百分比当然可以变化，而且可以常规的在单位的重量的大约5％-大约80％之间。活性化合物在这些治疗有用组合物中的量将获得合适剂量。在依照本发明的优选组合物或制剂中，口服剂量单位形式包含大约0.1μg-大约2000mg活性化合物。
片剂、锭剂、丸剂、胶囊、等等还可以包含粘合剂，诸如黄耆胶、阿拉伯胶、玉米淀粉或明胶；赋形剂，诸如磷酸二钙；崩解剂，诸如玉米淀粉、马铃薯淀粉、藻酸、等等；润滑剂，诸如硬脂酸镁；甜味剂，诸如蔗糖、乳糖或糖精；及调味剂，诸如胡椒薄荷、冬绿油或樱桃调味料。当剂量单位形式是胶囊时，除了上述类型的物质，它还可以包含液态载体。可以存在多种其它物质作为涂层或者修饰剂量单位的物理形式。例如，可以用紫胶、糖或二者作为片剂、丸剂或胶囊的涂层。糖浆或酏剂可以包含活性化合物、蔗糖作为甜味剂、对羟基苯甲酸甲酯和丙酯类作为防腐剂、染料和调味剂诸如樱桃或柑橘调味料。当然，用于制备任何剂量单位形式的任何物质应当是制药学纯的，而且在所采用的量基本上无毒。另外，可以将活性化合物掺入缓释制剂和配方。
制药学可接受载体和/或稀释剂包括任何和所有溶剂、分散介质、涂层、抗细菌和抗真菌试剂、等渗和吸收延迟剂、等等。这些介质和试剂用于制药学活性物质的用途在本领域是众所周知的。除非任何常规介质或试剂与活性成分不相容，否则本发明涉及它们在治疗性组合物中的用途。还可以将增补的活性成分掺入组合物。
尤其有利的是配制剂量单位形式的肠胃外组合物，以便于剂量的施用和一致性。剂量单位形式在用于本文时指物理上离散的单位，适合于给予待治疗哺乳动物受试者的单位剂量；每个单位包含所需制药学载体以及预定数量的活性物质，该预定量根据计算可生成期望治疗效果。本发明新型剂量单位形式的规格遵循且直接依赖(1)活性物质的独特特征和待实现的具体治疗效果；和(2)现有技术中有关复合这种活性物质用于治疗身体健康受损的活受试者的疾病的内在限制。
复合主要活性成分以用于与合适的制药学可接受载体一起在上文讨论的剂量单位形式中常规且有效施用有效量。例如，单位剂量形式可以包含0.5μg-大约2000mg主要活性化合物。以比例表述时，每ml载体中通常存在大约0.5μg-大约2000mg活性化合物。在组合物包含增补的活性成分的情况中，通过参照所述成分的常用施用剂量和方式来确定剂量。
药物组合物还可以包含遗传分子，诸如能够转染靶细胞的载体，其中载体携有能够表达鞘氨醇激酶变体或试剂的核酸分子。例如，载体可以是病毒载体。
下文非限制性实施例更完整的描述了本发明的更多特征。
实施例正如在经FLAG标记的转染子的Western印迹(图2)中看到的，G82DSK表达很好，而且根据与钙调蛋白的结合(数据未显示)，判断出其折叠正确。
G82DSK自身不具有鞘氨醇激酶活性，而且不遏制内源基线鞘氨醇激酶活性(图2)；然而，它完全遏制在用激活剂诸如TNF、IL-1和PMA处理细胞后看到的鞘氨醇激酶活性升高(图3和4)。在过度表达鞘氨醇激酶的细胞中也看到了这种功能“二元性”过度表达的基线水平没有改变，但是激活被降低了(图5)。防止程度有可能依赖鞘氨醇激酶与G82DSK的摩尔比。
此外，G82DSK抑制癌基因Ras刺激鞘氨醇激酶(图6)，而且还可能遏制癌发生的体外和体内标记物。抑制剂具有特异性，因为它不压制另一种酶蛋白激酶C(图7)或鞘磷脂酶(图8)的激活。此外，它的功能是稳定的，因为它在所有时间点抑制由TNF介导的激活(图4)，而且抑制TNF的下游效应诸如激活erk(图9)。
因此，生成了与至今广泛使用的化学抑制剂N，N-二甲基鞘氨醇(DMS)完全不同的鞘氨醇激酶抑制剂。DMS完全消除野生型鞘氨醇激酶的功能，而G82DSK只消除野生型鞘氨醇激酶的激活。在某种意义上，我们具有了新型药物的原型。
本领域熟练技术人员将领会，除了本文具体所述，可以容易的对本文描述的发明进行变化和修饰。应当理解，本发明包括所有这些变化和修饰。本发明还包括本说明书中个别或集中提及或指示的所有步骤、特征、组合物和化合物，以及所述步骤或特征的任意两项或多项的任何和所有组合。
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Trp130<210>4<211>138<212>PRT<213>哺乳动物<400>4Arg Val Leu Val Leu Leu Asn Pro Arg Gly Gly Lys Gly Lys Ala Leu1 5 10 15Gln Leu Phe Arg Ser His Val Gln Pro Leu Leu Ala Glu Ala Glu Ile20 25 30Ser Phe Thr Leu Met Leu Thr Glu Arg Arg Asn His Ala Arg Glu Leu35 40 45Val Arg