专利名称：基于转录的核酸扩增方法和组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及多核苷酸扩增领域。更具体地，本发明提供了用于扩增(即产生多拷贝)靶多核苷酸序列的方法、组合物和试剂盒，其中所述扩增涉及转录，并使用了RNA/DNA复合引物和/或靶转换多核苷酸。
领域背景近年来，用于核酸扩增和扩增产物检测的方法的发展已促进了核酸的检测、鉴定、定量和序列分析。这些方法的应用已经引起了基因组学、细胞生物学、分子医学、遗传学等领域的快速发展。
核酸分析广泛应用于病原体的检测和鉴定、导致特定表型的基因改变的检测、遗传性疾病诊断或对这些疾病的易感性，还用于对发育、疾病和对特定刺激的反应所引起的基因表达的评估，并用于各种基因组项目。其它核酸扩增方法的应用包括稀有细胞的检测、病原体的检测和对恶性疾病中已改变的基因表达的检测等。核酸扩增潜在地可用于定性分析(如特定核酸序列存在的检测)，也可用于特定基因序列的定量。后者用于评估和确定在样本中致病序列的量，以及用于确定基因增殖和缺失，其中所述基因增殖和缺失在细胞从正常转化为恶性类型时经常会出现。
尽管特定核酸序列的检测及其序列分析可通过直接将探针与靶核酸序列杂交而得以进行，但当试验样本中靶核酸序列少量存在时，该方法往往缺乏敏感性。这一问题的一种解决方法是开发产生多拷贝特定核酸序列的方法，以使它们可用于进一步的分析。产生在样本中特定核酸序列的多拷贝的方法通常称为靶扩增方法。其它用于增加杂交分析检测敏感性的方法基于由杂交探针产生多条产物，例如将杂交探针切割以形成多条产物或连接邻近的探针以形成独特的依赖杂交的产物。类似地，可通过放大由杂交事件产生信号的方法例如基于分支DNA探针杂交的方法来增加杂交反应的敏感性。
近年来已经描述了多种靶核酸扩增的方法。可通过多循环的在不同温度下孵育(热循环)或者等温过程进行靶核酸扩增。热稳定核酸修饰酶的发现也对核酸扩增技术的快速发展作出了贡献。热稳定核酸修饰酶，如DNA聚合酶和RNA聚合酶、连接酶、核酸酶等均用于依赖热循环的扩增和等温扩增的方法中。例如，在WO/070095A2(Liu等)中描述了“应用模板转换寡核苷酸进行核酸的均一等温扩增和检测”的方法。
最常应用的靶扩增方法是聚合酶链反应(PCR)，该方法基于多个循环的变性、两条寡核苷酸引物的杂交(每条引物与双链靶中的一条杂交)、以及通过核苷酸聚合酶进行引物延伸，以产生多个靶序列的双链拷贝。对PCR的许多变更方法已有描述，且方法被用于进行DNA或RNA核酸序列的扩增、序列测定、突变分析等。(参见PCR手册方法和应用指南(PCRProtocolsA Guide to Methods and Applications)，(Innis，M.，Gelfand，D.，Sninsky，J.和White，T.编辑)，学院出版社(Academic Press)(1990)；Mullis等，酶学方法(Methods in Enzymology)，155335-350(1987))。应用单引物的基于热循环的方法也已描述。其它依赖热循环的方法包括连接酶链反应(LCR)和相关的修复链反应(RCR)。
基于链置换的等温核酸扩增方法已有描述。参见在例如Fraiser等，美国专利号5,648,211；Cleuziat等，美国专利号5,824,517；以及Walker等，美国国家科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，89392-396(1992)中的描述。其它等温靶扩增方法是基于转录的扩增方法，其中在扩增的早期阶段将RNA聚合酶启动子序列掺入引物延伸产物中(WO/01050)，其进一步通过转录和消化DNA/RNA杂合中间产物中的RNA链而扩增靶序列或靶互补序列。参见例如美国专利号5,169,766和4,786,600。靶核酸的扩增可通过多循环的不同温度下的孵育(即热循环)或同一温度(等温过程)下的孵育得以进行。这些方法包括转录介导的扩增(TMA)、自持续的序列复制(3SR)、基于核酸序列的扩增(NASBA)及其变更方法。参见例如Guatelli等，美国国家科学院院报，871874-1878(1990)；美国专利号5,766,849(TMA)和5,654,142(NASBA)。其它扩增方法应用模板转换寡核苷酸(TSOs)和阻断寡核苷酸。例如，应用嵌合DNA引物的模板转换扩增方法已在美国专利5,679,512和Patel等(美国国家科学院院报932969-2974(1996))中公开，应用阻断寡核苷酸的方法由Laney等在美国专利号5,679,512中公开。
由于等温靶扩增方法不需要热循环仪，因此这些方法更易于适应普通仪器平台。但先前已知的等温靶扩增方法有严重的弊端。根据链置换扩增(SDA)方法的扩增需要特定限制性酶位点的存在，因此限制了它的可应用性。另一方面，已存在的基于转录的扩增方法如NASBA和TMA需要通过引物在扩增产物中掺入RNA聚合酶启动子序列，由于此过程容易引起非特异扩增，因此限制了它的应用。此外，通过这些基于转录的扩增方法来扩增DNA靶的机制并未完全确定。
许多基因组测序(特别是人类基因组测序)的完成对分子和细胞生物学且特别是分子医学的发展具有极大的意义。等温基因测序方法的研发将极大促进该信息在多种试验设施中的应用，因为与目前需要热循环仪的方法相比，等温测序极大简化了基因鉴定方法。
本发明的方法提供用于等温、高效的核酸序列扩增，并提供了使用这些扩增方法和产物的方法(例如在序列测定中)。
所有在此引用的参考文献，包括专利申请和出版物，均全文引用作为参考。
本发明的公开本发明提供了用于扩增多核苷酸序列的方法、组合物和试剂盒。方法通常包括引物(在本发明的一些方面为RNA/DNA复合引物)、任选地终止序列和前启动子寡核苷酸序列的应用。
因此，本发明一方面提供了产生多拷贝目的核酸序列的方法，其包括的步骤有(a)将包含目的核酸序列的单链靶多核苷酸与第一引物杂交，其中所述第一引物为包含RNA部分和3′DNA部分的复合引物；(b)任选地将包含终止多核苷酸序列的多核苷酸与靶多核苷酸5′的区域杂交，其中所述靶多核苷酸5′的区域为相对于第一引物与靶多核苷酸的杂交而言；(c)用DNA依赖的DNA聚合酶延伸第一引物，以产生包含第一引物延伸产物和靶多核苷酸的复合体；(d)应用从RNA/DNA杂合体中切除RNA的酶从第一引物延伸产物和靶多核苷酸复合体的复合引物上切除RNA部分，以使另一复合引物(其通常且优选地与第一引物相同)可与靶多核苷酸杂交，并通过链置换重复引物延伸，以产生置换的引物延伸产物；(e)杂交前启动子多核苷酸，其中所述前启动子多核苷酸包含前启动子并包含与置换的引物延伸产物在允许通过RNA聚合酶进行转录的条件下(这些条件通常但并非必需包括延伸引物延伸产物的3’末端以产生双链启动子区域)杂交的区域，以便产生包含与置换的引物延伸产物有互补序列的RNA转录本；(f)将第二引物与步骤(e)产生的RNA转录本杂交；(g)用RNA依赖的DNA聚合酶延伸第二引物，以产生包含第二引物延伸产物和RNA转录本的复合体；(h)用可从RNA/DNA杂合体中切除RNA的酶切除步骤(g)形成的复合体中的RNA；(i)将单链第二引物延伸产物与前启动子多核苷酸杂交，其中前启动子多核苷酸包含前启动子并包含与单链第二引物延伸产物在允许通过RNA聚合酶进行转录的条件下(这些条件通常但并非必需包括延伸引物延伸产物3’末端，以产生双链启动子区域)杂交的区域，从而产生包含目的序列的RNA转录本；由此多拷贝目的核酸序列得以产生。
