本发明属于分子生物学领域，涉及一种采用分子生物学手段检测微生物耐药基因的方法，具体为一种用于检测奶牛乳腺炎性金黄色葡萄球菌青霉素耐药基因的分子标记及其应用。
背景技术：
：金黄色葡萄球菌是葡萄球菌属的代表菌，显微镜下观察呈葡萄串状排列，球形或略呈椭圆形，直径0.5～1.5微米，平均0.8微米，革兰氏染色阳性，凝固酶试验阳性，触媒(过氧化氢酶)阳性，能分解甘露醇，无鞭毛，无芽孢，体外培养时一般不形成荚膜，有致病性，由于菌落呈金黄色得名。作为重要的化脓性病原菌，金黄色葡萄球菌能够引起人的多种感染性疾病，如疖、毛囊炎、蜂窝织炎、葡萄球菌性心内膜炎等，同时也是引起奶牛乳腺炎的主要病原菌，且金黄色葡萄球菌广泛分布于自然界，在健康牛的皮肤、乳头经常能分离到金黄色葡萄球菌。虽然经过一百多年的研究，金黄色葡萄球菌目前仍然是导致人类和动物感染性疾病最常见的病原菌之一。金黄色葡萄球菌对奶牛极易感、感染引起的临床型乳腺炎可分为最急性感染、急性感染和慢性感染。最急性感染常见于围产期的母牛或感染初产的母牛，表现为高热(40～42℃)，精神沉郁、食欲不振、乳区肿胀、疼痛、触摸坚实，常因避免腿摩擦乳房而出现跛行。金黄色葡萄球菌急性感染最易导致坏疽性乳腺炎，发病乳区严重肿胀、坚实，短时间内(3～5小时)可由粉红色变成红色、紫色，甚至出现水疱，有浆液性渗出，乳房呈蓝黑色触摸手感冰凉；乳汁为血染浆液，混有凝乳块及絮状沉淀。此外，急性感染可发生于各个产奶期的母牛；病牛发热、食欲不振，患病乳区微热、肿胀、疼痛，触诊坚实；分泌的乳汁呈奶油状，后为含有恶臭的脓块，有时表现为稀薄的乳汁散布着凝块和絮状沉淀物。乳腺炎是造成奶牛养殖业经济损失最主要的疾病，金黄色葡萄球菌是奶牛乳腺炎主要的传染性病原菌之一。对我国90年代以来发表的关于乳腺炎流行病学的论文分析发现，金黄色葡萄球菌在患病牛奶样中的分离率高达30～50％。研究显示，金黄色葡萄球菌可对目前使用的各种抗菌素产生耐药；随着抗菌素的广泛应用，金黄色葡萄球菌对抗菌素不仅已呈现出越来越普遍的耐药，而且表现为多重耐药，给奶牛乳腺炎的临床治疗带来了很大困难；此外，由于耐药性的产生和蔓延，在常用抗菌素无效的情况下，必须使用作用更强的新型抗菌药物，这不仅会导致耐药性问题越发严重，耐药性不断扩散，而且使已有抗菌药物使用寿命大大缩短。技术实现要素：本发明的目的是：为了克服现有技术的缺陷，获得一种有效分析我国牛源金黄色葡萄球菌耐药机理的方法，为基层临床兽医在奶牛乳腺炎治疗中合理用药提供依据，本发明提供了一种用于检测奶牛乳腺炎性金黄色葡萄球菌青霉素耐药基因的分子标记及其应用。技术方案：一种用于检测奶牛乳腺炎性金黄色葡萄球菌青霉素耐药基因的分子标记，所述分子标记及其序列为：p1，seqidno.1～2；p2，seqidno.3～4；p3，seqidno.5～6。优选的，所述分子标记p1、p2和p3的上游引物5，端进行氨基化修饰并附加10个碱基t。表1分子标记序列名称序列(5，-3，)seqidno.p1-fnh2-t(10)gtagcgacaataggtaatagt1p1-rgtaataacaataaacctccta2p2-fnh2-t(10)tgctatccaccctcaaacagg3p2-raacgttgtaaccaccccaaga4p3-fnh2-t(10)aagcggtaaaccccctga5p3-rttcggcaaatcccttctcaac6所述分子标记在制备检测奶牛乳腺炎性金黄色葡萄球菌青霉素耐药基因试剂盒中的应用。优选的，所述试剂盒的组分包括：分子标记、dntp、lataq、pcr反应缓冲液、mgcl2、双蒸水。优选的，所述试剂盒检测奶牛乳腺炎性金黄色葡萄球菌青霉素耐药基因的步骤包括：(1)取样：选取纯化后的奶牛乳腺炎性金黄色葡萄球菌，划线接种培养基，形成单个菌落，向无菌ep管中加入10～60μl60％的甘油，用接种针挑取单菌落于甘油中洗涤数次，-20℃保存；(2)以步骤(1)收集的菌体作为pcr模板，以p1为特异性引物，进行第一轮pcr扩增；(3)取步骤(2)的扩增产物，稀释100～500倍后作为第二轮pcr的模板，以p2作为特异性引物，进行第二轮pcr扩增；(4)取第二轮pcr扩增的产物，稀释10～100倍后作为第三轮pcr的模板，以p3作为特异性引物，进行第三轮pcr扩增；(5)收集第三轮pcr扩增的产物，并采用琼脂糖凝胶电泳检测。