Ser Glu Glu Leu Gly Arg Trp Asp Ala Leu Val Val Met Ser50 55 60Gly Asp Gly Leu Met His Glu Val Val Asn Gly Leu Met Glu Arg Pro65 70 75 80Asp Trp Glu Thr Ala Ile Gln Lys Pro Leu Cys Ser Leu Pro Ala Gly85 90 95Ser Gly Asn Ala Leu Ala Ala Ser Leu Asn His Tyr Ala Gly Tyr Glu100 105 110Gln Val Thr Asn Glu Asp Leu Leu Thr Asn Cys Thr Leu LeuLeu Cys115120 125Arg Arg Leu Leu Ser Pro Met Asn Leu Leu130 135<210>5<211>138<212>PRT<213>哺乳动物<400>5Arg Val Leu Val Leu Leu Asn Pro Gln Gly Gly Lys Gly Lys Ala Leu1 5 10 15Gln Leu Phe Gln Ser Arg Val Gln Pro Phe Leu Glu Glu Ala Glu Ile20 25 30Thr Phe Lys Leu Ile Leu Thr Glu Arg Lys Asn His Ala Arg Glu Leu35 40 45Val Cys Ala Glu Glu Leu Gly His Trp Asp Ala Leu Ala Val Met Ser50 55 60Gly Asp Gly Leu Met His Glu Val Val Asn Gly Leu Met Glu Arg Pro65 70 75 80Asp Trp Glu Thr Ala Ile Gln Lys Pro Leu Cys Ser Leu Pro Gly Gly85 90 95Ser Gly Asn Ala Leu Ala Ala Ser Val Asn His Tyr Ala Gly Tyr Glu100 105 110Gln Val Thr Asn Glu Asp Leu Leu Ile Asn Cys Thr Leu Leu Leu Cys115 120 125Arg Arg Arg Leu Ser Pro Met Asn Leu Leu130 135<210>6<211>138<212>PRT<213>哺乳动物<400>6Arg Leu Leu Leu Leu Val Asn Pro Phe Gly Gly Arg Gly Leu Ala Trp1 5 10 15Gln Trp Cys Lys Asn His Val Leu Pro Met Ile Ser Glu Ala Gly Leu20 25 30Ser Phe Asn Leu Ile Gln Thr Glu Arg Gln Asn His Ala Arg Glu Leu35 40 45Val Gln Gly Leu Ser Leu Ser Glu Trp Asp Gly Ile Val Thr Val Ser50 55 60Gly Asp Gly Leu Leu His Glu Val Leu Asn Gly Leu Leu Asp Arg Pro65 70 75 80Asp Trp Glu Glu Ala Val Lys Met Pro Val Gly Ile Leu Pro Cys Gly85 90 95Ser Gly Asn Ala Leu Ala Gly Ala Val Asn Gln His Gly Gly Phe Glu100 105 110Pro Ala Leu Gly Leu Asp Leu Leu Leu Asn Cys Ser Leu Leu Leu Cys115 120 125Arg Gly Gly Gly His Pro Leu Asp Leu Leu130 135<210>7<211>138<212>PRT<213>哺乳动物<400>7Arg Leu Aeu Ile Leu Val Asn Pro Phe Gly Gly Arg Gly Leu Ala Trp1 5 10 15Gln Arg Cys Met Asp His Val Val Pro Met Ile Ser Glu Ala Gly Leu20 25 30Ser Phe Asn Leu Ile Gln Thr Glu Arg Gln Asn His Ala Arg Glu Leu35 40 45Val Gln Gly Leu Ser Leu Ser Glu Trp Glu Gly