本发明的另一方面提供了产生多拷贝目的核酸序列的方法，其包括(a)组合包含如上描述的第一引物延伸产物和靶多核苷酸的复合体；可与靶多核苷酸杂交的复合引物(其通常且优选地与第一引物相同)，其中复合引物为包含RNA部分和3′DNA部分的引物；从RNA/DNA杂合体中切除RNA的酶；包含前启动子并包含与置换的复合引物延伸产物杂交的区域的前启子多核苷酸；RNA聚合酶；可与包含目的序列的正义RNA转录本杂交的第二引物；RNA依赖的DNA聚合酶；以及包含前启动子并包含与第二引物延伸产物杂交的区域的前启动子多核苷酸；和(b)孵育步骤(a)的混合物，孵育条件为允许引物杂交和延伸、RNA切除、包含第一引物延伸产物和靶多核苷酸的复合体在其RNA被切除且复合引物结合到复合体中的靶多核苷酸后从复合体中置换第一引物延伸产物、前启动子多核苷酸与第一引物延伸产物杂交以形成包含第一引物延伸产物和前启动子多核苷酸的复合体、将前启动子多核苷酸与第二引物延伸产物杂交以形成包含第二引物延伸产物和前启动子多核苷酸的复合体，以及RNA转录，由此多拷贝目的核酸序列得以产生。
本发明的另一方面提供了用于产生多拷贝目的核酸序列的方法，其包括(a)组合如上所述产生的置换的引物延伸产物；包含前启动子并包含与置换的第一引物延伸产物杂交的区域的前启动子多核苷酸；RNA聚合酶；可与包含目的序列的正义RNA转录本杂交的第二引物；RNA依赖的DNA聚合酶；从RNA/DNA杂合体中切除RNA的酶；以及包含前启动子并包含与第二引物延伸产物杂交的区域的前启动子多核苷酸；和(b)孵育步骤(a)的混合物，孵育条件为允许引物杂交和延伸、RNA切除、前启动子多核苷酸与第一引物延伸产物杂交形成包含第一引物延伸产物和前启动子多核苷酸的复合体、前启动子多核苷酸和第二引物延伸产物杂交以形成包含第二引物延伸产物和前启动子多核苷酸的复合体，以及RNA转录，由此多拷贝目的核酸序列得以产生。
本发明的另一方面提供了用于产生多拷贝目的核酸序列的方法，其包括(a)组合包含与上面描述的置换的引物延伸产物具互补序列的RNA转录本；可与包含目的序列的正义RNA转录本杂交的第二引物；RNA依赖的DNA聚合酶；从RNA/DNA杂合体中切除RNA的酶；包含前启动子并包含与第二引物延伸产物杂交的区域的前启动子多核苷酸；以及RNA聚合酶；和(b)孵育步骤(a)的混合物，孵育条件为允许引物杂交和延伸、RNA切除、前启动子多核苷酸与引物延伸产物杂交以形成包含引物延伸产物和前启动子多核苷酸的复合体，以及RNA转录，由此多拷贝目的核酸序列得以产生。
本发明的又一方面提供了用于产生多拷贝目的核酸序列的方法，其包括(a)组合第一引物，其中第一引物为复合引物，其可与靶多核苷酸杂交且其中复合引物包含RNA部分和3′DNA部分；任选地可与靶多核苷酸5′区域杂交的包含终止多核苷酸序列的多核苷酸，其中所述靶多核苷酸5′的区域为相对于复合引物与靶多核苷酸的杂交而言；DNA依赖的DNA聚合酶；从RNA/DNA杂合体中切除RNA的酶；包含前启动子并包含与第一引物延伸产物杂交的区域的前启动子多核苷酸；RNA聚合酶；可与包含目的序列的正义RNA转录本杂交的第二引物；RNA依赖的DNA聚合酶；包含前启动子并包含与第二引物延伸产物杂交的区域的前启动子多核苷酸；和(b)孵育步骤(a)的混合物，孵育条件为允许引物杂交和延伸、RNA切除、包含第一引物延伸产物和靶多核苷酸的复合体在其RNA被切除且复合引物结合到复合体中的靶多核苷酸后从复合体中置换第一引物延伸产物、前启动子多核苷酸与引物延伸产物杂交以形成包含引物延伸产物和前启动子多核苷酸的复合体，以及RNA转录，由此多拷贝目的核酸序列得以产生。
在另一方面，本发明提供了用于产生多拷贝目的核酸序列的方法，其包括(a)将第二引物与RNA转录本杂交，其中所述RNA转录本产生的过程包括(i)包含目的核酸序列的单链靶多核苷酸与第一引物杂交，该第一引物为包含RNA部分和3′DNA部分的复合引物；(ii)任选地将包含终止多核苷酸序列的多核苷酸与靶多核苷酸5′的区域杂交，其中所述靶多核苷酸5′的区域为相对于第一引物与靶多核苷酸的杂交而言；(iii)用DNA依赖的DNA聚合酶延伸第一引物，以产生包含第一引物延伸产物和靶多核苷酸的复合体；(iv)用从RNA/DNA杂合体中切除RNA的酶切除第一引物延伸产物和靶多核苷酸复合体中的复合引物上的RNA部分，以使另一复合引物(其通常且优选地与第一引物相同)可与靶多核苷酸杂交，并通过链置换重复引物延伸以产生置换的引物延伸产物；(v)包含前启动子并包含与置换的引物延伸产物杂交的区域的前启动子多核苷酸的杂交，杂交条件为允许通过RNA聚合酶进行转录(这些条件通常但并非必需包括引物延伸产物3′末端的延伸以产生双链启动子区域)，这样产生包含与置换的引物延伸产物具互补序列的RNA转录本；和(b)用RNA依赖的DNA聚合酶延伸第二引物，以产生包含第二引物延伸产物和RNA转录本的复合体；(c)用可切除RNA/DNA杂合体中RNA的酶切除步骤(b)复合体中的RNA；(d)单链第二引物延伸产物与前启动子多核苷酸杂交，其中前启动子多核苷酸包含前启动子和在允许通过RNA聚合酶进行转录的条件下(这些条件通常但并非必需包括引物延伸产物3′末端的延伸以产生双链启动子区域)与单链第二引物延伸产物杂交的区域，从而产生包含目的序列的RNA转录本；由此产生多拷贝目的核酸序列。
在此描述了基于复合引物的本发明方法中所用的复合引物的多种实施方案。例如，在一些实施方案中，复合引物的RNA部分相对于3'DNA部分而言为5’。在另外的实施方案中，5′RNA部分毗邻3′DNA部分。对于此处描述的基于复合引物的方法，可应用一条或多条复合引物。在基于复合引物的方法的优选实施方案中，第一和第二引物不同(例如第一引物是复合引物，而第二引物不是复合引物)。在第一、第二引物不同的优选实施方案中，引物可与相似的、优选地相同的序列杂交。在另外的基于复合引物方法的实施方案中，第一和第二引物可与不同的序列杂交。
在此也描述了包含终止序列的多核苷酸的多个示例性实施方案。在一些实施方案中，包含终止序列的多核苷酸为模板转换寡核苷酸(TSO)，其可以(但并非必需)包含一处或多处修饰以增加与模板的结合。因此，在一些实施方案中，TSO在与模板杂交的区域中包含修饰，其在给定的一组条件下与没有修饰的TSO相比，可以更牢固地与该区域结合。此处提供了合适修饰的实例。在一些实施方案中，包含终止序列的多核苷酸为阻断序列，其与TSO一样，可包含一处或多处修饰以增加与模板的结合。因此，在一些实施方案中，阻断子序列在与模板杂交的区域包含修饰，其中在给定的一组条件下与没有修饰的阻断子序列相比，修饰的阻断子序列可更牢固地与该区域结合。此处提供了合适修饰的实例。
此处描述了可用于本方法和组合物中的酶类。例如，切除RNA的酶可为RNaseH。
