生物合成的溶瘤分子及其用途的制作方法

专利名称：生物合成的溶瘤分子及其用途的制作方法
背景技术：
细胞程序性死亡或编程性细胞死亡是一种机制，通过该机制在胚胎发育过程中或组织中正常细胞更新时有明显的细胞亚群缺失。在各种形式的细胞损伤包括病毒感染、暴露于有毒试剂和辐射之后也可引发编程性细胞死亡。细胞繁殖和/或生存与细胞死亡之间的平衡是正常生理学以及如癌症疾病的发病机理的重要组成部分，这类疾病的特征在于生长失控。
骨桥蛋白(osteopontin)是独特的胞外基质磷蛋白，其功能是细胞粘连和迁移。骨桥蛋白也可通过两种类型的受体αvβ3整合素(integrin)和CD44蛋白多糖引发胞内信号转导路径。骨桥蛋白已被证实是细胞对氧化压力作出反应的重要介质，发挥抗氧化和抗凋亡作用。此外，骨桥蛋白能够抑制数种识别它的细胞种类的编程性细胞死亡(Weber，G.F.等(1997)Proc.Assoc.Am.Phys.，1091-9)。骨桥蛋白的表达也与包含动脉硬化、肿瘤发生和转移的病理状态有关(Oates，A.J.等(1997)Invasion Metast.，171-15)。


图1A描述人骨桥蛋白B(OPN-b)(SEQ ID NO1)的氨基酸序列，这是一种优选的人骨桥蛋白基因的剪接变体。图1B-C描述OPN-a/nt(SEQ ID NO2)和OPN-b/nt(SEQ ID NO3)的氨基酸序列，分别代表人骨桥蛋白A和骨桥蛋白B的剪切衍生物，它们可诱导编程性细胞死亡。图1D描述第一代生物合成的溶瘤分子，称之为“溶瘤素N”(“oncolysin N”)(SEQ ID NO4)。
图2A描述两个源自溶瘤素N的第二代生物合成的溶瘤分子溶瘤素1(SEQ ID NO5)和溶瘤素2(SEQ ID NO6)的氨基酸序列。图2B描述第二代生物合成的溶瘤分子溶瘤素3(分别是SEQ ID NOs7和8)的核苷酸和氨基酸序列。
图3描述用溶瘤素1/Sophin C感染的细胞与对照细胞相比信号转导路径的变更。条线图定量显示SHP-1蛋白表达的降低和PI-3激酶表达的增加。
图4描述溶瘤素1-感染对实验动物肿瘤模型中的肿瘤体积的影响。
图5描述溶瘤素1用于不同的肿瘤模型并用不同剂量时的效果。
发明详述本发明基于，至少部分基于，对骨桥蛋白作为细胞程序性死亡调节剂的新功能的阐明。特别是已发现骨桥蛋白包含一个结构域，当将其从骨桥蛋白中分离出来时能够诱导细胞程序性死亡。这一编程性细胞死亡片段的结合误连骨桥蛋白受体导致细胞程序性死亡。特别是当CD44v和αvβ3整合素在细胞中共表达时，该片段与它们结合。由于在正常环境下共表达十分罕见，包括该凋亡片段(apoptotic fragment)在内的蛋白质能够被用于摧毁确实能共表达这些受体的异常细胞，包括几种转移细胞和超活化的巨噬细胞，例如那些参与关节炎的细胞。
基于对骨桥蛋白溶瘤功能的发现，特别是对其凋亡区(apoptoticdomain)的发现，本发明的特征在于生物合成分子，这些分子以衍生自凋亡片段的骨桥蛋白为模型。该生物合成分子可用于调节细胞生长过程以及促进编程性细胞死亡。因此，在一个实施方案中，本发明的特征在于生物合成的溶瘤分子，这些分子包含凋亡成分和生物调节成分，它们形成的分子能够促进编程性细胞死亡。术语“生物合成分子”包含由成分或元件的组合或联合而构造或合成，所述元件比天然存在的蛋白质中的元件更简单，因此，仅选择天然存在分子的活性。本发明的生物合成分子由人工(包含自动化方法)来制造或构造，因此与从天然存在的生物方法中产生的天然存在的分子是可区别的。或者，可用生物体来生产本发明的生物合成分子，条件是在合成中至少有一步是人工介入。
术语“溶瘤”或“溶瘤分子”包含具调制或调节活性的分子，该活性通常与生物体如高等动物和人中的凋亡反应(apoptotic response)相关。与凋亡反应相关的活性(如生物活性或功能活性)可能是与诱导编程性细胞死亡相关的任一种活性，编程性细胞死亡的诱导是对发育信号、不良生长条件、病毒感染、细胞损伤或疾病的反应。术语“活性”、“生物活性”或“功能活性”是指由本发明分子所产生的活性(如生物合成分子或蛋白质、多肽或核酸分子)，如按照标准技术体内或体外进行测定。
术语“凋亡反应”包括与诱导编程性细胞死亡相关的任何反应，包括但不限于染色质的浓缩和断裂、细胞生存力的降低和细胞溶解。正如本文所定义，短语“调节凋亡反应”或“凋亡反应调节剂”包括上调、增强或增加凋亡反应。如本文所定义，短语“调节凋亡反应”或“凋亡反应调节剂”也包括下调、抑制或降低凋亡反应。
本发明进一步的特征在于包含凋亡成分的生物合成分子。术语“凋亡成分”(本文也指“凋亡区”或“原凋亡区(pro-apoptotic domain)”)包含分子的一段或者一个组分，它是该分子的一部分，比该分子小，其功能是促进细胞的凋亡。如本文所定义，凋亡成分包括能连接在细胞表面上表达的整合素(如αvβ3)和CD44(如CD44V)的成分，从而导致信号通过CD44(如JNK信号路径的激活)和整合素信号的阻断(如阻断任何其他能激活MAPK信号的配位体的结合)。包含凋亡成分(apoptotic component)的分子，例如，能够引发有生存力的细胞在凋亡成分存在下发生编程性细胞死亡，而同样的细胞在缺乏凋亡成分时不发生编程性细胞死亡。优选的凋亡成分或原凋亡区包含如SEQ IDNO1所示的人骨桥蛋白序列第147-170位氨基酸。或者，凋亡成分或原凋亡区包含SEQ ID NO1中第147-170位氨基酸的N末端或C末端的0-5、5-10、10-15或15-20个连续氨基酸残基并保留由SEQ ID NO1中第147-170位氨基酸组成的区域的凋亡活性的至少60％、优选至少70％、更优选至少80％和甚至更优选90-95％(例如由任何本领域认可的体外编程性细胞死亡测定中确定，或者单独测定或在如本文所定义的生物合成分子的情况下测定)。在另一个实施方案中，凋亡成分或原凋亡区包含少于SEQ ID NO1中第147-170位的24个氨基酸残基(例如，仅包含SEQ ID NO1从第147到第170位序列中15、16、17、18、19、20、21、22或23个连续氨基酸残基)并保留由SEQ ID NO1中第147-170位氨基酸组成的区域的凋亡活性的至少60％、优选至少70％、更优选至少80％和甚至更优选90-95％。在另一个实施方案中，凋亡成分或原凋亡区有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸残基替代并保留由SEQ ID NO1中第147-170位氨基酸组成的区域的凋亡活性的至少60％、优选至少70％、更优选至少80％和甚至更优选90-95％。
除凋亡成分以外，本发明的生物合成分子可包含生物调节成分。术语“生物调节成分”包含该分子的一段或者一个组分，它是该分子的一部分，比该分子小，它或者具有与凋亡成分截然不同的生物功能，或者具有与凋亡成分截然不同的生物结构。生物调节成分是一段或一个组分，其既未在包含凋亡成分的天然存在的分子中发现，也未在存在于天然发生的分子中与凋亡成分关系同样最近的成分中发现。在一个实施方案中，生物调节成分是一种多肽。本发明的多肽生物调节成分包括但不限于信号肽、接头区，和高尔基加工区。
术语“信号肽”或者“信号序列”指的是包含大约20个氨基酸的肽，其存在于分泌和完整的膜蛋白的N末端，包含大量疏水氨基酸残基。例如，一种信号序列包含至少约14-28个氨基酸残基，优选约16-26个氨基酸残基，更优选约18-24个氨基酸残基，和甚至更优选约20-22个氨基酸残基，并且有至少大约40-70％，优选大约50-65％，和更优选大约55-60％的疏水氨基酸残基(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸或脯氨酸)。这样的“信号序列”在本领域中也称作“信号肽”，用于指导含有此类序列的蛋白质从细胞的内质网到高尔基体并最终到脂双层(例如，为了分泌)。优选信号序列衍生自人骨桥蛋白(例如，包含如SEQ ID NO1所述的人骨桥蛋白序列第1-16位氨基酸。
术语“接头”包括一段区域，当其包含于本发明的蛋白质、多肽或生物合成分子中时，其功能是将球状折叠减到最少、分离调节蛋白质进入不同的功能区并维持蛋白质、肽或生物合成分子的功能性。