Ile Val Thr Val Ser50 55 60Gly Asp Gly Leu Leu Tyr Glu Val Leu Asn Gly Leu Leu Asp Arg Pro65 70 75 80Asp Trp Glu Asp Ala Val Arg Met Pro Ile Gly Val Leu Pro Cys Gly85 90 95Ser Gly Asn Ala Leu Ala Gly Ala Val Ser His His Gly Gly Phe Glu100 105 110Gln Val Val Gly Val Asp Leu Leu Leu Asn Cys Ser Leu Leu Leu Cys115 120 125Arg Gly Gly Ser His Pro Leu Asp Leu Leu130 135<210>8<211>133<212>PRT<213>酵母<400>8Ser Ile Leu Val Ile Ile Asn Pro His Gly Gly Lys Gly Thr Ala Lys1 5 10 15Asn Leu Phe Leu Thr Lys Ala Arg Pro Ile Leu Val Glu Ser Gly Cys20 25 30Lys Ile Glu Ile Ala Tyr Thr Lys Tyr Ala Arg His Ala Ile Asp Ile35 40 45Ala Lys Asp Leu Asp Ile Ser Lys Tyr Asp Thr Ile Ala Cys Ala Ser50 55 60Gly Asp Gly Ile Pro Tyr Glu Val Ile Asn Gly Leu Tyr Arg Arg Pro65 70 75 80Asp Arg Val Asp Ala Phe Asn Lys Leu Ala Val Thr Gln Leu Pro Cys85 90 95Gly Ser Gly Asn Ala Met Ser Ile Ser Cys His Trp Thr Asn Asn Pro100 105 110Ser Tyr Ala Ala Leu Cys Leu Val Lys Ser Ile Glu Thr Arg Ile Asp115 120 125Leu Met Cys Cys Ser130<210>9<211>133<212>PRT<213>酵母<400>9Ser Ile Phe Val Ile Ile Asn Pro Phe Gly Gly Lys Gly Lys Ala Lys1 5 10 15Lys Leu Phe Met Thr Lys Ala Lys Pro Leu Leu Leu Ala Ser Arg Cys20 25 30Ser Ile Glu Val Val Tyr Thr Lys Tyr Pro Gly His Ala Ile Glu Ile35 40 45Ala Arg Glu Met Asp Ile Asp Lys Tyr Asp Thr Ile Ala Cys Ala Ser50 55 60Gly Asp Gly Ile Pro His Glu Val Ile Asn Gly Leu Tyr Gln Arg Pro65 70 75 80Asp His Val Lys Ala Phe Asn Asn Ile Ala Ile Thr Glu Ile Pro Cys85 90 95Gly Ser Gly Asn Ala Met Ser Val Ser Cys His Trp Thr Asn Asn Pro100 105 110Ser Tyr Ser Thr Leu Cys Leu Ile Lys Ser Ile Glu Thr Arg Ile Asp115 120 125Leu Met Cys Cys Ser130<210>10<211>132<212>PRT<213>粟酒裂殖酵母(S.pombe)<400>10Arg Phe Ile Val Phe Ile Asn Pro His Gly Gly Lys Gly Lys Ala Lys1 5 10 15His Ile Trp Glu Ser Glu Ala Glu Pro Val Phe Ser Ser Ala His Ser20 25 30Ile Cys Glu Val Val Leu Thr Arg Arg Lys Asp His Ala Lys Ser Ile35 40 45Ala Lys Asn Leu Asp Val Gly Ser Tyr Asp Gly Ile Leu Ser Val Gly50 55 60Gly Asp Gly Leu Phe His Glu Val Ile Asn Gly Leu