在一些方面，TSO提供了前启动子功能，并还包含与置换的引物延伸产物杂交的区域(其可与或不与启动子毗邻)。在其它的实施方案中，包含前启动子的多核苷酸在3’末端包含与置换的引物延伸产物杂交的区域，由此置换的延伸产物通过DNA聚合酶的延伸产生了可启动转录的双链启动子。在一些实施方案中，包含前启动子的多核苷酸为前启动子模板寡核苷酸(PTO)。在一些实施方案中，包含前启动子的多核苷酸为这样的多核苷酸，其包含(a)终止序列，在其可与靶多核苷酸杂交的情况下并不实现模板转换；(b)前启动子序列，其中当终止序列可与靶多核苷酸杂交的情况下，前启动子序列不可与靶多核苷酸杂交；和(c)可与该靶多核苷酸的互补序列杂交的序列。
本发明的另一方面提供了产生多拷贝目的核酸序列的方法，其包括(a)将包含目的序列的单链靶多核苷酸与第一引物杂交；(b)前启动子模板转换寡核苷酸(TSO)的杂交，其中所述TSO包含前启动子序列和可与靶多核苷酸5’杂交的区域，其中所述靶多核苷酸的5′为相对于第一引物与靶多核苷酸的杂交而言；(c)在DNA聚合酶的作用下延伸第一引物，以产生包含与前启动子TSO的前启动子序列具互补序列的第一引物延伸产物，因此产生了第一引物延伸产物、靶多核苷酸和前启动子TSO的复合体，其中所述复合体包含双链启动子区域；(d)用DNA依赖的RNA聚合酶从双链启动子区域转录产生正义RNA转录本；(e)第二引物(其通常且优选地与第一引物相同)与步骤(d)的正义RNA转录本杂交；(f)第二引物在RNA依赖的DNA聚合酶的作用下延伸，以产生包含第二引物延伸产物和RNA转录本的复合体；(g)用从RNA/DNA杂合体中切除RNA的酶切除步骤(f)复合体中的RNA；(h)单链第二引物延伸产物与前启动子多核苷酸杂交，其中前启动子多核苷酸包含前启动子并包含与单链第二引物延伸产物在允许RNA聚合酶进行转录的条件下杂交的区域，这样包含目的序列的正义RNA转录本得以产生；由此产生多拷贝目的核酸序列。
另一方面，本发明提供了产生多拷贝目的核酸序列的方法，其包括(a)组合上述第一引物延伸产物、靶多核苷酸和前启动子TSO的复合体，其中该复合体包含双链启动子区域；RNA聚合酶；可与包含目的序列的正义RNA转录本杂交的第二引物(其通常且优选地与第一引物相同)；RNA依赖的DNA聚合酶；从RNA/DNA杂合体中切除RNA的酶；以及包含前启动子并包含与第二引物延伸产物杂交的区域的前启动子多核苷酸；和(b)孵育步骤(a)的混合物，孵育条件为允许引物的杂交和延伸、RNA切除、前启动子多核苷酸与引物延伸产物杂交以形成包含引物延伸产物和前启动子多核苷酸的复合体，以及RNA转录，由此产生了多拷贝目的核酸序列。
本发明的另一方面提供了用于产生多拷贝目的核酸序列的方法，其包括(a)组合按如前所述产生的正义RNA转录本；可与RNA转录本杂交的第二引物(其通常且优选地与第一引物相同)；RNA依赖的DNA聚合酶；从RNA/DNA杂合体中切除RNA的酶；包含前启动子并包含与第二引物延伸产物杂交的区域的前启动子多核苷酸；以及RNA聚合酶；和(b)孵育步骤(a)的混合物，孵育条件为允许引物的杂交和延伸、RNA切除、前启动子多核苷酸和引物延伸产物杂交以形成包含引物延伸产物和前启动子多核苷酸的复合体，以及RNA转录，由此多拷贝的目的核酸得以产生。
本发明的另一方面提供了用于产生多拷贝目的核酸的方法，其包括(a)组合靶多核苷酸；可与靶多核苷酸杂交的第一引物；包含前启动子序列并包含可与靶多核苷酸5’区(相对于第一引物与靶多核苷酸的杂交而言)杂交区域的前启动子模板转换寡核苷酸；任选地DNA依赖的DNA聚合酶；RNA聚合酶；可与包含目的序列的正义RNA转录本杂交的第二引物(其通常且优选地与第一引物相同)；RNA依赖的DNA聚合酶；切除RNA/DNA杂合体中RNA的酶；以及包含前启动子并包含与第二引物延伸产物杂交的区域的前启动子多核苷酸；和(b)孵育步骤(a)的混合物，孵育条件为允许引物杂交和延伸、RNA切除、前启动子多核苷酸与引物延伸产物杂交以形成包含引物延伸产物和前启动子多核苷酸的复合体，以及RNA转录，由此多拷贝的目的核酸得以产生。
在另一方面，本发明提供了产生多拷贝目的核酸的方法，其包括(a)将第二引物与RNA转录本杂交，其中所述RNA转录本产生的过程包括(i)包含目的核酸序列的单链靶多核苷酸与第一引物(其通常且优选地与第二引物相同)杂交；(ii)杂交前启动子模板转换寡核苷酸(TSO)，其中所述TSO包含前启动子序列和可与靶多核苷酸的5’区(相对于第一引物与靶多核苷酸的杂交而言)杂交的区域；(iii)在DNA聚合酶作用下延伸第一引物，以产生包含与前启动子TSO的前启动子序列具互补序列的第一引物延伸产物，由此产生第一引物延伸产物、靶多核苷酸和前启动子TSO的复合体，其中该复合体包含双链启动子区域；(iv)在DNA依赖的RNA聚合酶作用下从双链启动子区域转录，以产生正义RNA转录本；(b)在RNA依赖的DNA聚合酶的作用下延伸第二引物，以产生包含第二引物延伸产物和RNA转录本的复合体；(c)用从RNA/DNA杂合体中切除RNA的酶切除步骤(b)复合体中的RNA；(d)单链第二引物延伸产物与前启动子多核苷酸杂交，其中前启动子多核苷酸包含前启动子并包含与单链第二引物延伸产物在允许RNA聚合酶发生转录的条件下杂交的区域，这样包含目的序列的正义RNA转录本得以产生；由此产生了多拷贝目的核酸序列。
在基于前启动子TSO的方法的优选实施方案中，第一引物和第二引物是相同的。在其它基于前启动子TSO的方法的实施方案中，第一引物和第二引物不相同。在第一和第二引物不同的某些实施方案中，引物可与相似的、优选地相同的序列杂交。在其它的基于前启动子TSO的方法的实施方案中，第一和第二引物可与不同的序列杂交。
该方法可用于扩增任何靶DNA或RNA，包括例如基因组DNA或RNA和cDNA。可结合和/或顺序操作一个或多个步骤(通常可以任何次序操作，只要可形成所需的产物)。
本发明也提供了使用(通常为分析)本发明扩增产物的方法，例如测序和序列变化的检测。根据本发明的一种测序方法包括(a)应用本发明的方法在rNTPs和rNTP类似物的混合物存在下扩增靶多核苷酸，这样在rNTP类似物掺入后转录终止；和(b)分析扩增产物以确定序列。
根据本发明的另一测序方法包括(a)用本发明的方法扩增靶多核苷酸，其中由第一引物延伸产物产生的RNA转录本在rNTPs和rNTP类似物的混合物存在下进行扩增，以使转录在rNTP类似物掺入后终止；和(b)分析扩增产物以确定序列。根据本发明的另一序列分析方法包括(a)通过本发明的方法扩增靶多核苷酸；和(b)分析扩增产物的单链构象，其中与参考单链多核苷酸相比构象上的差异说明在靶多核苷酸序列中存在突变。
本发明提供了鉴定靶多核苷酸中目的序列的方法，其包括(i)通过本发明的方法扩增包含目的序列的靶多核苷酸，其中复合引物的RNA部分的序列已知，以及(ii)将步骤(i)的扩增产物(如果有的话)与由参考模板扩增的产物量进行比较，其中(1)从靶多核苷酸模板中扩增的可检测出的产物量少于从包含复合引物RNA部分互补区域的参考模板中扩增的产物量，说明靶多核苷酸不包含与复合引物RNA部分互补的序列，且相对于复合引物RNA部分的互补序列而言为一序列变体，或(2)从靶多核苷酸模板中扩增的可检测出的产物量多于从不包含与复合引物RNA部分互补区域的参考模板中扩增的产物量，说明靶多核苷酸包含与复合引物RNA部分互补的序列，且相对于复合引物RNA部分的互补序列而言为非序列变体。