术语“高尔基加工区”包含一段区域，当其包含于本发明的蛋白质、多肽或生物合成分子中时，其功能是赋予分子具有从细胞中通过运输穿过内质网和高尔基体分泌的能力，和/或在内质网和高尔基体内得到修饰的能力，如通过添加碳水化合物残基。优选的高尔基加工区源于人骨桥蛋白(如包含如SEQ ID NO1所述序列的第17-30位氨基酸)。另外举例的生物调节成分包括，例如，肝素结合区和/或胶原蛋白结合区。如本文所用，术语“肝素结合区”包括有助于生物合成分子与胞外基质成分相结合的成分，例如，与靶细胞周围的胞外基质中的肝素结合，从而稳定生物合成分子与靶细胞的相互作用。“肝素结合区”包含至少1个，优选2个，更优选3、4、5或6个“肝素结合基元”，这些基元的结构式为arg-xaa-碱性残基-碱性残基，优选arg-xaa-(arg或lys)-(arg或lys)。举例的肝素结合基元包括RXRR、RXKK、RXRK和RXKR。连续的肝素结合基元优选地被任意两个氨基酸分开，如被xaa-xaa所分开。因此优选的肝素结合区的结构式为(R-X-R/K)-(X-X-R-X-R/K)n，其中n＝1，优选地为2，更优选地为3或4。在优选的实施方案中，n＝2。(附加的连续肝素结合基元可加上，但最终结果将降低而不是增加生物合成的溶瘤分子的凋亡效力)。特别优选的肝素结合区具有氨基酸序列RSKKAARGRR(SEQ IDNO6中第62-71位氨基酸)。另一特别优选的肝素结合区具有氨基酸序列RSKKAARGRRAARGRR(SEQ ID NO8中第62-77位氨基酸)。
如本文所用，术语“胶原蛋白结合区”包括有助于生物合成分子与胞外基质成分相结合的成分，如与靶细胞周围的胞外基质中的胶原蛋白结合，从而稳定生物合成分子与靶细胞的相互作用。特别优选的胶原蛋白结合区具有氨基酸序列PAGAAGGPAGPAGPAGPAGPAGP(SEQ ID NO6中第65-87位氨基酸)。
因此，本发明的生物合成分子的构成是至少一个凋亡区和一个生物调节成分的组合。术语“构成的”或“构成”包括将至少2个成分一起集合到一个结构和/或功能联合体中。例如，重组核酸分子的构成是将至少2个核酸成分集合在一起。或者，重组蛋白质的构成是将至少2个蛋白成分集合在一起。此外，组合物的构成是将至少2个组合物成分集合在一起。
在优选的实施方案中，本发明的特征在于生物合成分子，这些分子包含源白骨桥蛋白的凋亡成分。“源自”例如骨桥蛋白的成分指所包含的成分其某些特征最初来源于骨桥蛋白并能被识别，但又与骨桥蛋白不相同。优选的是凋亡成分有足够的结合整合素(例如，αvβ3整合素)序列信息但缺乏足够的经由整合素(例如，经由αvβ3整合素)序列信息发出信号。在一个实施方案中，凋亡成分是源自骨桥蛋白的多肽。因此，凋亡成分具有骨桥蛋白的特征(例如，促进编程性细胞死亡的功能)，但又与骨桥蛋白不相同。在一个实施方案中，凋亡成分包括与骨桥蛋白的凋亡区具有至少50％同一性的多肽。在另一个实施方案中，凋亡成分与骨桥蛋白的凋亡区的同一性至少为55％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更高。在另一实施方案中，凋亡成分包括由人骨桥蛋白B(SEQ ID NO1)第147-170位氨基酸的氨基酸序列。在另一实施方案中，凋亡成分包括与人骨桥蛋白B(SEQ IDNO1)第147-170位氨基酸的同一性至少为55％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更高的多肽。在另一实施方案中，凋亡成分包括长度至少为5-50个氨基酸的多肽。在另一个实施方案中，凋亡成分包括长度在10-45、15-40或20-30或21、22、23、24、25、26、27、28或29个氨基酸之间的多肽。在另一个实施方案中，凋亡成分包含长度大于50个氨基酸的多肽。
本发明的另一实施方案的特征体现在生物合成分子，这些分子包括凋亡成分，而凋亡成分的氨基酸序列与人骨桥蛋白(例如，SEQ IDNO1中第147-170位氨基酸)的凋亡区有足够的同源性。术语“足够的同源性”包括第一氨基酸或者核苷酸序列与第二氨基酸或者核苷酸序列比较含有足够的或者最低数量的相同或者相当的(例如，有相似侧链的氨基酸残基)氨基酸残基或者核苷酸，这样第一氨基酸或者核苷酸序列与第二氨基酸或者核苷酸序列就具有共同的结构域和/或共同的功能活性。例如，氨基酸或者核苷序列共享至少40％，优选50％，更优选60％、70％、80％或者90％的同一性并共享相同的功能活性，在此被定义为足够的同源性。在优选的实施方案中，凋亡成分保留有凋亡活性，优选骨桥蛋白的凋亡活性。在另一实施方案中，分子保留有溶瘤活性。本发明的进一步特征在于被分离的核酸分子，这些核酸分子编码本发明的生物合成的溶瘤分子。在一个实施方案中，本发明被分离的核酸分子包括编码凋亡区的核酸序列。在另一个实施方案中，本发明被分离的核酸分子包括编码生物调节区的核酸序列。
本发明的各个方面在下列分段中有更详细的描述I.被分离的核酸分子本发明的一个方面涉及被分离的核酸分子，这些核酸分子编码生物合成分子或其部分(如编码生物调节区的部分，例如，凋亡区)。术语“核酸分子”包括DNA分子(如cDNA或基因组DNA)和RNA分子(如mRNA)和由核苷酸类似物产生的DNA或RNA的类似物。核酸分子可以是单链或双链，但以双链DNA为优选。
“被分离的”的核酸分子是指与其它核酸分子分开的核酸分子，这些核酸分子均存在于天然的核酸资源中。优选的是被分离的核酸不含序列，所述序列天然地位于该核酸从中衍生的生物体的基因组DNA中的核酸的侧翼(如，位于核酸的5’和3’端的序列)。例如，在各种实施方案中，被分离的核酸分子可含有小于5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb或0.1kb的核苷酸序列，它们天然地位于该核酸从中衍生的细胞的基因组DNA中核酸分子的侧翼。此外，“被分离的”核酸分子，比如cDNA分子，当由重组技术生产时可基本上不含其他细胞物质或培养基或由化学合成时可基本上不含化学前体或其它化学品。
在另一优选的实施方案中，本发明被分离的核酸分子包含编码至少一个骨桥蛋白的凋亡区的核酸分子(如SEQ ID NO1中第147-170位)的氨基酸。优选的是被分离的核酸分子编码以下任何一个序列的生物合成分子SEQ ID NO4、SEQ ID NO5、SEQ ID NO6和SEQ IDNO8。举例的核酸如SEQ ID NO7所述。
为确定两个氨基酸序列或两个核酸的同源性百分率，达到最佳的比较目的，需对序列进行比对(如为了与第二氨基酸或核酸序列进行最优比对，在第一氨基酸或核酸序列的序列中可引入空位)。然后比较对应氨基酸或核苷酸位置上的氨基酸残基或核苷酸。当第一序列中的位置上与第二序列对应位置上的的氨基酸残基或核苷酸相同时，则该位置上的分子是同源的(即，本文所用的氨基酸或核酸“同源性”等同于氨基酸或核酸“同一性”)。两个序列间的同源性百分率是序列共有相同性位置数的函数(即，％同源性＝相同位置数/位置总数×100)。两个序列间的同源性百分率的确定可由数学算法完成。用于比较两个序列的数学算法中优选的非限制的例子是Karlin和Altschul(1990)在Proc.Natl.Acad.Sci.USA 872264-68中的算法，Karlin和Altschul(1993)在Proc.Natl.Acad.Sci.USA 905873-77中对其进行了修改。将此算法合并到Altschul(1990)等在J.Mol.Biol.215403-10中的NBLAST和XBLAST程序中。BLAST核苷酸搜索可由NBLAST程序执行，分值＝100，字码长＝12，以获得与本发明的制瘤素核酸分子同源的核苷酸序列。BLAST蛋白质搜索可由XBLAST程序执行，分值＝50，字码长＝3，以获得与本发明的制瘤素蛋白质分子同源的氨基酸序列。为比较目的要获得空位的比对，可用Altschul等(1997)在Nucleic Acids Research25(17)3389-3402中描述的空位BLAST。当应用BLAST和空位BLAST程序时，可使用各自程序(如XBLAST和NBLAST)的默认参数。参见http//www.ncbi.nlm.nih.gov.用于序列比较的数学算法中另一个优选的无限制的例子是Myers和Millerl在CABIOS(1989)中的算法。将此算法合并到ALIGN程序(2.0版本)中，该程序是GCG序列比对软件包的一部分。当应用ALIGN程序来比较氨基酸序列时，可使用PAM120加权残基表，空位长度罚分为12，空位罚分为4。