Gly Glu Arg Asp65 70 75 80Asp Tyr Leu Glu Ala Phe Lys Leu Pro Val Cys Met Ile Pro Gly Gly85 90 95Ser Gly Asn Ala Phe Ser Tyr Ash Ala Thr Gly Gln Leu Lys Pro Ala100 105 110Leu Thr Ala Leu Glu Ile Leu Lys Gly Arg Pro Thr Ser Phe Asp Leu115 120 125Met Thr Phe Glu130<210>11<211>138<212>PRT<213>C.elegans<400>11Asn Leu Leu Val Phe Ile Asn Pro Asn Ser Gly Thr Gly Lys Ser Leu1 5 10 15Glu Thr Phe Ala Asn Thr Val Gly Pro Lys Leu Asp Lys Ser Leu Ile20 25 30Arg Tyr Glu Val Val Val Thr Thr Gly Pro Asn His Ala Arg Asn Val35 40 45Leu Met Thr Lys Ala Asp Leu Gly Lys Phe Asn Gly Val Leu Ile Leu50 55 60Ser Gly Asp Gly Leu Val Phe Glu Ala Leu Asn Gly Ile Leu Cys Arg65 70 75 80Glu Asp Ala Phe Arg Ile Phe Pro Thr Leu Pro Ile Gly Ile Val Pro85 90 95Ser Gly Ser Gly Asn Gly Leu Leu Cys Ser Val Leu Ser Lys Tyr Gly100 105 110Thr Lys Met Asn Glu Lys Ser Val Met Glu Arg Ala Leu Glu Ile Ala115 120 125Thr Ser Pro Thr Ala Lys Ala Glu Ser Val130 135<210>12<211>137<212>PRT<213>拟南芥(Arabidosis)<400>12Arg Leu Leu Val Phe Val Asn Pro Phe Gly Gly Lys Lys Ser Ala Arg1 5 10 15Glu Ile Phe Val Lys Glu Val Lys Pro Leu Phe Glu Asp Ala Asp Val20 25 30Gln Leu Glu Ile Gln Glu Thr Lys Tyr Gln Leu His Ala Lys Glu Phe35 40 45Val Lys Ser Met Asp Val Ser Lys Tyr Asp Gly Ile Val Cys Val Ser50 55 60Gly Asp Gly Ile Leu Val Glu Val Val Asn Gly Leu Leu Glu Arg Ala65 70 75 80Asp Trp Arg Asn Ala Leu Iys Leu Pro Ile Gly Met Val Pro Ala Gly85 90 95Thr Gly Asn Gly Met Ile Lys Ser Leu Leu Asp Thr Val Gly Leu Arg100 105 110Cys Cys Ala Asn Ser Ala Thr Ile Ser Ile Ile Arg Gly His Lys Arg115 120 125Ser Val Asp Val Ala Thr Ile Ala Gln130 135<210>13<211>24<212>DNA<213>哺乳动物<400>13gaacccgcgg ggcgccaagg gcaa 24<210>14<211>27<212>DNA<213>哺乳动物<400>14gctgaacccc cggggcgaca agggcaa27<210>15<211>21<212>DNA<213>哺乳动物<400>15cgcggcggcg ccggcaaggc c 21<210>16<211>21<212>DNA<213>哺乳动物<400>16ggcaagggcg ccgccttgca g 21<210>17<211>24<212>DNA<213>哺乳动物<400>17gtggtcatgg ccggcgacgg gctg 24<210>18<211>30<212>DNA<213>哺乳动物<400>18gtggtcatgg atggagacgg cctgatgcac 