在本发明的方法中，复合引物RNA部分的序列可包含与目的序列互补的序列，所述目的序列可为野生型序列、突变序列或等位基因变体序列。
本发明的方法可用于靶核酸序列的检测和定量。
例如，一方面，本发明提供了测定目的序列的方法，其包括核酸扩增产物的测序，其中所述核酸扩增产物由此处描述的扩增方法产生。扩增产物的测序揭示了目的序列的序列。
又在另一实例中，本发明提供了检测在样本中目的核酸序列存在的方法，该方法包括在核酸扩增产物中检测目的序列的存在，所述核酸扩增产物由此处描述的扩增方法产生。扩增产物中目的序列的检出表示在样本中存在目的序列。
在本发明方法的多个实施方案中，目的序列包含突变。在一些目的序列包含突变的实施方案中，突变为单核苷酸多态现象。在一些实施方案中，目的序列的检测包括将包含目的序列的扩增产物与核酸探针杂交，其中所述核酸探针可与该目的核酸序列杂交。在其它的实施方案中，目的序列的检测包括含目的序列的互补序列的扩增产物的杂交，杂交应用可与该互补序列杂交的核酸探针。在一些实施方案中，核酸探针包含DNA。在其它实施方案中，核酸探针包含RNA。在一些实施方案中，探针以微阵列形式提供。在一些实施方案中，微阵列包含固定在基片上的探针，基片的制作材料选自纸、玻璃、塑料、聚丙烯、尼龙、聚丙烯酰胺、硝酸纤维、硅和光纤。在一些实施方案中，目的序列或其互补序列通过进行有限引物延伸进行检测，其中有限引物延伸包括延伸与扩增产物杂交的引物，以使引物延伸产物得以产生，其中所述引物延伸产物具有证明目的序列存在或不存在的特征。
这样，本发明的方法用于靶核酸序列的检测或定量。本发明的单链核酸扩增产物也可通过探针(如固定的探针)杂交用于对靶核酸序列的检测和定量。本发明也提供了制备微阵列的方法，其包括(a)用本发明的方法扩增靶多核苷酸；和(b)将扩增产物固定到基片上，以制作包含扩增产物的微阵列。
本发明一方面提供了在样本中确定基因表达谱的方法，其包括(a)用本发明的方法扩增样本中至少两段目的序列；和(b)确定每段目的序列扩增产物的量，其中每一所述量指示出样本中每一目的序列的量，由此确定出样本的基因表达谱。在一个实施方案中，每一靶多核苷酸均为cDNA。在另一个实施方案中，每一靶多核苷酸均为RNA。
本发明也提供了包含此处描述的扩增方法中所用的多种组分(和组分的多种组合)的组合物、试剂盒、复合体、反应混合物和体系。本发明一方面提供了用于扩增目的序列的体系，其包含(a)第一引物(为复合引物)；(b)第二引物；(c)DNA依赖的DNA聚合酶；(d)RNA依赖的DNA聚合酶；(e)前启动子多核苷酸；(f)RNA聚合酶；和(g)从RNA/DNA杂合体中切除RNA的酶；和任选地(h)包含终止多核苷酸序列的多核苷酸。本发明的另一方面提供了用于扩增目的序列的体系，其包含(a)前启动子TSO；(b)第一引物；(c)任选地DNA依赖的DNA聚合酶；(d)RNA依赖的DNA聚合酶；(e)从RNA/DNA杂合体中切除RNA的酶；(f)RNA聚合酶；和任选地(g)第二引物。
在另一方面，本发明提供了包含此处描述组分的多种组合的反应混合物(或包含反应混合物的组合物)。在另一方面，本发明提供了用于进行此处描述方法的试剂盒。这些试剂盒包装适宜且通常(但并非必需)包括适宜的说明书，试剂盒中包含一种或多种用于扩增方法的组分。例如，本发明提供的试剂盒包含可与靶多核苷酸杂交的复合引物(例如包含3′DNA部分和RNA部分，RNA部分可在5′且还可与3′DNA部分毗邻)、前启动子多核苷酸和根据此处描述的任一基于复合引物的方法扩增靶多核苷酸的说明书。试剂盒内的复合引物和前启动子多核苷酸可为此处描述的任何一种。试剂盒可进一步包含以下组分，如任一种(a)包含终止多核苷酸序列的多核苷酸；(b)任一种此处描述的酶，例如从RNA/DNA杂合体中切除RNA的酶(如RNaseH)；(c)前启动子TSO；和(d)第二引物。在另一实例中，本发明提供的试剂盒包含前启动子TSO和第一引物(其可是或不是复合引物)，二者均可与靶多核苷酸杂交，且试剂盒还包含用于根据此处描述的任一基于前启动子TSO的方法扩增靶多核苷酸的说明书。试剂盒还可包含如以下组分，如任一种(a)任一种此处所述的酶，如从RNA/DNA杂合体中切除RNA的酶(如RNaseH)；(b)包含前启动子并包含与第二引物延伸产物杂交的区域的多核苷酸；和(c)任选地第二引物。
附图简述
图1A-F为用阻断子序列组分作为终止多核苷酸来进行复合引物等温扩增方法的步骤图解。
图2A-E为用模板转换寡核苷酸序列作为终止多核苷酸来进行复合引物等温扩增方法的步骤图解。
图3A-B为应用模板转换进行单引物等温扩增DNA靶的步骤图解。
图4A-B为应用模板转换进行单引物等温扩增RNA靶的步骤图解。
实施本发明的模式本发明提供了用于扩增核酸序列的方法、组合物和试剂盒。靶核酸序列的扩增可有利地用于多种情况，例如当靶多核苷酸以非常少的量存在，或可获得的靶多核苷酸分子非常少，或为了对特定靶核酸进行核苷酸序列测定时。
一方面，本发明提供了通常使用RNA/DNA复合引物和两套或轮转录步骤(每套或轮在此处称为“转录组件”)的方法，该方法基于前启动子多核苷酸与中间体多核苷酸的杂交。另一方面，本发明提供的方法包括在第一转录组件中应用前启动子模板转换寡核苷酸来产生中间体多核苷酸复合体，该复合体可转录产生正义RNA转录本，且在第二转录组件中，进一步通过转录扩增第一转录组件的RNA转录本。
一方面，扩增方法通常如下起作用复合RNA/DNA引物和第一前启动子多核苷酸形成第一转录组件中靶多核苷酸转录的基础。在一些实施方案中，终止序列通过转向或阻断沿靶链的复制提供复制的终点。通常，终止序列包含与靶链充分互补杂交的序列。如以下所描述，在一些实施方案中，包含终止序列的多核苷酸为模板转换寡核苷酸(TSO)，其除包含与靶链充分互补杂交的序列外，还包含与靶链不能充分互补杂交的序列。DNA聚合酶利用引物开始拷贝靶多核苷酸以产生引物延伸产物。用从RNA/DNA杂合体中切除RNA的酶(如RNaseH)从模板链和引物延伸产物杂合体中切除(移去)RNA序列，在模板链上留出序列用以结合另一复合引物。然后第二链通过DNA聚合酶得以产生，其置换先前的复制链，产生了置换的延伸产物。包含前启动子并包含与置换的引物延伸产物杂交的区域的多核苷酸(其例如可为模板转换寡核苷酸或前启动子模板寡核苷酸)与置换的引物延伸产物杂交。
如果引物延伸产物包含前启动子序列，则前启动子多核苷酸(如模板转换寡核苷酸(TSO))与该序列的杂交产生双链启动子区域。当置换的引物延伸产物不包含合适的前启动子序列时，则使用前启动子多核苷酸(如前启动子模板寡核苷酸(PTO))掺入前启动子序列。前启动子多核苷酸结合到置换的引物延伸产物上。由置换的引物延伸产物产生的双链启动子在DNA依赖的RNA聚合酶作用下用以产生正义RNA产物(即包含靶序列的RNA，与其互补链对应)。然后第二引物与正义RNA转录本杂交，并在RNA依赖的DNA聚合酶的作用下延伸，以产生第二引物延伸产物和正义RNA转录本的复合体。可从RNA/DNA杂合体中切除RNA的核糖核酸酶(如RNaseH)切除复合体中的RNA。然后前启动子多核苷酸与单链第二引物延伸产物杂交，以产生双链启动子区域(如此处所描述，其可直接通过杂交或间接通过引物延伸产物沿前启动子多核苷酸延伸而得以产生)。从双链启动子区域转录产生包含目的序列的正义RNA转录本。