本发明的核酸或其部分可按照标准PCR扩增技术，利用cDNA、mRNA或基因组DNA作为模板以及合适的寡核苷酸引物来扩增。如此扩增的核酸可克隆到合适的载体并通过DNA序列分析来辨别其特征。而且，寡核苷酸可通过标准的合成技术来制备，如，使用全自动DNA合成仪。本发明中使用的探针/引物通常包含基本上纯的寡核苷酸。寡核苷酸通常包含核苷酸序列区域，该区域在严格条件下与编码SEQ ID NO1的有义序列至少约12、优选约25、更优选约40、50或70个连续核苷酸杂交。
编码本发明生物合成分子的“生物活性的”部分的核酸片段可通过下列方法制备分离核酸分子的部分，该核酸分子编码具有天然存在的蛋白质生物活性的多肽，所述部分从天然存在的蛋白质中衍生；表达天然存在蛋白质的编码部分(如通过体外重组表达)；以及评定天然存在蛋白质编码部分的活性。如本文所用，“天然存在”核酸分子指具有自然界存在的核苷酸序列的RNA或DNA分子(如编码天然蛋白质)。
本发明还包括因遗传密码的简并性而不同的核酸分子，但这些核酸分子仍可编码相同的生物合成分子(如，编码具有SEQ ID NO4、SEQ ID NO5、SEQ ID NO6或SEQ ID NO8中所示的氨基酸序列的蛋白质)。
除本发明生物合成分子的氨基酸序列以外，专业技术人员将理解通过突变可将变化引入到编码这些氨基酸序列的核苷酸序列中从而导致所编码的生物合成分子的氨基酸序列变化，但并不改变其功能。例如，核苷酸替代导致“非必需”氨基酸残基上的氨基酸替代(特别是保守的氨基酸替代)可在编码的核酸序列中进行。“非必需”氨基酸残基是指在序列中可改变的残基(如SEQ ID NO1中第147-170位)的氨基酸，但却不改变生物活性，然而“必需”氨基酸残基对生物活性是必需的。例如，在不同物种的蛋白质或蛋白质区域中保守的氨基酸残基被认定为特别不容易改变。因此，本发明的另一方面涉及生物合成分子—编码的核酸分子，该核酸分子编码不是活性所必需的氨基酸残基编码的变化。编码的产物在氨基酸序列上可能与，例如SEQ IDNO1中第147-170位的氨基酸不同，但仍然保持生物活性。在一个实施方案中，被分离的核酸分子包含编码蛋白质的核苷酸序列，所述蛋白与SEQ ID NO2中第147-170位的氨基酸具有至少约60％的同源性。优选的是由该核酸分子编码的蛋白质与SEQ ID NO1中第147-170位的氨基酸具有至少约65-70％的同源性。更优选的是与与SEQ ID NO1中第147-170位的氨基酸具有至少约75-80％的同源性。甚至更优选的是与SEQ ID NO1中第147-170位的氨基酸至少约85-90％的同源性，以及最优选的是与SEQ ID NO1中第147-170位的氨基酸具有至少约95％的同源性。
优选地，保守氨基酸的替代可发生在一个或多个预测的非必需氨基酸残基处。“保守氨基酸的替代”是指其中氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基所替换。本领域已定义了具有相同侧链的氨基酸残基家族。这些家族包括带有碱性侧链的氨基酸(如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)，带有酸性侧链的氨基酸(如天冬氨酸、谷氨酸)，不带电荷的极性侧链氨基酸(如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)，非极性侧链氨基酸(如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸)，β-支链氨基酸(如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香侧链氨基酸(如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，预计的非必需氨基酸残基优选用来自相同侧链家族的另一个氨基酸残基所替换。或者，在另一个实施方案中，沿着全部或部分的编码序列可通过饱和诱变来随机引入突变，以及通过检测其生物活性对产生的突变体进行筛选来鉴定保持活性的突变体。在编码SEQ ID NO1的核酸的发生突变之后，新的编码蛋白可通过重组表达，以及该蛋白的活性也可测定。II.被分离的生物合成分子本发明的一个方面涉及被分离的生物合成分子及其部分。在一个实施方案中，本发明的生物合成分子由重组DNA技术来生产。除重组表达以外，利用标准的肽合成技术可化学合成生物合成分子。
“被分离的”或“纯化的”生物合成分子基本上不含有来自所述分子从中衍生的细胞或组织来源中的细胞物质或其他污染的蛋白质，或由化学合成时基本上不含有化学前体或其它化学品。术语“基本上不含有细胞物质”包括制剂，其中重组分子分离自细胞的细胞成分，从这些细胞中该分子被分离或重组生产。在一个实施方案中，术语“基本上不含有细胞物质”包括制剂，其具有少于约30％(干重)的非生物合成分子(本文也称为“污染物质”)，更优选污染物质少于约20％，更优选污染物质少于约10％，以及最优选污染物质少于约5％。当本发明中的生物合成分子通过重组来生产时，还优选基本上不含有培养基，即培养基占制剂体积的比例少于约20％，更优选少于约10％，以及最优选少于约5％。
术语“基本上不含有化学前体或其它化学品”包括制剂，其中生物合成分子分离自参与了所述分子合成的化学前体或其它化学品。在一个实施方案中，术语“基本上不含有化学前体或其它化学品”制剂，其具有少于约30％(干重)的化学前体或污染的化学品，更优选化学前体或污染的化学品少于约20％，更优选化学前体或污染的化学品少于约10％，以及最优选化学前体或污染的化学品少于约5％。
本发明生物合成分子的生物活性部分包括与本发明生物合成分子有足够同源性或衍生自本发明生物合成分子的分子，如SEQ ID NO1所示的氨基酸序列，这些分子包括少于全长多肽的氨基酸序列，但显示至少一倍全长多肽的活性。通常，生物活性部分包含具有至少一倍全长多肽的活性的区域或基元。生物活性部分可以是如长度为10、25、50、100或更多个氨基酸的多肽。
本发明还提供嵌合或融合蛋白。术语“嵌合蛋白”或“融合蛋白”包括与第二多肽(如非骨桥蛋白衍生的多肽)可操作连接的第一多肽(如骨桥蛋白衍生的多肽)。“骨桥蛋白衍生的多肽”指具有源自骨桥蛋白的氨基酸序列的多肽，而“非骨桥蛋白衍生的多肽”指一种多肽，该多肽具有与基本上不同源于骨桥蛋白的蛋白质相对应的氨基酸序列。在融合蛋白中，第一多肽可与骨桥蛋白的全部或部分对应。在优选的实施方案中，融合蛋白包含至少一个骨桥蛋白的生物活性部分。在另一优选的实施方案中，融合蛋白包含至少两个骨桥蛋白的生物活性部分。在融合蛋白中，术语“可操作连接”意指第一多肽和第二多肽在结构上相互融合。第一多肽可与第二多肽的N-末端或C-末端融合。
例如，在一个实施方案中，融合蛋白是GST-融合蛋白，其中将目的多肽序列(如凋亡区序列)与GST序列的C-末端融合。此类融合蛋白可有助于重组蛋白的纯化。
在另一实施方案中，融合蛋白在其N-末端含有异源信号序列。例如，天然骨桥蛋白信号序列(即SEQ ID NO1中大约第1-16位的氨基酸)可移去除并用另一蛋白质的信号序列替换。在某些宿主细胞(如哺乳动物宿主细胞)中，通过使用异源信号序列可增加融合蛋白的表达和/或分泌。
在另一实施方案中，融合蛋白是免疫球蛋白的融合蛋白，其中将目的序列(如凋亡区序列)与源自免疫球蛋白家族成员的序列融合。可溶性衍生物也可用免疫球蛋白基因超家族中的细胞表面糖蛋白制成，其由与免疫球蛋白恒定区(Fc)相融合的细胞表面糖蛋白的胞外结构域组成(参见，如Capon等(1989)Nature337525-531和Capon美国专利5,116,964和5,428,130[CD4-IgG1构建体]；Linsley等(1991)J.Exp.Med.173721-730[CD28-IgG1构建体和B7-1-IgG1构建体]；和Linsley等(1991)J.Exp.Med.174561-569和美国专利5,434,131[CTLA4-IgG1])。
将本发明的免疫球蛋白融合蛋白掺入到药物组合物中以及施用给个体，并可治疗性地用于对细胞程序性死亡的调节。此外，本发明的免疫球蛋白融合蛋白可用作免疫原在个体中产生抗体、纯化配体以及用于筛选测定中。