优选的，所述pcr扩增的体系为25μl：模板2μl、pcr反应缓冲液2.5μl、dntp2μl、lataq2μl、分子标记1μl、双蒸水15.5μl。优选的，所述第一轮pcr扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35个循环；72℃，7min。优选的，所述第二轮pcr扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，45s，35个循环；72℃，5min。优选的，所述第三轮pcr扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，58℃，30s，72℃，35s，35个循环；72℃，4min。有益效果：(1)本发明所述分子标记具有重复性好、可比性强和分辨力高等优点；(2)所述方法无需大量测序，应用成本低。附图说明图1是实施例1～3检测结果图；其中，1为分子量为1500bp的maker；3为实施例1pcr产物电泳结果；4为实施例2pcr产物电泳结果；5为实施例3pcr产物电泳结果。具体实施方式实施例1一种用于检测奶牛乳腺炎性金黄色葡萄球菌青霉素耐药基因的分子标记，所述分子标记及其序列为：p1，seqidno.1～2；p2，seqidno.3～4；p3，seqidno.5～6。所述分子标记p1、p2和p3的上游引物5，端进行氨基化修饰并附加10个碱基t。所述分子标记在制备检测奶牛乳腺炎性金黄色葡萄球菌青霉素耐药基因试剂盒中的应用。所述试剂盒的组分包括：分子标记、dntp、lataq、pcr反应缓冲液、mgcl2、双蒸水。所述试剂盒检测奶牛乳腺炎性金黄色葡萄球菌青霉素耐药基因的步骤包括：(1)取样：选取纯化后的奶牛乳腺炎性金黄色葡萄球菌，划线接种培养基，形成单个菌落，向无菌ep管中加入10μl60％的甘油，用接种针挑取单菌落于甘油中洗涤数次，-20℃保存；(2)以步骤(1)收集的菌体作为pcr模板，以p1为特异性引物，进行第一轮pcr扩增；(3)取步骤(2)的扩增产物，稀释100倍后作为第二轮pcr的模板，以p2作为特异性引物，进行第二轮pcr扩增；(4)取第二轮pcr扩增的产物，稀释10倍后作为第三轮pcr的模板，以p3作为特异性引物，进行第三轮pcr扩增；(5)收集第三轮pcr扩增的产物，并采用琼脂糖凝胶电泳检测。所述pcr扩增的体系为25μl：模板2μl、pcr反应缓冲液2.5μl、dntp2μl、lataq2μl、分子标记1μl、双蒸水15.5μl。所述第一轮pcr扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35个循环；72℃，7min。所述第二轮pcr扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，45s，35个循环；72℃，5min。所述第三轮pcr扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，58℃，30s，72℃，35s，35个循环；72℃，4min。实施例2一种用于检测奶牛乳腺炎性金黄色葡萄球菌青霉素耐药基因的分子标记，所述分子标记及其序列为：p1，seqidno.1～2；p2，seqidno.3～4；p3，seqidno.5～6。所述分子标记p1、p2和p3的上游引物5，端进行氨基化修饰并附加10个碱基t。所述分子标记在制备检测奶牛乳腺炎性金黄色葡萄球菌青霉素耐药基因试剂盒中的应用。所述试剂盒的组分包括：分子标记、dntp、lataq、pcr反应缓冲液、mgcl2、双蒸水。所述试剂盒检测奶牛乳腺炎性金黄色葡萄球菌青霉素耐药基因的步骤包括：(1)取样：选取纯化后的奶牛乳腺炎性金黄色葡萄球菌，划线接种培养基，形成单个菌落，向无菌ep管中加入30μl60％的甘油，用接种针挑取单菌落于甘油中洗涤数次，-20℃保存；(2)以步骤(1)收集的菌体作为pcr模板，以p1为特异性引物，进行第一轮pcr扩增；(3)取步骤(2)的扩增产物，稀释200倍后作为第二轮pcr的模板，以p2作为特异性引物，进行第二轮pcr扩增；(4)取第二轮pcr扩增的产物，稀释20倍后作为第三轮pcr的模板，以p3作为特异性引物，进行第三轮pcr扩增；(5)收集第三轮pcr扩增的产物，并采用琼脂糖凝胶电泳检测。