因此，本发明提供了产生至少一个拷贝的目的核酸序列的方法(通常为扩增靶多核苷酸序列的方法)，其包括下列组分的组合和反应(a)包含靶序列的单链靶多核苷酸；(b)第一引物，为包含RNA部分和3′DNA部分的复合引物；(c)DNA聚合酶；(d)脱氧核糖核苷三磷酸或合适的类似物；(e)从RNA/DNA双链体中切除RNA的酶，如RNaseH；(f)任选地如任一种此处描述的包含终止序列的多核苷酸，其还包含与模板多核苷酸杂交的部分(或区域)；(g)包含前启动子序列(可为此处所描述的多种形式中的任一种)并包含与置换的引物延伸产物杂交区域的多核苷酸；(h)核糖核苷三磷酸或合适的类似物；(i)第二引物(其可与或不与第一引物相同)；和(j)RNA聚合酶，在适当条件下使置换链可进行转录。将该组合物置于合适的条件，以使(a)复合引物(和任选地包含终止序列的多核苷酸)与模板杂交；(b)从复合引物开始进行引物延伸，以形成双链体；(c)用RNaseH从RNA/DNA双链体中切除RNA；(d)另一复合引物(其通常且优选地与第一引物相同)与模板杂交，启动另一轮的引物延伸(由DNA聚合酶介导)，置换已由模板拷贝的链；(e)开始转录，以产生与复合引物延伸产物互补的RNA转录本；(f)第二引物与步骤(e)的RNA转录本杂交；(g)从第二引物开始引物延伸，以形成双链体；(h)核糖核酸酶(如RNaseH)从步骤(g)的双链体中切除RNA；(i)前启动子多核苷酸与步骤(h)产生的单链第二引物延伸产物杂交，以产生双链启动子区域(如此处描述的直接或间接地产生)；和(j)开始转录以产生包含目的序列的正义RNA转录本。用步骤(j)的正义转录本作为起始底物(第二引物可与之杂交)任选地重复第二组转录步骤，导致了目的序列指数级的扩增。
应当理解，有关此处描述的组合，并非必须将所有组分置于同一容器和/或同时进行反应。因此本发明提供了亚组合，只要亚组合可以清楚或含蓄地反映出此处描述的扩增操作/方法。
另一方面，作为一般性的总结，扩增方法作用方式如下第一引物延伸过程中由于前启动子TSO与靶多核苷酸5’区(相对于第一引物与靶多核苷酸的杂交而言)杂交而发生模板转换，导致产生包含双链启动子区域的多核苷酸复合体。前启动子TSO包含可与靶多核苷酸杂交的一段序列和不能与靶多核苷酸杂交的一段序列(即在允许可杂交序列杂交的条件下也不杂交的序列)，其中不能杂交的序列包含前启动子序列。在第一转录组件中，第一引物沿靶多核苷酸的延伸，在TSO与靶多核苷酸杂交的位点处，第一引物的延伸转换到前启动子TSO的非可杂交序列。在靶多核苷酸是RNA的一些实施方案中，RNA在第一引物延伸后被切除。在靶多核苷酸为RNA的其它实施方案中，RNA在第一引物延伸后不被切除。引物延伸产物和TSO非可杂交序列的复合体包含双链启动子区域。由双链启动子区域开始转录产生正义RNA转录本。在第二转录组件中，这些正义RNA转录本用于进一步的扩增。在该第二转录组件中，第二引物(其通常且优选地与第一引物相同)与正义RNA转录本杂交，并在RNA依赖的DNA聚合酶的作用下延伸以产生第二引物延伸产物和正义RNA转录本的复合体。从RNA/DNA杂合体中切除RNA的核糖核酸酶(如RNaseH)切除复合体中的RNA。然后前启动子多核苷酸与单链第二引物延伸产物杂交，以产生双链启动子区域(如此处所述直接或间接地产生)。从双链启动子区域转录产生包含目的序列的正义RNA转录本。
因此，本发明提供了产生至少一个拷贝目的核酸序列的方法(通常为扩增靶多核苷酸的方法)，其包括下列组分的组合和反应(a)单链靶多核苷酸；(b)可与靶多核苷酸杂交的第一引物，杂交部位在目的序列的3′端；(c)前启动子TSO；(d)DNA聚合酶；(e)脱氧核糖核苷三磷酸或合适的类似物；(f)RNA聚合酶；和(g)核糖核苷三磷酸或合适的类似物；(h)可与第一转录步骤产生的RNA转录本杂交的第二引物(其通常且优选地与第一引物相同)；(i)从RNA/DNA双链体中切除RNA的酶(如RNaseH)；(j)与第二引物延伸产物杂交的前启动子多核苷酸(可为此处描述的多种形式中的任何一种)。将该组合物置于合适的条件，以使(a)第一引物和前启动子TSO与靶多核苷酸杂交；(b)第一引物沿靶多核苷酸进行引物延伸，并在模板转换之后沿前启动子TSO的非杂交序列延伸，形成包含双链启动子区域的复合体；(c)从步骤(b)的双链启动子区域开始转录；和(d)第二引物(其通常且优选地与第一引物相同)与步骤(c)的RNA转录本杂交；(e)由第二引物开始引物延伸，以形成双链体；(f)核糖核酸酶如RNaseH切除步骤(e)的双链体中的RNA；(g)前启动子多核苷酸与单链第二引物延伸产物杂交，以产生双链启动子区域(如此处所述直接或间接地产生)；和(h)开始转录以产生包含目的序列的正义转录本。
本发明的任一方法可通过在合适的步骤掺入标记核苷酸而用于产生标记的RNA产物。这些标记产物特别适于由本领域已知的方法进行核酸的定量和/或鉴定，包括应用于阵列如cDNA微阵列和寡核苷酸阵列。
在一些实施方案中，本发明提供了对目的核酸序列进行测序的方法。对于基于此处所描述方法的测序方法，其使用了经标记或未经标记的合适rNTPs或其类似物。因此，本发明提供了基于以上描述的方法，对包含目的序列的靶多核苷酸进行测序的方法，其中使用了rNTPs和rNTP类似物，它们为标记或未标记的引物延伸终止子，且扩增产物用以分析序列信息，如以下所描述。转录测序可使用rNTPs和rNTP类似物，用于对DNA和RNA靶序列进行测序。
本发明提供了在靶序列中检测核酸序列突变的方法。在一个基于复合引物方法的实施方案中，靶多核苷酸中突变的存在与否通过扩增靶多核苷酸的能力得以检测，其中所述扩增应用本发明的方法，其采用的复合引物的RNA部分包含或缺乏突变序列。本发明方法的扩增产物也可用于鉴定目的序列。例如可对扩增产物进行测序来确定目的序列。它们也可用于检测突变，例如通过与特定探针的杂交来检测。扩增产物也可通过检测单链构象多态性用来检测和/或鉴定靶核酸序列中的序列改变或单核苷酸多态性。这样，本发明提供了鉴定(例如检测和/或定量)目的序列的方法，所述方法为用本发明的扩增方法产生RNA产物，并通过检测/定量方法(如基于阵列技术或液相技术)来分析产物。通常(但并非必需)这些扩增产物为标记的。
又在另一实施方案中，本发明提供了用本发明扩增方法的产物产生核酸(RNA)微阵列的方法。
以下提供了关于本发明各种组分的详细资料。
一般技术本发明采用了(除非另外指出)常规分子生物学技术(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学技术，它们均包括在本领域内的范畴。这些技术在文献中详细阐明，如“分子克隆实验室手册”第二版(Sambrook等，(1989))；“寡核苷酸合成”(M.J.Gait编辑，1984)；“动物细胞培养”(R.I.Freshney编辑，1987)；“酶学方法”(学院出版社)；“分子生物学最新方法”(F.M.Ausubel等编辑(1987))和更新期刊)；“PCR聚合酶链反应”(K.Mullis等编辑(1994))。
本发明应用的引物、寡核苷酸和多核苷酸可用本领域公知的标准技术产生。本发明的引物可用本领域已知的方法制备。引物优选地通过化学方法合成。例如，Caruthers等(酶学方法，第154卷，287页(1987))描述了应用标准的磷酰胺固相化学通过磷酸二酯键加入核苷酸的方法。