优选地，本发明嵌合蛋白或融合蛋白的生产方法采用标准的重组DNA技术。例如，按照常规技术将编码不同多肽序列的DNA片段一起连接在框架中，如使用用于连接的平末端或交错末端、限制性酶消解以提供合适的末端、如合适粘末端的补平、碱性磷酸酶处理以避免不需要的连接以及酶连接。在另一实施方案中，可通过包括全自动DNA合成仪的常规技术来合成融合基因。或者，使用锚定引物对基因片段进行PCR扩增，所述锚定引物产生两个连续基因片段之间的互补突出端，继之以退火和再扩增从而生成嵌合基因序列(参见，如CurrentProtocols in Molecular Biology，Ausubel等编，John Wiley和Sons，1992)。此外，许多已编码融合部分的表达载体是市售的(如GST多肽)。可将编码目的区(如凋亡区序列)的核酸克隆到这种表达载体中，使得融合部分与目的区连接在框架中。III.重组表达载体和宿主细胞本发明的另一方面涉及载体，优选是表达载体，其含有编码目的区的核酸(例如凋亡区序列)。如本文所用，术语“载体”指能够运送与之已连接的另一核酸分子的核酸分子。一种类型的载体是“质粒”，指圆形双链DNA环，其中可连接额外的DNA片段。另一类型的载体是病毒载体，其中可将额外的DNA片段连接到病毒基因组中。某些载体能在其导入的宿主细胞中自动复制(例如，具有细菌复制起点的细菌载体和游离型哺乳动物载体)。其它载体(如非-游离型哺乳动物载体)在导入宿主细胞后被整合到宿主细胞的基因组中，由此同宿主基因组一起复制。此外，某些载体能指导与它们可操作连接的基因的表达。这样的载体本文称为“表达载体”。一般而言，用于重组DNA技术中的表达载体经常为质粒形式。在本说明书中，“质粒”和“载体”可交换使用，因为质粒是最常用的载体形式。然而，本发明意在包括这些其它形式的表达载体，如病毒载体(如复制缺陷型反转录病毒、腺病毒和腺伴随病毒)，它们具有同等的功能。
本发明的重组表达载体包含本发明的核酸，其形式适合于核酸在宿主细胞中表达，这意味着重组表达载体包括一个或多个调节序列，依据用于表达的宿主细胞进行选择，其与待表达的核酸序列可操作连接。在重组表达载体中，“可操作连接”表示将目的核苷酸序列以允许其表达核苷酸序列的方式连接到调节序列上(如在体外转录/翻译系统中或在载体导入其中的宿主细胞中)。术语“调节序列”包括启动子、增强子和其它表达控制元件(如多聚腺苷酸信号)。这些调节序列描述在例如Goeddel，Gene Expression TechnologyMethods inEnzymology 185，Academic Press，San Diego，CA(1990)中。调节序列包括那些指导在许多类型宿主细胞中的核苷酸的连续表达以及那些指导仅在某些宿主细胞中的核苷酸的表达(如组织特异的调节序列)。本领域技术人员将理解表达载体的设计可取决于如待转化的宿主细胞的选择，所需蛋白的表达水平等因素。可将本发明的表达载体导入到宿主细胞中，由此生产由本发明所述核酸编码的蛋白质或肽，包括融合蛋白质或肽。
本发明的重组表达载体可设计成在原核或真核细胞中表达。例如，重组蛋白质可表达在细菌细胞中，如大肠杆菌(E.coli)、昆虫细胞(利用杆状病毒表达载体)、酵母细胞或哺乳动物细胞。合适的宿主细胞在Goeddel，Gene Expression TechnologyMethods inEnzymology185，Academic Press，San Diego，CA(1990)中进一步讨论。或者，重组表达载体可在体外转录和翻译，例如利用T7启动子调节序列和T7聚合酶。
原核细胞中蛋白质的表达最常见的是在携有载体的大肠杆菌中进行，所述载体含有组成型或诱导型启动子，其指导融合或非融合蛋白的表达。融合载体在其中编码的蛋白质通常在重组蛋白的氨基端上添加许多氨基酸。这些融合载体通常用作三个目的1)增加重组蛋白质的表达；2)增加重组蛋白质的可溶性；和3)通过在亲和纯化中用作配体有助于重组蛋白质的纯化。通常在融合表达载体中，蛋白酶剪切位点导入到融合部分和重组蛋白的连接处，以使在随后的纯化融合蛋白时将重组蛋白质从融合部分中分开。这些酶及其相关的识别序列包括Xa因子、凝血酶和肠激酶。典型的融合表达载体包括pGEX(Pharmacia Biotech Inc；Smith，D.B.和Johnson，K.S.(1988)Gene6731-40)、pMAL(New England Biolabs，Beverly，MA)和pRIT5(Pharmacia，Piscataway，NJ)，这些表达载体分别将谷胱甘肽S-转移酶(GST)、麦芽糖E结合蛋白或蛋白A融合到靶重组蛋白质上。
合适的诱导型非融合E.coli表达载体的例子包括pTrc(Amann等，(1988)Gene 69301-315)和pET11d(Studier等，Gene ExpressionTechnologyMethods in Enzymology 185，Academic Press，San Diego，California(1990)60-89)。来自pTrc载体的靶基因表达依赖于来自杂合trp-lac融合启动子的宿主RNA聚合酶。来自pET11d载体的靶基因表达依赖于来自由共表达的病毒RNA聚合酶(T7gnl)介导的T7gnl0-lac融合启动子的转录。这种病毒聚合酶在lacUV5启动子的转录控制下由来自内含T7gnl基因的停留λ原噬菌体的宿主菌株BL21(DE3)或HMS174(DE3)提供。
在E.coli中使重组蛋白质表达最大化的一种策略是在具有减弱的蛋白酶剪切重组蛋白能力的宿主细菌中表达蛋白(Gottesman，S.，Gene Expression TechnologyMethods in Enzymology 185，AcademicPress，San Diego，California(1990)119-128)。另一策略是改变准备插入到表达载体中的核酸的核酸序列，以便各个氨基酸的单个密码子都是E.coli偏爱使用的那些密码子(Wada等，(1992)Nucleic Acids Res.202111-2118)。本发明核酸序列的这些改变可通过标准DNA合成技术来进行。
在另一实施方案中，表达载体是酵母表达载体。在酿酒酵母(S.Cerevisae)中表达的载体的例子包括pYepSecl(Baldari等，(1987)EmboJ.6229-234)、pMFa(Kurjan和Herskowitz，(1982)Cell 30933-943)、pJRY88(Schultz等，(1987)Gene 54113-123)、pYES2(InvitrogenCorporation，San Diego，CA)和picZ(In Vitrogen Corp，San Diego，CA)。
或者，重组蛋白利用杆状病毒表达载体可在昆虫细胞中表达。用于在培养的昆虫细胞(如Sf9细胞)中表达蛋白的杆状病毒载体包括pAc系列(Smith等(1983)Mol.Cell Biol.32156-2165)和pVL系列(Lucklow和Summers(1989)Virology 17031-39)。
在另一实施方案中，本发明的核酸利用哺乳动物表达载体在哺乳动物细胞中表达。哺乳动物表达载体的例子包括pCDM8(Seed，B.(1987)Nature 329840)和pMT2PC(Kaufman等(1987)EMBO J.6187-195)。当利用哺乳动物细胞时，表达载体的控制功能常由病毒的调节元件来提供。例如，常用的启动子源自多瘤病毒(polyoma)、腺病毒2、巨细胞病毒和猿猴病毒40。其他用于原核和真核细胞的合适的表达系统参见Sambrook，J.，Fritsh，E.F.和Maniatis，T.，第16和17章，Molecular CloningA Laboratory Manual.2nd，ed，Cold Spring HarborLaboratory，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989。
在另一实施方案中，重组哺乳动物表达载体能够指导核酸优先在特定细胞类型中表达(如组织特异的调节元件用于表达核酸)。组织特异的调节元件是本领域已知的。合适的组织特异的启动子非限制的例子包括白蛋白启动子(肝特异的；Pinkert等(1987)Genes Dev.1268-277)；淋巴特异的启动子(Calame和Eaton(1988)Adv.Immunol.43235-275)，尤其是T细胞受体的启动子(Winoto和Baltimore(1989)EMBO J.8729-733)和免疫球蛋白的启动子(Banerji等(1983)Cell33729-740；Queen和Baltimore(1983)Cell 33741-748)；神经元特异的启动子(如神经丝启动子；Byrne和Ruddle(1989)PNAS 865473-5477)；胰腺特异的启动子(Edlund等(1985)Science 230912-916)以及乳腺特异的启动子(如牛乳清启动子；美国专利号4,873,316和欧洲专利申请公开号264,166)。还包括发育调节的启动子，例如鼠盒启动子(murine box promoters)(Kessel和Gruss(1990)Science249374-379)和α-胎儿蛋白启动子(Campes和Tilghman(1989)GenesDev.3537-546)。