所述pcr扩增的体系为25μl：模板2μl、pcr反应缓冲液2.5μl、dntp2μl、lataq2μl、分子标记1μl、双蒸水15.5μl。所述第一轮pcr扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35个循环；72℃，7min。所述第二轮pcr扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，45s，35个循环；72℃，5min。所述第三轮pcr扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，58℃，30s，72℃，35s，35个循环；72℃，4min。实施例3一种用于检测奶牛乳腺炎性金黄色葡萄球菌青霉素耐药基因的分子标记，所述分子标记及其序列为：p1，seqidno.1～2；p2，seqidno.3～4；p3，seqidno.5～6。所述分子标记p1、p2和p3的上游引物5，端进行氨基化修饰并附加10个碱基t。所述分子标记在制备检测奶牛乳腺炎性金黄色葡萄球菌青霉素耐药基因试剂盒中的应用。所述试剂盒的组分包括：分子标记、dntp、lataq、pcr反应缓冲液、mgcl2、双蒸水。所述试剂盒检测奶牛乳腺炎性金黄色葡萄球菌青霉素耐药基因的步骤包括：(1)取样：选取纯化后的奶牛乳腺炎性金黄色葡萄球菌，划线接种培养基，形成单个菌落，向无菌ep管中加入60μl60％的甘油，用接种针挑取单菌落于甘油中洗涤数次，-20℃保存；(2)以步骤(1)收集的菌体作为pcr模板，以p1为特异性引物，进行第一轮pcr扩增；(3)取步骤(2)的扩增产物，稀释500倍后作为第二轮pcr的模板，以p2作为特异性引物，进行第二轮pcr扩增；(4)取第二轮pcr扩增的产物，稀释100倍后作为第三轮pcr的模板，以p3作为特异性引物，进行第三轮pcr扩增；(5)收集第三轮pcr扩增的产物，并采用琼脂糖凝胶电泳检测。所述pcr扩增的体系为25μl：模板2μl、pcr反应缓冲液2.5μl、dntp2μl、lataq2μl、分子标记1μl、双蒸水15.5μl。所述第一轮pcr扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35个循环；72℃，7min。所述第二轮pcr扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，45s，35个循环；72℃，5min。所述第三轮pcr扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，58℃，30s，72℃，35s，35个循环；72℃，4min。sequencelisting<110>苏州乔纳森新材料科技有限公司<120>一种用于检测奶牛乳腺炎性金黄色葡萄球菌青霉素耐药基因的分子标记及其应用<130><160>6<170>patentinversion3.3<210>1<211>21<212>dna<213>人工序列<400>1gtagcgacaataggtaatagt21<210>2<211>21<212>dna<213>人工序列<400>2gtaataacaataaacctccta21<210>3<211>21<212>dna<213>人工序列<400>3tgctatccaccctcaaacagg21<210>4<211>21<212>dna<213>人工序列<400>4aacgttgtaaccaccccaaga21<210>5<211>18<212>dna<213>人工序列<400>5aagcggtaaaccccctga18<210>6<211>21<212>dna<213>人工序列<400>6ttcggcaaatcccttctcaac21当前第1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