定义此处所用的“靶多核苷酸”是已知或怀疑包含目的核酸序列的多核苷酸，目的序列为需要扩增的序列。就目的核酸的实际序列而论，目的核苷酸序列可为已知或未知。通常，此处所用的“模板”为包含目的核酸序列的多核苷酸。在一些例子中，术语“靶序列”、“模板DNA”、“模板多核苷酸”、“靶核酸”及其变化的说法可以交换使用。
此处所用的“扩增”通常指产生多拷贝所需序列的方法。“多拷贝”指至少2个拷贝。“拷贝”并非必须与模板序列完全互补或相同。例如拷贝可包含核苷酸类似物(如脱氧肌苷)、特意进行的序列改变(例如通过由包含可杂交但并非与模板互补的序列的引物引入的序列改变)和/或扩增过程中发生的序列错误。
此处所用“正义”多核苷酸(例如，正义RNA转录本)指包含来自靶核酸序列的目的序列的多核苷酸，与其互补链相对应。
“多核苷酸”或“核酸”此处可互用，指任何长度的核苷酸聚合物，且包括DNA和RNA。核苷酸可为脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、修饰的核苷酸或碱基和/或它们的类似物，或可由DNA或RNA聚合酶掺入聚合物的任一底物。多核苷酸可包含修饰的核苷酸，如甲基化核苷酸及它们的类似物。如果存在修饰的话，对核苷酸结构的修饰可在多聚体装配之前或之后进行。核苷酸的序列可由非核苷酸组分打断。多核苷酸可在聚合后进一步修饰，例如与标记组分连接。其它类型的修饰包括如“加帽”、将一种或多种天然存在的核苷酸替换为其类似物、核苷酸间修饰，例如那些带有无电荷键(如膦酸甲酯、磷酸三酯、磷酰胺、氨基甲酸酯等)的多核苷酸和那些带电荷键(如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)的多核苷酸，那些包含悬挂部分的多核苷酸，其中所述悬挂部分如蛋白质(如核酸酶、毒素、抗体、信号肽、聚L-赖氨酸等)，那些带有嵌入剂(例如吖啶、补骨脂素等)的多核苷酸，那些包含螯合剂(如金属、放射活性金属、硼、氧化金属等)的多核苷酸，那些包含烷化剂的多核苷酸，那些具已改变键的多核苷酸(如α-端基异构核酸等)，以及多核苷酸的未改变形式。此外，任何通常存在于糖中的羟基可被膦酸基、磷酸基替换，可用标准保护基团保护，或可被活化以制备与其它核苷酸连接的其它键，或可被连接至固相载体。5′和3′末端的OH可被磷酸化或用胺或1-20个碳原子的有机加帽基团取代。其它羟基也可被衍生为标准的保护基团。多核苷酸也可包含通常在领域内已知的核糖或脱氧核糖的类似物形式，包括如2′--O-甲基-、2′-O-烯丙基、2′-氟-或2′-叠氮基-核糖、碳环形糖类似物、α-端基异构糖、差向异构糖(如阿拉伯糖、木糖或来苏糖)、吡喃糖、呋喃糖、景天庚酮糖、无环类似物和无碱基核苷类似物(如甲基核苷)。一个或多个磷酸二酯键可由其它连接基取代。这些其它连接基包括但不限于以下实施方案，在实施方案中磷酸酯被P(O)S(″硫酯″)、P(S)S(″二硫酯″)、(O)NR2(″酰胺化物″)、P(O)R、P(O)OR′、CO或CH2(″formacetal″)取代，其中每一R或R′独立地为H或者为取代或未取代烷基(1-20C)，取代或未取代烷基任选地包含醚(-O-)键、芳基、链烯基、环烷基、环链烯基或芳烷基。多核苷酸中并非所有的键都需要相同。前面的描述适用于所有此处提及的多核苷酸，包括RNA和DNA。
此处所用的“第一转录组件”指直至并包括第一转录步骤的本方法的过程。此处所用的“第二转录组件”是指从第一转录组件产生的RNA转录本的引发开始到产生DNA产物，直至并包括第二转录步骤的本方法的过程。
此处所用的“标记rNTP”分别指直接或间接地与标记结合的rNTP或其类似物。例如，“标记的”rNTP可为直接用如染料和/或可检测部分标记的rNTP，其中所述可检测部分如特异结合对(如生物素-亲和素)中的一员。“标记的”rNTP也可通过将rNTP结合到如标记可结合的部分而进行间接标记。rNTP也可包含这样一个部分(如胺基)，在rNTP掺入延伸产物后该部分可结合标记。本发明中有用的标记包括荧光染料(如异硫氰酸荧光素、德克萨斯红、罗丹明、绿色荧光蛋白等)、放射性同位素(如3H、35S、32P、33P、125I或14C)、酶(如lacZ、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、地高辛配体)和显色标记如胶体金或有色玻璃或塑胶(如聚苯乙烯、聚丙烯、乳胶等)珠。可应用多种抗配体和配体(作为标记本身或用作结合标记的物质)。当配体具有天然抗配体(例如生物素、甲状腺素和氢化可的松)时，该配体可用于连接标记的抗配体。
此处所用的rNTP的“类型”指核苷酸的特定碱基，即腺嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶或鸟嘌呤。
此处所用的“寡核苷酸”通常指短的、通常为单链、通常为合成的多核苷酸，其长度通常但并非必需少于200个核苷酸。本发明的寡核苷酸包括复合引物、TSO、PTO和阻断子序列。术语“寡核苷酸”和“多核苷酸”并不互相排斥。以上对多核苷酸的描述同样且完全适用于寡核苷酸。
“引物”通常是指带有游离3′-OH基团的核苷酸序列，其可与模板序列(如靶RNA或引物延伸产物)杂交，且能够启动与模板互补的多核苷酸的聚合。“引物”可为如一段寡核苷酸。它也可为如与模板(例如引物延伸产物)自身序列杂交(例如作为发卡环)的模板序列，且能够启动核苷酸的聚合。
此处所用的“随机引物”是指引物包含的序列并非基于特定或具体的模板序列而设计，而是基于可与模板中的一段或多段序列杂交(在特定条件下)的统计学预期序列(随机引物的序列)。随机引物的序列(或其互补序列)可为或不为天然存在的序列，或存在于目的样本的序列池中。在单一反应混合物中扩增多种RNA样本，通常需利用随机引物的多重性(优选地为大的多重性)。如本领域已经熟知，“随机引物”也可指设计为与所需和/或大量的靶序列杂交的引物群(大量的随机引物)中的一员。随机引物可在核酸序列的多个位点进行杂交。随机引物的使用提供了不需预先了解靶的确切序列而通过聚合酶产生与靶核苷酸互补的引物延伸产物的方法。
此处可互用的“终止多核苷酸序列”或“终止序列”是指使针对包含靶序列的模板通过DNA聚合酶进行的DNA复制作用被终止的多核苷酸序列。终止序列包含通常与模板在终止点(位点)的5’杂交的部分(或区域)。可杂交的部分可包含或不包含整个终止序列。此处提供了合适的终止多核苷酸序列的实例(如阻断子序列和TSOs)。合适的终止多核苷酸序列的其它实例包括如此处所描述的含有一段终止序列(其通常且优选地在终止序列可与靶多核苷酸杂交的条件下不实现模板转换)和一段前启动子序列的组合多核苷酸。
“阻断子序列”或“阻断序列”此处可互用，它们为终止序列的实例，且指与模板核酸在终止位点的5’结合(通常为高亲和力结合)的寡核苷酸，且其可终止针对包含靶序列的模板通过DNA聚合酶进行的DNA复制作用。对于用DNA聚合酶进行的延伸，阻断序列的3′末端可被或不被封闭。
“终止位点”或“终止点”此处可互用，是指在DNA聚合酶作用下聚合终止(通常为引物延伸)或模板转换之前，最后进行复制的模板位点、点或区域。例如对于TSO，终止位点为靶序列中的这样的位置或区域，其在将模板从模板多核苷酸转换到TSO的未杂交部分之前，与引物延伸产物3′末端互补的位置或区域。