本发明进一步提供了重组表达载体，其包含以反义方向克隆到表达载体中的本发明DNA分子。即DNA分子以允许表达RNA分子的方式可操作连接到调节序列上，所述RNA分子反义于制癌素mRNA。选择可操作连接到以反义方向克隆的核酸上的调节序列，其指导在各种细胞类型中的反义RNA分子的连续表达，例如病毒启动子和/或增强子，或选择调节序列，其指导组成型的组织特异或细胞类型特异的反义RNA的表达。反义表达载体可采用重组质粒、噬菌粒或减毒病毒的形式，其中反义核酸在高效率调节区的控制下生产，其活性可由该载体导入的细胞类型来测定。对于利用反义基因调节基因表达的讨论参见Weintrub，H.等，反义RNA作为分子工具用于遗传分析，Reviews-Trends in Genetics，Vol.1(1)1986。
本发明的另一方面涉及宿主细胞，本发明的重组表达载体已导入其中。术语“宿主细胞”和“重组宿主细胞”本文相互交换使用。可理解的是这些术语不仅指特定的受试细胞而且指这种细胞的后代或潜在的后代。这是因为某些修饰可发生在下一代中，无论是突变还是环境影响，事实上，这种后代不会与亲本细胞相同，但仍然包括在如本文所用的术语范围内。
宿主细胞可以是任何原核或真核细胞。例如，制癌素蛋白可在如E.coli的细菌细胞、昆虫细胞、酵母或哺乳动物细胞(如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)或COS细胞)中表达。其他合适的宿主细胞对本领域技术人员是已知的。
通过常规转化或转染技术可将载体DNA导入原核或真核细胞中。如本文所用，术语“转化”和“转染”意指本领域公认的各种将外源基因(如DNA)导入宿主细胞中的技术，包括磷酸钙或氯化钙共沉淀、DEAE-葡聚糖介导的转染、脂转染法或电穿孔。合适的转化或转染宿主细胞的方法可在Sambrook等(Molecular CloningA LaboratoryManual 2nded.，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989)和其他实验手册中找到。
为了获得哺乳类细胞的稳定转染，已知依靠所用的表达载体和转染技术，只有小部分的细胞可将外源DNA整合到基因组中。为了鉴定和挑选这些整合体，一般将编码选择性标记的基因和目的基因一起导入宿主细胞中。优选的选择性标记包括那些赋予药物抗性的标记，如G418、潮霉素和氨甲蝶呤。编码选择性标记的核酸可在编码重组蛋白的相同载体上导入宿主细胞，或可用单独的载体导入宿主细胞。用导入的核酸稳定转染的细胞可由药物选择来进行鉴定(如掺入了选择性标记基因的细胞将存活，而其它细胞则死亡)。
本发明中的宿主细胞，如培养中的原核或真核宿主细胞，可用来生产(即表达)重组蛋白质。因此，本发明进一步提供利用本发明的宿主细胞生产重组蛋白质的方法。在一个实施方案中，该生产方法包括在合适的培养基上培养本发明的宿主细胞(在该宿主细胞中编码重组蛋白的重组表达载体已被导入)以便生产重组蛋白。在另一实施方案中，该方法进一步包括从培养基或宿主细胞中分离重组蛋白。IV.药物组合物本发明的核酸分子、蛋白质和生物合成分子(本文也称“活性化合物”)可掺入到适于给药的药物组合物中。此类组合物通常包含核酸分子、蛋白质或抗体以及可药用载体。如本文所用的术语“可药用载体”旨在包括任意和所有溶剂、分散介质、包被物、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸附延缓剂等，以满足药物给药要求。这类介质和药剂用于药物活性物质是本领域已知的。除了任何常规介质或药剂与活性化合物不相配伍的情况以外，它们在组合物中的应用应慎重考虑。辅助的活性化合物也可掺入该组合物中。
本发明的药物成分被制成制剂以符合所需的给药途径。给药途径的例子包括肠胃外给药，如静脉内、皮内、皮下、口服(如吸入)、经皮(局部)、跨粘膜和直肠内给药。对于肠胃外、皮内或皮下应用的溶液或悬浮液可包括下列组分无菌稀释液如注射水、盐溶液、不挥发性油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成溶剂；抗菌素如苄基醇或甲基对羟基苯甲酸酯类；抗氧化剂如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂如乙二胺四乙酸；缓冲液如醋酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐以及用于调节渗透压的试剂如氯化钠或葡萄糖。pH可用酸或碱如盐酸或氢氧化钠调节。肠胃外制剂可密封于安瓿瓶中、一次性注射器或由玻璃或塑料做成的多剂量小瓶中。
适于注射用的药物组合物包括无菌水溶液(如果是水溶性的)或乳液和无菌粉末，用于无菌注射液或乳液的临时制备。对于静脉内给药，适合的载体包括生理盐水、无菌水、Cremophor ELTM(BASF，Parsippany，NJ)或磷酸缓冲盐水(PBS)。在所有情况下，组合物必须是无菌的并且应该是流动的，其程度最起码能容易注射。在生产和保存条件下必须是稳定的，而且必须保存在抗微生物如细菌或真菌污染的条件下。载体可以是溶剂或分散介质，其含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)及其适当的混合物。例如通过采用包被物如卵磷脂、在乳液的情况下通过维持所需的颗粒大小以及通过采用表面活性剂来维持合适的流动性。通过各种抗细菌剂或抗真菌剂如对羟基苯甲酸酯类、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸和硫柳汞等来预防微生物的作用。在许多情况下，组合物中包含等渗剂，例如糖，多元醇如甘露醇、山梨糖醇，氯化钠将是优选的。通过在组合物中包括延迟吸收的药剂如单硬脂酸铝和凝胶可带来注射组合物的延迟吸收。
无菌注射液的制备可通过在适当溶剂中按要求以所需剂量掺入活性化合物(如制瘤素蛋白或抗制瘤素抗体)和以上所列成分的一种或几种组合，接着无菌过滤。一般而言，乳液的制备是将活性化合物掺入到无菌媒介物中，所述媒介物含有基本的分散介质和所需的以上所列的其它成分。在用无菌粉末制备无菌注射液的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥，这样会从已经无菌过滤的溶液中产生活性成分加上任何所需的附加成分的粉末。
一般口服组合物包括惰性稀释液或可食用载体。它们能被封装在胶囊中或压制成片剂。为了口服治疗目的，活性化合物可与赋形剂混合以片剂、药片或胶囊的形式使用。口服组合物还可用液体载体制备，以用于漱口液，其中液体载体中的化合物适于口内给药，来回漱口后吐出或吞咽。药物相容性结合剂和/或佐剂物质可成为该组合物的部分。片剂、药丸、胶囊、药片等可包含下列任一种性质相似的成分或化合物粘合剂如微晶纤维素、西黄蓍胶或凝胶，赋形剂如淀粉或乳糖，崩解剂如褐藻酸、Primogel或玉米淀粉，润滑剂如硬脂酸镁或Sterotes；助流剂(glidant)如二氧化硅胶体，甜味剂如蔗糖或糖精或调味剂如胡椒薄荷、甲基水杨酸酯或橙味剂。
对于吸入给药，化合物以气雾剂的形式从受压容器或分送器或喷雾器中送递，所述气雾剂含有合适的助推剂如气体二氧化碳。
全身性给药也可采用跨粘膜或经皮的方法。对于跨粘膜或经皮给药，制剂中采用适当的渗透剂穿过障碍。这些渗透剂为业内人员所熟知，它们包括如用于跨粘膜给药、去污剂、胆汁盐以及梭链孢酸衍生物。跨粘膜给药可通过使用鼻腔喷剂或栓剂来完成。对于经皮给药，将活性化合物制成业内所熟知的药膏、凝胶或面霜。
化合物可以用于直肠送递的栓剂(如常规栓剂基质如可可油或其它甘油酯)或固位灌肠剂的形式制备。
在一个实施方案中，活性化合物与载体一起制备，所述载体可防止化合物从体内迅速消失，例如受控的缓释制剂，包括植入和微胶囊传递系统。可使用生物可降解的、生物可相容的多聚体，如乙酸乙烯乙烯基酯(ethylene vinyl acetate)、多酐、聚乙二醇酸、胶原质、聚邻脂和聚乳酸。这种制剂的制备方法为业内人士所熟知。这些物质可从Alza公司和Nova制药公司购得。脂质体悬浮液(包括用针对病毒抗原的单克隆抗体靶向受感染细胞的脂质体)也可用作可药用载体。这些都可用业内人士所熟知的方法制备，如美国专利号4,522,811中所述。