30<210>19<211>19<212>DNA<213>哺乳动物<400>19tcatgtctgc agacgggct 19<210 >20<211>26<212>DNA<213>哺乳动物<400>20tcatgtctga cgacggcctg atgcac 26<210>21<211>23<212>DNA<213>哺乳动物<400>21gtctggagat gcattgatgc acg23<210>22<211>20<212>DNA<213>哺乳动物<400>22ctggagacga tctgatgcac20<210>23<211>21<212>DNA<213>哺乳动物<400>23gccatccagg cccccctgtg t 21<210>24<211>24<212>DNA<213>哺乳动物<400>24gccatccagc ggccgctgtg tagc 24<210>25<211>23<212>DNA<213>哺乳动物<400>25agcctccctg cagcctctgg caa23<210>26<211>19<212>DNA<213>哺乳动物<400>26tcccagcaga ctctggcaa 19<210>27<211>24<212>DNA<213>哺乳动物<400>27cccagcagga tccgacaacg cgct2权利要求
1.在由第16-153位氨基酸确定的区域或功能等同区域中包含突变的鞘氨醇激酶变体或所述鞘氨醇激酶变体的衍生物、同系物、类似物、化学等同物或模拟物，其中所述变体展示催化活性相对于野生型鞘氨醇激酶而消除或降低。
2.依照权利要求1的鞘氨醇激酶变体，其中所述鞘氨醇激酶是人鞘氨醇激酶。
3.依照权利要求1或2的鞘氨醇激酶变体，其中所述突变包括单个或多个氨基酸替代、添加和/或删除。
4.依照权利要求3的鞘氨醇激酶变体，其中所述区域是由第70-90位氨基酸确定的。
5.依照权利要求4的鞘氨醇激酶变体，其中所述区域是由第79-84位氨基酸确定的。
6.依照权利要求5的鞘氨醇激酶变体，其中所述突变是用天冬氨酸替代第82位处的甘氨酸。
7.依照权利要求3-5任一项的鞘氨醇激酶变体，其中所述变体展示催化活性消除。
8.依照权利要求7的鞘氨醇激酶变体，其中所述变体包含选自下表的一处或多处氨基酸替代(1)G82D(2)G82A(3)G26D(4)S79D(5)G80D(6)K103A(7)G111D(8)G113D(9)G26A(10)K27A(11)K29A(12)S79A(13)G80A(14)K103R(15)G111A
9.在ATP结合位点区域或功能等同区域中包含突变的鞘氨醇激酶变体或所述鞘氨醇激酶变体的衍生物、同系物、类似物、化学等同物或模拟物，其中所述变体展示催化活性相对于野生型鞘氨醇激酶而消除或降低。
10.依照权利要求9的鞘氨醇激酶变体，其中所述鞘氨醇激酶是人鞘氨醇激酶。
11.依照权利要求9或10的鞘氨醇激酶变体，其中所述突变包括单个或多个氨基酸替代、添加和/或删除。
12.依照权利要求11的鞘氨醇激酶变体，其中所述区域是由第70-90位氨基酸确定的。
13.依照权利要求12的鞘氨醇激酶变体，其中所述区域是由第79-84位氨基酸确定的。
14.依照权利要求13的鞘氨醇激酶变体，其中所述突变是用天冬氨酸替代第82位的甘氨酸。
15.依照权利要求11-13任一项的鞘氨醇激酶变体，其中所述变体展示催化活性消除。
16.依照权利要求15的鞘氨醇激酶变体，其中所述变体包含选自下表的一处或多处氨基酸替代(1)G82D(2)G82A(3)G26D(4)S79D(5)G80D(6)K103A(7)G111D(8)G113D(9)G26A(10)K27A(11)K29A(12)S79A(13)G80A(14)K103R(15)G111A
17.选自下表的分离核酸分子1)包含编码鞘氨醇激酶变体或其衍生物、同系物、类似物、化学等同物或模拟物的核苷酸序列或其互补序列的分离核酸分子或其衍生物或等同物，所述变体在由第16-153位氨基酸定义的区域或功能等同区域中包含突变，其中所述变体展示催化活性相对于野生型鞘氨醇激酶而消除或降低；2)包含编码人鞘氨醇激酶变体或其衍生物、同系物、类似物、化学等同物或模拟物的核苷酸序列或其互补序列的分离核酸分子或其衍生物或等同物，所述变体在由第16-153位氨基酸确定的区域或功能等同区域中包含突变，其中所述变体展示催化活性相对于野生型人鞘氨醇激酶而消除或降低；3)包含编码人鞘氨醇激酶变体或其衍生物、同系物、类似物、化学等同物或模拟物的核苷酸序列或其互补序列的分离核酸分子或其衍生物或等同物，所述变体包含在由第16-153位氨基酸确定的区域或功能等同区域中具有单个或多个氨基酸替代、添加和/或删除的氨基酸序列，其中所述变体展示催化活性相对于野生型鞘