此处应用的“原启动子序列”和“前启动子序列”是指单链DNA序列区域，其双链形式可介导RNA转录。在一些情况下，“原启动子序列”、“原启动子”、“前启动子序列”、“前启动子”、“启动子序列”和“启动子”可以互用。前启动子序列可由此处描述的任一前启动子多核苷酸提供，如由TSO、PTO提供，或由此处描述的包含终止序列(其通常且优选地在终止序列可与靶多核苷酸杂交的条件下不实现模板转换)和前启动子序列的组合多核苷酸提供。
此处应用的“模板转换寡核苷酸”、“靶转换寡核苷酸”或“TSO”是指这样的寡核苷酸，其包含可与模板在引物延伸终止位点的5’杂交的区域，并且通常由于不与模板杂交的序列使得引物延伸过程(在DNA聚合酶作用下)中产生模板转换。TSOs通常在领域内已知。“模板转换”是指模板核酸的变换，通常是指在单轮的引物延伸过程中从靶核酸转换到TSO的非杂交区域。
此处所用的“前启动子TSO”是指还包含不能与靶多核苷酸杂交(在一组给定的条件下，条件通常为当TSO的可杂交部分或区域与靶杂交时起作用的那些条件)的前启动子序列的TSO。前启动子序列通常(但并非必需)位于TSO的5′区域。
此处所用的“前启动子模板寡核苷酸(PTO)”指包含前启动子序列和可与引物延伸产物3′区域杂交的部分(通常为3’部分)的寡核苷酸。前启动子序列和可杂交部分可为一寡核苷酸的相同、不同或为重叠寡核苷酸。
与第二序列“相对应”的第一序列，如复合引物的RNA部分，是指第一序列与第二序列具有显著的序列同一性。该术语通常用于检测突变、或鉴定靶序列的情况下。
“抑制”是指与参考相比活性、功能和/或量的降低或减少。
“复合体”是组分的装配。复合体可稳定或不稳定，且可被直接或间接检测到。例如，如此处所述，如果给定反应的组分以及反应产物的类型，可推知复合体的存在。对本发明而言，复合体相对于最终扩增产物而言通常为一个中间产物。
多核苷酸或寡核苷酸的“部分”或“区域”(此处互用)为两个或多个碱基的相邻序列。在其它实施方案中，区域或部分至少为约3、5、10、15、20、25个相邻核苷酸中的任一种。
与另一序列“相邻的”区域、部分或序列直接毗邻该另一区域、部分或序列。例如，与复合引物的的5’DNA部分相邻的RNA部分直接与5’DNA区域毗邻。此实例的阐述见图lA-C。
“反应混合物”是组分的集合，其在合适的条件下反应并形成复合体(可为一中间体)和/或产物。
“A”、“an”和“the”等除非特别指出均表明包括复数形式。
“包含”意思是包括。
“允许”事件发生的条件或“适于”事件发生的条件(如杂交、链延伸等)或“合适的”条件为不阻止此类事件发生的条件。因此，这些条件允许、增强、促进和/或有利于事件的发生。本领域内并在此描述的这些条件取决于诸如核苷酸序列的性质、温度和缓冲液。这些条件也取决于所需进行的事件如杂交、切除、链延伸或转录。
此处使用的序列“突变”是指目的序列中与参考序列相比的任何序列改变。参考序列可为野生型序列或希望与目的序列进行对比的序列。序列突变包括由于替换、缺失或插入机制引起的序列中单核苷酸改变或多于一个核苷酸的变化。单核苷酸多态性(SNP)也为此处描述的序列突变。
此处所用的“单链构象多态性”和“SSCP”通常指单链核酸受其特定核酸序列影响的特定构象，单链多核苷酸序列的改变如单核苷酸的替换、缺失或插入导致单链多核苷酸构象的改变或多态性。多核苷酸的构象通常可用本领域已知的方法(如通过凝胶电泳、毛细管电泳测定电泳迁移率和/或对核酸内切酶消化的易感性)进行检测、鉴定和/或区别。
此处可互用的“微阵列”和“阵列”包括带有生化样本(靶，通常具有未确定的特性)推断的结合(如通过杂交)位点的阵列(优选地为规则阵列)的表面。在一个优选的实施方案中，微阵列指固定在基片特定部位的不同的多核苷酸或寡核苷酸探针的集合。阵列在基片上形成，其中制作基片的材料如纸、玻璃、塑料(如聚丙烯、尼龙)、聚丙烯酰胺、硝酸纤维、硅、光纤或任何其它合适的固体或半固体支持物，并制成二维(如玻璃片、硅芯片)或三维(例如针、纤维、珠、微粒、微滴定孔、毛细管)形状。构成阵列的探针可通过多种方式固定到基片上，包括(i)用照相平版印刷技术进行原位合成(如高密度寡核苷酸阵列)(见Fodor等，科学(1991)，251767-773；Pease等，美国国家科学院院报(1994)，915022-5026；Lockhart等，自然生物技术(1996)，141675；美国专利号5,578,832；5,556,752和5,510,270)；(ii)以中到低密度点样/印制(如cDNA探针)到玻璃、尼龙或硝酸纤维上(Schena等，科学(1995)，270467-470，DeRisi等，自然遗传学(1996)，14457-460；Shalon等，基因组研究(1996)，6639-645；和Schena等，美国国家科学院院报(1995)，9310539-11286)；(iii)通过掩模(Maskos和Southern，核酸研究(1992)，201679-1684)和(iv)通过在尼龙或硝酸纤维杂交膜上斑点印迹(见例如Sambrook等编辑，1989，分子克隆实验室手册，第二版，1-3卷，冷泉港实验室(冷泉港，纽约))。探针也可通过与锚杂交、通过磁珠或如在微滴定板或毛细管的液相中非共价固定片上。探针分子通常为核酸如DNA、RNA、PNA和cDNA，但也可包括蛋白质、多肽、寡糖、细胞、组织和其任一可特异结合靶分子的变化形式。
术语“3’”通常指这样的区域或位置，其在同一多核苷酸或寡核苷酸中为另一区域或位置的3’(下游)。
术语“5’”通常指这样的区域或位置，其在同一多核苷酸或寡核苷酸中为另一区域或位置的5’(上游)。
术语“3′-DNA部分”、“3′-DNA区域”、“3′-RNA部分”和“3′-RNA区域”是指位于朝向多核苷酸或寡核苷酸3’末端的多核苷酸或寡核苷酸部分或区域，可包括或不包括同一多核苷酸或寡核苷酸的3’最末端核苷酸或与3’最末端核苷酸连接的部分。3’最末端核苷酸优选地为从约1到约20个核苷酸，更优选地为从约3到约18个核苷酸，且更优选地为从约5到约15个核苷酸。
术语“5′DNA部分”、“5′DNA区域”、“5′ RNA部分”和“5′RNA区域”是指位于朝向多核苷酸或寡核苷酸5’末端的核苷酸或寡核苷酸的部分或区域，可包括或不包括同一多核苷酸或寡核苷酸的5’最末端核苷酸或与5’最末端核苷酸连接的部分。5’最末端核苷酸优选地为从约1到约20个核苷酸，更优选地为从约3到约18个核苷酸，且更优选地为从约5到约15个核苷酸。
“检测”包括任何检测方法，包括直接的和间接的检测。例如，“可检测到较少的”产物可直接或间接观察到，且该术语表明任何的减少(包括无产物)。同样，“可检测到更多的”产物指直接或间接观察到的增加。
扩增方法以下是本发明的扩增方法的实例。应当理解即使提供了一般性的描述，也可应用多种其它实施方案。例如，谈到使用复合引物意指可使用此处描述的任何复合引物。
一方面，本发明的方法利用两个相连的转录组件第一转录组件提供基于复合引物的线性核酸扩增，该扩增为基于转录的扩增(此处也称为“增强的线性扩增”)，第一转录组件接下来与第二转录组件相连，第二组件可使第一组件的扩增产物进行进一步的等温扩增。本发明的方法通常使用两条引物，对于待扩增的靶核酸链而言这两条引物均为同义。所有的扩增反应可为等温，且不需要热循环。