以剂量单位形式将口服或肠胃外的组合物制成制剂对于方便给药和统一剂量尤其有利。本文所用的剂量单位形式是指实体上分开的单位，适用作待治疗个体的单一剂量；各单位包含预定量的活性化合物，这个量是根据欲达到的治疗效果与所需的药物载体相结合而计算出来的。本发明剂量单位形式的规格的指定受到并直接依赖于活性化合物的独特特性和所要达到的特定的治疗效果，以及本领域固有的混合这样的活性化合物用于治疗个体的限制。
这些化合物的毒性和治疗功效可在细胞培养物或试验动物中用标准的制药学程序来测定，如测定LD50(50％种群的致死剂量)和ED50(50％种群治疗有效的剂量)。在毒性和治疗效果之间的剂量比率为治疗指数，它可表述为比率LD50/ED50。优选显示高治疗指数的化合物。显示有毒副作用的化合物，如果要用的话，在设计将这些化合物靶向受影响组织的部位的传递系统时须谨慎，从而使它对未感染细胞的潜在伤害最小化，因此降低副作用。
从细胞培养物测定和动物研究中获得的数据可用于制成人所用的剂量范围。这些化合物的剂量优选属于循环浓度的范围内，所述浓度包括很小或无毒性的ED50。剂量在此范围内可发生变化，这取决于所用的剂量形式和所用的给药途径。对于在本发明方法中所用的任何化合物，治疗有效量最初可从细胞培养物测定中评估出来。剂量可在动物模型中制成，以达到包括IC50(即达到一半的最大抑制症状的测试化合物浓度)的循环血浆浓度范围，如细胞培养物中所测定。这种信息能用于更准确地测定人所用的剂量。原生质中的水平可例如通过高效液相色谱来测试。
可将本发明的核酸分子插入到载体中，并用作基因治疗载体。基因治疗载体能被传递给个体，例如通过静脉注射、局部给药(参见美国专利5,328,470)或定向注射(参见例如Chen等(1994)PNAS913054-3057)。基因治疗载体的药物制剂可包括在可接受的稀释液中的基因治疗载体，或可包含缓释的基质，其中包埋了基因传递媒介物。或者，如果全部基因传递载体能从重组细胞中完整地生产，如反转录病毒载体，则药物制剂可包括一个或多个产生基因传递系统的细胞。
药物组合物与给药说明书一起可包装在容器、小包(pack)或分送器中。V.发明用途和方法本发明提供了处理个体(如人个体)的预防和治疗的方法。在一个方面，本发明提供在个体中的预防方法。药剂的预防性施用可发生在所需疾病或失调的症状未表现之前，从而疾病或失调被阻止或者延迟其恶化。本发明的预防性方法可以本文所述的治疗性方法相同的方式进行，尽管剂量和治疗方案或许有些不同。
本发明的另一方面涉及治疗个体的方法。在一个实施方案中，本发明包括调节凋亡反应的方法。具体而言，凋亡反应的调节包括但不限于细胞染色质结构的调节、细胞生存力的调节或细胞溶解的调节。本发明的一个优选实施方案包括编程性细胞死亡的调节，尤其是促进编程性细胞死亡。因此，本发明方法在消除异常或不需要的细胞方面具有治疗效用。这种调节方法在疾病如癌症中和在以巨噬细胞超活化为特征的炎症疾病如关节炎中是特别有用的。
本发明的调节方法涉及将细胞与调节一种或多种与凋亡反应相关的活性的药剂相接触。在优选的实施方案中，与本发明生物合成的溶瘤分子相接触的细胞存在于个体中。接触个体内的细胞可通过直接施用生物合成分子或通过如实施例3-5中所示范的反转录病毒传递或通过任一种本领域公认的将多肽导入个体内或在个体内表达多肽的方法来实现。
本发明通过下述的实施例进一步得到了说明，但这无论如何不能解释为进一步限制。本申请引用的所有参考文献中的全部内容(包括文献索引、已颁发的专利和已公布的专利申请)在此专门引作参考。举例细胞在培养基中生长，并用不同剂量的外源溶瘤素N处理。编程性细胞死亡的测定通过流式细胞仪根据propidium iodide的吸收进行。将细胞收集在含有5mM EDTA的磷酸缓冲液中，并固定在50％乙醇中30分钟。用40μM核糖核酸酶A室温下处理30分钟以除去RNA，然后用含有5mM EDTA的磷酸缓冲液中的100μg/ml propidium iodide温育细胞。在凋亡细胞中的DNA切割通过流式细胞仪分析来评估，因为含有亚二倍体核的细胞比完整核结合更少的propidium iodide。
细胞编程性死亡也可以本领域的标准来测定，如核浓缩，染色质断裂和细胞生存力，如用台盼蓝排斥法来进行评估。
为了生成溶瘤素2，合成的胶原蛋白区在溶瘤素的C末端加工。溶瘤素2的氨基酸序列如SEQ ID NO6所述。细胞编程性死亡测定如实施例1中所述。溶瘤素2在促进编程性细胞死亡方面比溶瘤素N更有效。
为了生成溶瘤素1/Sophin C，合成的肝素结合区在溶瘤素N的C末端加工。“肝素结合区”包括至少一个，优选二个，更优选三个、四个、五个或六个肝素结合基元，它们均具有结构式arg-xaa-碱性残基-碱性残基，优选arg-xaa-(arg或lys)-(arg或lys)残基。举例的肝素结合基元包括RXRR、RXKK、RXRK的RXKR。连续的肝素结合基元优选被两个氨基酸即xaa-xaa相隔开。因此优选的肝素结合区具有结构式(R-X-R/K)-(X-X-R-X-R/K)n，此处n＝1，优选2，更优选3或4。在优选的实施方案中，n＝3。(额外的连续肝素基元可被加入，但最终将降低而不是增加生物合成的溶瘤分子的凋亡效力)。肝素结合区的增加发现可显著增加凋亡活性。溶瘤素1/Sophin C的氨基酸序列(具有两个肝素结合基元，RSKK和RGRR)如SEQ ID NO5所述。机理分析证实包括额外的肝素结合基元增强肿瘤细胞表面上的整合素受体与第二受体如CD44或生长因子受体(如EGF-R或hbGF-R的生长因子受体)之间的错误连接。举例的错误连接受体是her-2，该受体由乳腺癌细胞表达，使此处描述的生物合成的溶瘤分子有效抗乳腺癌细胞。
该实施例显示反病毒表达载体的生产，该载体使得融瘤素1/Sophin C在哺乳动物宿主中体内和体外都稳定诱导高水平表达。
将溶瘤素克隆到9kb的反病毒Tet-On表达载体。这些反转录载体被设计成能在哺乳动物宿主中高水平稳定表达。反转录病毒Tet-诱导型载体产生感染的不能复制的反转录病毒，而这些反转录病毒可用来在体内和体外将目的基因导入到各种哺乳动物细胞类型中。反转录病毒的高效转导机制可稳定地将克隆基因整合到几乎所有有丝分裂活性的细胞的宿主基因组中。由四环素(Tc)控制的反式激活蛋白和由反四环素控制的反式激活蛋白(rtTA)从相同的包含目的基因的整合的反转录病毒构建体中得到表达。在脱氧土霉素的存在下，RtTA结合TRE并激活转录。在TRE控制下，将目的基因(如图2中所述的插入序列)插入到多个克隆位点(MCS)中。TRE由7个拷贝的42bp的TeTO序列组成，正好位于巨细胞病毒(PminCMV)最小的立即早期启动子的上游。
通过用pRetro-溶瘤素感染诱导在小细胞癌和乳腺癌细胞中的编程性细胞死亡用含4μg/ml的1，5-二甲基-1，5-二氮十一亚甲基聚甲溴化物的DME+10％FBS中的大约500,000病毒颗粒感染50,000个乳腺瘤细胞。48小时后，MDA-MB-231细胞用脱氧土霉素在合成培养基中诱导6小时。利用FregELTM凋亡测定来评估编程性细胞死亡。未被诱导的细胞存活并在光学显微镜下用10倍放大观察时标记为兰色。表达溶瘤素1/Sophin C的细胞经历编程性细胞死亡，如用10倍放大显微镜下观察时细胞呈淡褐色。各实验均一式两份并重复3次。当用溶瘤素1/Sophin C产生的病毒颗粒感染小细胞肺癌细胞得到相似的结果。
在表达溶瘤素的MDA-MB-231人乳腺癌细胞中的微管蛋白染色溶瘤素1感染的MDA-MB-231肿瘤细胞用3μg/ml脱氧土霉素诱导。6小时后，将细胞固定在10％甲醛中，然后用间接的荧光免疫化学染色微管蛋白。未诱导的感染MDA-MB-231细胞对照显示主要在核的周围有典型的微管蛋白着色。诱导的MDA-MB-231细胞显示在多个核周围有稳定的微管蛋白。显然，其效果与由非受体介导的凋亡剂紫杉醇所诱导的效果相似。
表达溶瘤素的MDA-MB-231人乳腺癌细胞的核染色感染细胞没有脱氧土霉素诱导或诱导6小时后用H和E染色。仅在诱导细胞中观察到多核化，此就是凋亡表型的指征。