氨醇激酶而消除或降低；4)包含编码人鞘氨醇激酶变体或其衍生物、同系物、类似物、化学等同物或模拟物的核苷酸序列或其互补序列的分离核酸分子或其衍生物或等同物，所述变体包含在由第70-90位氨基酸确定的区域或功能等同区域中具有单个或多个氨基酸替代、添加和/或删除的氨基酸序列，其中所述变体展示催化活性相对于野生型鞘氨醇激酶而消除或降低；5)包含编码人鞘氨醇激酶变体或其衍生物、同系物、类似物、化学等同物或模拟物的核苷酸序列或其互补序列的分离核酸分子或其衍生物或等同物，所述变体包含在由第79-84位氨基酸确定的区域或功能等同区域中具有单个或多个多氨基酸替代、添加和/或删除的氨基酸序列，其中所述变体展示催化活性相对于野生型鞘氨醇激酶而消除或降低；6)包含编码鞘氨醇激酶变体或其衍生物、同系物、类似物、化学等同物或模拟物的核苷酸序列或其互补序列的分离核酸分子或其衍生物或等同物，所述变体包含选自下表的一处或多处氨基酸替代(1)G82D(2)G82A(3)G26D(4)S79D(5)G80D(6)K103A(7)G111D(8)G113D(9)G26A(10)K27A(11)K29A(12)S79A(13)G80A(14)K103R(15)G111A；7)包含编码鞘氨醇激酶变体或其衍生物、同系物、类似物、化学等同物或模拟物的核苷酸序列或其互补序列的分离核酸分子或其衍生物或类似物，所述变体在ATP结合位点区域或功能等同区域中包含突变，其中所述变体展示催化活性相对于野生型鞘氨醇激酶而消除或降低。
18.用于检测能够调控FOSK与鞘氨醇激酶或其功能等同物或衍生物相互作用的试剂的方法，所述方法包括使包含所述鞘氨醇激酶和FOSK或其功能等同物或衍生物的细胞或其提取物接触推定试剂，并检测与所述相互作用有关的表达表型改变。
19.用于检测能够结合或联合由第16-153位氨基酸确定的鞘氨醇激酶区域或其功能等同物或衍生物的试剂的方法，所述方法包括使包含所述氨基酸区域或其功能等同物或衍生物的细胞接触推定试剂，并检测与鞘氨醇激酶或其功能等同物或衍生物的功能调控有关的表达表型改变。
20.依照权利要求19的方法，其中所述氨基酸区域是由第70-90位氨基酸确定的。
21.依照权利要求20的方法，其中所述氨基酸区域是由第79-84位氨基酸确定的。
22.用于分析、设计和/或修饰能够与由第16-153位氨基酸确定的鞘氨醇激酶区域或其衍生物相互作用并调控与所述鞘氨醇激酶有关的至少一种功能活性的试剂的方法，所述方法包括使所述鞘氨醇激酶或其衍生物接触推定试剂，并评估所述试剂与所述结合位点的相互作用互补性程度。
23.依照权利要求22的方法，其中所述氨基酸区域是由第70-90位氨基酸确定的。
24.依照权利要求23的方法，其中所述区域是由第79-84位氨基酸确定的。
25.依照权利要求18-24任一项的方法鉴定的试剂。
26.用于在哺乳动物中调控细胞功能活性的方法，所述方法包括在足以抑制、降低或下调野生型鞘氨醇激酶的至少一种功能活性的时间和条件下对所述哺乳动物施用有效量的依照权利要求1-17任一项的鞘氨醇激酶变体或依照权利要求25的试剂。
27.依照权利要求26的方法，其中所述活性是下调野生型鞘氨醇激酶基线活性和/或防止野生型鞘氨醇激酶激活。
28.哺乳动物中特征为异常的、不需要的或不适当的细胞活性的状况的治疗和/或预防方法，所述方法包括在足以抑制、降低或下调野生型鞘氨醇激酶的至少一种功能活性的时间和条件下对所述哺乳动物施用有效量的依照权利要求1-17任一项的鞘氨醇激酶变体或依照权利要求25的试剂，其中所述下调导致对细胞功能活性的调控。
29.依照权利要求28的方法，其中所述活性指下调野生型鞘氨醇激酶基线活性和/或防止野生型鞘氨醇激酶激活。
30.依照权利要求1-17任一项的鞘氨醇激酶变体或依照权利要求25的试剂在制造用于调控细胞功能活性的药物中的用途。
31.依照权利要求1-17任一项的鞘氨醇激酶变体或依照权利要求25的试剂用于调控细胞功能活性。
32.包含依照权利要求1-17任一项的鞘氨醇激酶变体或依照权利要求25的试剂以及一种或多种制药学可接受载体和/或稀释剂的药物组合物。
全文摘要
本发明总的涉及展示催化活性降低的鞘氨醇激酶变体及其衍生物、类似物、化学等同物和模拟物；具体而言，本发明涉及展示将鞘氨醇磷酸化成鞘氨醇－1－磷酸的能力降低的鞘氨醇激酶变体。本发明还包括编码所述鞘氨醇激酶变体及其衍生物、类似物和模拟物的遗传序列。本发明的变体可用于广泛的治疗和预防应用。
文档编号C12Q1/02GK1444654SQ01813405
公开日2003年9月24日 申请日期2001年6月20日 优先权日2000年6月28日
发明者S·皮特森, P·默莱迪, 夏朴, M·瓦达斯, B·沃顿伯格 申请人:梅德维特科学股份有限公司