为评价溶瘤素1/Sophin C抗原发性肿瘤生长和转移的效果，将1×107MDA-MB-231乳腺癌细胞皮下注射到裸鼠的左胁。6周后，将肿瘤在无菌条件下分割，切碎并将1mm肿瘤碎片用套管针移植到裸鼠的右胁。1周后，当肿瘤大约为10mm时，将小鼠分成不同的实验组。一批24只携带MDA-MB-231异种移植的动物被分成3组接受下列处理第一组8只小鼠用pRetro-溶瘤素(1×106病毒颗粒)注射。1天后，此后每周(共3周)把这些小鼠通过腹膜腔接受诱导剂脱氧土霉素(1mg/kg)注射。第二组8只小鼠每周接受脱氧土霉素注射(未感染肿瘤)，以及第三组每周接受溶瘤素蛋白注射(10μg/kg)。在另一批实验中，将pRetro-溶瘤素注射到带有肿瘤的小鼠的骨髓基质中。随后，第一天，动物同上处理，每周注射脱氧土霉素。每2天用微型测径器测量一次肿瘤的大小，肿瘤体积按长×宽×高×0.5236计算。在注射当天称量体重，4天后以及以后每周都称量。第一次注射后4天，利用UnopetteTM微量采集试剂盒采集尾静脉血液样本。用血球计人工测定白血球和血小板的总数。采用Hema3TM试剂盒进行血液涂片染色来测定粒细胞和淋巴细胞的绝对数。处理相关的毒性可根据处理组之间的体重、肝及肾的标记酶、血液学参数的差异来评价。处理后20周，在麻醉下通过斩首处死小鼠。为测定caspase酶，将肿瘤切开、称重并快速冷冻。在一些情况下，需固定肿瘤并进行组织学检查。对肝、心、子宫、卵巢、肺、脊髓和所有长骨进行组织学评价。
图4中所示的结果揭示与对照相比，第一组和第三组中的肿瘤体积明显减小。所有处理过的小鼠在6个月后仍然保持健康。与之相反，所有对照动物或因肿瘤而死亡，或因过量的肿瘤负担而被处死。结果显示Sophin C体内的效果在于减低肿瘤负担和延长生存力。另外，它们还证实Sophin C具有被直接给药或通过病毒传递系统给药的潜力。
图5中所示的结果证实除剂量反应研究之外，在更广的肿瘤模型范围中评价功效的实验。Sophin C对肿瘤生长效果的评价用于三种肿瘤类型，即乳腺、前列腺和子宫。如图5所示，结果证实使用50和500μg/kg的蛋白质时，肿瘤体积均减小。等同物本领域的专业技术人员将认识到，或能够确定仅采用常规试验，许多本发明特定的实施方案的等同物在此描述。这些等同物旨在由下列的权利要求书所包括。
序列表<110>儿童医学中心公司(Children’s Medical Center Corporation)<120>生物合成的溶瘤分子及其用途(Biosynthetic Oncolytic Molecules and Uses Therefor)<130>SCT022809-09<140><141><150>60/211,436<151>2000-06-13<160>8<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>314<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>1Met Arg Ile Ala Val Ile Cys Phe Cys Leu Leu Gly Ile Thr Cys Ala1 5 10 15Ile Pro Val Lys Gln Ala Asp Ser Gly Ser Ser Glu Glu Lys Gln Leu20 25 30Tyr Asn Lys Tyr Pro Asp Ala Val Ala Thr Trp Leu Asn Pro Asp Pro35 40 45Ser Gln Lys Gln Asn Leu Leu Ala Pro Gln Asn Ala Val Ser Ser Glu50 55 60Glu Thr Asn Asp Phe Lys Gln Glu Thr Leu Pro Ser Lys Ser Asn Glu65 70 75 80Ser His Asp His Met Asp Asp Met Asp Asp Glu Asp Asp Asp Asp His85 90 95Val Asp Ser Gln Asp Ser Ile Asp Ser Asn Asp Ser Asp Asp Val Asp100 105 110Asp Thr Asp Asp Ser His Gln Ser Asp Glu Ser His His Ser Asp Glu115 120 125Ser Asp Glu Leu Val Thr Asp Phe Pro Thr Asp Leu Pro Ala Thr Glu130 135 140Val Phe Thr Pro Val Val Pro Thr Val Asp Thr Tyr Asp Gly Arg Gly145 150 155 160Asp Ser Val Val Tyr Gly Leu Arg Ser Lys Ser Lys Lys Phe Arg Arg165 170 175Pro Asp Ile Gln Tyr Pro Asp Ala Thr Asp Glu His Ile Thr Ser His180 185 190Met Glu Ser Glu Glu Leu Asn Gly Ala Tyr Lys Ala Ile Pro Val Ala195 200 205Gln Asp Leu Asn Ala Pro Ser Asp Trp Asp Ser Arg Gly Lys Asp Ser210 215 220Tyr Glu Thr Ser Gln Leu Asp Asp Gln Ser Ala Glu Ala His Ser His225 230 235 240Lys Gln Ser Arg Leu Tyr Lys Arg Lys Ala Asn Asp Glu Ser Asn Glu245 250 255His Ser Asp Val Ile Asp Ser Gln Glu Leu Ser Lys Val Ser Arg Glu260 265 270Phe His Ser His Glu Phe His Ser His Glu Asp Met Leu Val Val Asp275 280 285Pro Lys Ser Lys Glu Glu Asp Lys His Leu Lys Phe Arg Ile Ser His290 295 300Glu Leu Asp Ser Ala Ser Ser Glu Val Asn305 310<210>2<211>170<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>2Met Arg Ile Ala Val Ile Cys Phe Cys Leu Leu Gly Ile Thr Cys Ala1 5 10 15Ile Pro Val Lys Gln Ala Asp Ser Gly Ser Ser Glu Glu Lys Gln Leu20 25 30Tyr Asn Lys Tyr Pro Asp Ala Val Ala Thr Trp Leu Asn Pro Asp Pro35 40 45Ser Gln Lys Gln Asn Leu Leu Ala Pro Gln Asn Ala Val Ser Ser Glu50 55 60Glu Thr Asn Asp Phe Lys Gln Glu Thr Leu Pro Ser Lys Ser Asn Glu65 70 75 80Ser His Asp His Met Asp Asp Met Asp Asp Glu Asp Asp Asp Asp His85 90 95Val Asp Ser Gln Asp Ser Ile Asp Ser Asn Asp Ser Asp Asp Val Asp100 105 110Asp Thr Asp Asp Ser His Gln Ser Asp Glu Ser His His Ser Asp Glu115 120 125Ser Asp Glu Leu Val Thr Asp Phe Pro Thr Asp Leu Pro Ala Thr Glu130 135 140Val Phe Thr Pro Val Val Pro Thr Val Asp Thr Tyr Asp Gly Arg Gly145 150 155 160Asp Ser Val Val Tyr Gly Leu Arg Ser Lys165 170<210>3<21l>156<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>3Met Arg Ile Ala Val Ile Cys Phe Cys Leu Leu Gly Ile Thr Cys Ala1 5 10 15Ile Pro Val Lys Gln Ala Asp Ser Gly Ser Ser Glu Glu Lys Gln Leu20 25 30Tyr Asn Lys Tyr Pro Asp Ala Val Ala Thr Trp Leu Asn Pro Asp Pro35 40 45Ser Gln Lys Gln Asn Leu Leu Ala Pro Glu Thr Leu Pro Ser Lys Ser50 55 60Asn Glu Ser His Asp His Met Asp Asp Met Asp Asp Glu Asp Asp Asp65 70 75 80Asp His Val Asp Ser Gln Asp Ser Ile Asp Ser Asn Asp Ser Asp Asp85 90 95Val Asp Asp Thr Asp Asp Ser His Gln Ser Asp Glu Ser His His Ser100 105 110Asp Glu Ser Asp Glu Leu Val Thr Asp Phe Pro Thr Asp Leu Pro Ala115 120 125Thr Glu Val Phe Thr Pro Val Val Pro Thr Val Asp Thr Tyr Asp Gly130 135 140Arg Gly Asp Ser Val Val Tyr Gly Leu Arg Ser Lys145 150 155<210>4<211>64<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列描述合成肽<400>4Met Arg Ile Ala Val Ile Cys Phe Cys Leu Leu G1y Ile Thr Cys Ala1 5 10 15Gly Gly Gly Pro Gly Ile Pro Val Lys Gln Ala Asp Ser Gly Ser Ser20 25 30Glu Glu Lys Gly Gly Gly Pro Gly Thr Pro Val Val Pro Thr Val Asp35 40 45Thr Tyr Asp Gly Arg Gly Asp Ser Val Val Tyr Gly Leu Arg Ser Lys50 55 60<210>5<211>71<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列描述合成肽<400>5Met Arg Ile Ala Val Ile Cys Phe Cys Leu Leu Gly Ile Thr Cys Ala1 5 10 15Gly Gly Gly Pro Gly Ile Pro Val Lys Gln Ala Asp Ser Gly Ser Ser20 25 30Glu Glu Lys Gly Gly Gly Pro Gly Thr Pro Val Val Pro Thr Val Asp35 40 45Thr Tyr Asp Gly Arg Gly Asp Ser Val Val Tyr Gly Leu Arg Ser Lys50 55 60Lys Ala Ala Arg Gly Arg Arg65 70<210>6<211>87<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列描述合成肽<400>6Met Arg Ile Ala Val Ile Cys Phe Cys Leu Leu Gly Ile Thr Cys Ala1 5 10 15Gly Gly Gly Pro Gly Ile Pro Val Lys Gln Ala Asp Ser Gly Ser Ser20 25 30Glu Glu Lys Gly Gly Gly Pro Gly Thr Pro Val Val Pro Thr Val Asp35 40 45Thr Tyr Asp Gly Arg Gly Asp Ser Val Val Tyr Gly Leu Arg Ser Lys50 55 60Pro Ala Gly Ala Ala Gly Gly Pro Ala Gly Pro Ala Gly Pro Ala Gly65 70 75 80Pro Ala Gly Pro Ala Gly Pro8权利要求
1.一种生物合成的溶瘤分子，其包含凋亡成分和至少一种生物调节成分，它们形成促进编程性细胞死亡的分子。
2.权利要求1所述的溶瘤分子，其中所述凋亡成分源自骨桥蛋白。
3.权利要求1所述的溶瘤分子，其中所述凋亡成分是多肽。
4.权利要求3所述的溶瘤分子，其中所述凋亡成分包含长度为5-50个氨基酸残基的氨基酸序列且与序列SEQ ID NO1中第147-170位的氨基酸残基具有至少90％的同一性。
5.权利要求3所述的溶瘤分子，其中所述凋亡成分包含SEQ IDNO1中第147-170位的残基。
6.权利要求1所述的溶瘤分子，其中所述生物调节成分选自信号肽、接头区、高尔基加工区、肝素结合区和胶原蛋白结合区。
7.一种生物合成的溶瘤分子，其包含凋亡成分、第一生物调节成分和第二生物调节成分，它们形成调节细胞程序性死亡的分子。
8.权利要求7所述的溶瘤分子，其中所述第一和第二生物调节成分选自信号肽、接头区和高尔基加工区。
9.权利要求8所述的溶瘤分子，其进一步包含第三种生物调节成分。
10.权利要求9所述的溶瘤分子，其中所述第三种生物调节成分是肝素结合区或胶原蛋白结合区。
11.一种生物合成的溶瘤分子，其包含凋亡成分、信号肽、接头区和高尔基加工区。
12.权利要求11所述的溶瘤分子，其进一步包含肝素结合区。
13.权利要求12所述的溶瘤分子，其进一步包含胶原蛋白结合区。
14.权利要求11所述的溶瘤分子，其包含与氨基酸序列SEQ IDNO4有足够同源性的氨基酸序列，其中所述分子保持溶瘤活性。
15.权利要求12所述的溶瘤分子，其包含与氨基酸序列SEQ IDNO5有足够同源性的氨基酸序列，其中所述分子保持溶瘤活性。
16.权利要求13所述的溶瘤分子，其包含与氨基酸序列SEQ IDNO6有足够同源性的氨基酸序列，其中所述分子保持溶瘤活性。
17.权利要求1所述的溶瘤分子，其中所述分子调节凋亡反应，所述反应选自染色质结构、细胞生存力和细胞溶解的调节。
18.权利要求1所述的溶瘤分子，其中所述分子增强凋亡反应。
19.权利要求18所述的溶瘤分子，其中所述凋亡反应是细胞溶解。
20.一种被分离的核酸分子，其包含编码生物合成的溶瘤分子的核酸序列。
21.一种表达载体，其包含权利要求20所述的核酸分子。
22.一种宿主细胞，其包含权利要求20所述的载体。
23.一种生产溶瘤分子的方法，其包括在可生产溶瘤分子的条件下培养权利要求22所述的宿主细胞。
24.权利要求23所述的方法，其进一步包括从培养基或宿主细胞中分离溶瘤分子。
25.一种药物组合物，其包含权利要求1所述的溶瘤分子和可药用载体。
26.一种在细胞内调节凋亡反应的方法，其包括用权利要求1所述的溶瘤分子接触所述细胞从而使凋亡反应得到调节。
27.权利要求27所述的方法，其中所述细胞存在于个体中并且给所述个体施用溶瘤分子。
28.一种治疗性多肽，其包含氨基酸序列SEQ ID NO4。
29.一种治疗性多肽，其包含氨基酸序列SEQ ID NO5。
30.一种治疗性多肽，其包含氨基酸序列SEQ ID NO6。
31.一种治疗性多肽，其包含氨基酸序列SEQ ID NO8。
32.一种被分离的核酸分子，其编码权利要求28所述的治疗性多肽。
33.一种被分离的核酸分子，其编码权利要求29所述的治疗性多肽。
34.一种被分离的核酸分子，其编码权利要求30所述的治疗性多肽。
35.一种被分离的核酸分子，其编码权利要求31所述的治疗性多肽。
36.一种被分离的核酸分子，其包含核苷酸序列SEQ ID NO7。
37.一种被分离的核酸分子，其包含SEQ ID NO7中第1-195位的核苷酸。
38.一种被分离的核酸分子，其包含SEQ ID NO7中第1-213位的核苷酸。
39.一种表达载体，其包含权利要求32-38中任一项所述的核酸分子。
40.一种宿主细胞，其包含权利要求39所述的载体。
全文摘要
本发明提供新的生物合成的溶瘤分子。这种生物合成的溶瘤分子包含源自骨桥蛋白的功能区。优选的生物合成的溶瘤分子包含源于骨桥蛋白的凋亡区。本发明的溶瘤分子能够促进细胞程序死亡。因此，对体现本发明生物合成的溶瘤分子特征的治疗用途予以公开。
文档编号C07K14/435GK1439020SQ01811084
公开日2003年8月27日 申请日期2001年6月13日 优先权日2000年6月13日
发明者萨米·阿什卡尔, 谢里·希基塔, 加桑·德恩勒 申请人:儿童医学中心公司