另一方面，产生多拷贝目的核酸的正义RNA转录本的方法基于应用前启动子模板转换寡核苷酸(TSO)以产生中间体多核苷酸产物，该产物可在第一组转录步骤(第一转录组件)中转录，以产生RNA转录本，RNA转录本由第二组转录步骤(第二转录组件)进一步扩增。
本扩增方法的产物可通过同质或异质的检测方法得以检测，包括通过凝胶电泳的大小和/或迁移特性或通过与特异序列的探针杂交进行鉴定。扩增产物的检出指示出靶核酸的存在。定量分析也是可行的。例如，通过比较来自包含未知量多核苷酸(包含靶序列)的试验样本和具有已知量多核苷酸(包含靶序列)参考样本的扩增产物量，可以确定试验样本中靶序列的量。如下所述，该扩增方法也可进一步扩展至分析序列的改变和对靶核酸测序。
随着单链DNA扩增产物的量增加，组分如游离PTO和/或其它前启动子多核苷酸的水平变得有限，因此控制了总扩增能力。这是本发明扩增方法的一个独特特性，其中可通过调节在本方法中使用的此类组分的量来精确调节用于最大检测潜在产量的扩增能力，这对进行核酸检测和定量方法是有利的。
调整扩增产物总量的能力(由反应混合物中组分如TSO的量决定)可推动更精确的靶多核苷酸的检测和/或定量。其它的已知扩增方法(如PCR、NASBA、TMA等)产生的过扩增可能会对应用两种或多种检测探针的方法进行的检测和/或定量构成影响。结合过多的分析物产生的″钩状效应″在本领域中是熟知的，并导致非线性和信号变弱而引起假阴性或信号强度减少(与预期的高分析物浓度时的水平相比)。本发明具有限制产物最大产量的优点，使产生的产物适用于选择的扩增产物检测的方法。
本发明扩增方法的其它优点是避免了启动子序列非特异掺入到引物延伸产物而导致的非特异扩增。在基于复合引物的方法中，启动子序列由此处描述的TSO和/或另一前启动子多核苷酸导入。在基于前启动子TSO的方法中，启动子序列在第一转录组件中由前启动子TSO导入，且启动子序列在第二转录组件中由另一前启动子多核苷酸如此处所述可为TSO导入。在基于前启动子TSO方法的第一转录组件中，双链功能启动子的形成依赖于引物延伸和模板转换。第二组件中功能启动子的形成需要第二引物延伸产物与前启动子多核苷酸如前启动子TSO杂交。在本发明方法中前启动子多核苷酸杂交的步骤增加了该方法的特异性。非特异延伸产物不大可能具有与前启动子多核苷酸互补的序列(如3′末端序列)，其中所述前启动子多核苷酸设计为可与引物延伸产物中特定的序列杂交。
本方法适用于DNA或RNA靶分子的扩增。例如，本发明的扩增方法可用于靶序列的检测、定量和测序。
基于复合引物的扩增方法一方面，提供了应用复合引物产生目的核酸序列的多拷贝正义RNA转录本的方法。本发明基于复合引物的扩增方法提供了目的核酸序列的等温指数级扩增。该方法应用复合引物，并通常应用第二引物，其中第二引物通常(但并非必需)为非复合引物。在一个实施方案中，方法中也应用终止序列，例如阻断子序列(如在方法1中所描述)或TSO(如在方法2中所描述)。方法1和方法2在以下描述。
终止序列(如果使用的话，为TSO或阻断子序列成分)的加入用于产生具有明确3’末端的产物。在一些实施方案中，模板上引物结合位点5’的天然序列抑制核酸的聚合，结果引物延伸的终止得以实现。此类天然序列在领域内已知(如GC富含序列)或可由经验确定。当扩增基因组DNA以提供明确末端用于引物延伸时，终止序列的应用是特别有益的。不需要这些特性时，根据本发明方法的等温扩增也可在无终止序列时实施。
等温扩增利用三种酶DNA聚合酶、核糖核酸酶如RNaseH和RNA聚合酶。方法1中的一个应用阻断子序列的实施方案在图1A-F中说明。方法2中的一个应用TSO的实施方案在图2A-E中说明。
本发明的基于复合引物的方法通常设计为扩增单链DNA靶。当待扩增的靶核酸为双链DNA时，首先变性靶以产生单链靶。靶变性可应用领域内已知的方法进行，如热变性或碱处理。当靶为单链RNA时(如mRNA或病毒RNA)，靶首先通过领域内已知的方法转录产生cDNA靶。
靶多核苷酸如上所述与复合引物、DNA聚合酶、核糖核酸酶如RNaseH和任选地阻断子序列成分或TSO结合。在一个实施方案中，每一扩增反应包括相同序列的复合引物。在另一实施方案中，每一扩增反应包括复合引物变体的混合物，此处的变体指两个或多个同源但不相同且都能与同一靶核酸序列杂交的序列。互补性优选地为至少约50％，更优选地至少约75％，且最优选地为至少约90％。此实施方案的优点包括将不同目的序列引入到引物延伸产物的能力。又在另一实施方案中，每一扩增反应包括复合引物的混合物，其中引物代表两个或多个具低或无同源性的不同序列，且其中引物优选地与同一靶核苷酸链上的不同靶核酸序列或不同位点杂交。此实施方案的优点包括通过在单一扩增反应中扩增多种靶核酸样本实现靶核酸的多重检测和/或分析。
应用阻断子序列的方法(或不应用终止多核苷酸的方法)导致产生置换的引物延伸产物，该产物与前启动子多核苷酸杂交形成复合体，用作RNA聚合酶的底物。利用TSO的方法导致产生独特的包含靶和模板转换寡核苷酸(TSO)相关部分的中间体扩增产物。TSO与置换的引物延伸产物杂交形成的复合体是RNA聚合酶的转录底物，转录产生与起始靶序列同义的RNA产物。
基于复合引物方法的两个示例性实施方案描述如下方法1基于阻断子序列的核苷酸扩憎在一些实施方案中，提供了基于阻断子序列的扩增方法。一个示例性实施方案在图1A-F中显示。
图1A-F阐述了以下方法的一个实施方案，该方法使用了此处所述的复合引物、阻断子序列和第三种寡核苷酸启动子模板寡核苷酸(PTO)，其中所述阻断子序列组分为寡核苷酸或寡核苷酸类似物，如此处所描述其还可与同一与单引物杂交的靶核酸链上的序列杂交；其中所述启动子模板寡核苷酸(PTO)如此处所描述包含可杂交(且优选地为互补)到置换的延伸产物的3’末端的3’部分和包含DNA依赖的RNA聚合酶启动子序列的5’部分。至于在此处描述的TSO中，与启动子序列紧紧相邻的序列可设计为提供优选地在RNA聚合酶作用下用于本发明方法的扩增中的最佳转录活性。阻断子序列组分通常设计为与靶序列在其上游位点杂交，即相对于单引物杂交位点而言，阻断子序列的杂交位点位于靶的5’末端)。换一种说法，且如此处描述，阻断子序列与靶核酸序列的片段杂交，杂交处在靶序列的5’，与引物延伸产物的3’末端互补。阻断子序列以高亲和力结合靶，以在阻断子与靶杂交的位点处终止引物延伸。该特性提供了聚合酶作用下的引物延伸的有力终止位点，并确定了引物延伸产物的3’末端。
合适的反应介质和条件为此处所述。在一个实施方案中，转录在不同的温度进行，温度通常低于之前的步骤。在另一实施方案中，本方法的所有步骤在等温条件下进行。
单链核酸靶与复合引物、阻断子组分、前启动子模板(PTO)、DNA聚合酶、核糖核酸酶如RNaseH、DNA依赖的RNA聚合酶和核苷酸如NTPs(例如dNTPs和rNTPs)结合。复合引物和阻断子序列组分与同一靶链杂交形成三分子复合体I(图1A)。引物沿着靶延伸直至阻断子序列的杂交位点，形成复合体II(图1A)。
核糖核酸酶(例如RNaseH)切除RNA部分，通常为复合体II单复合引物的5’RNA部分，形成了复合体III(图1B)。如此处所描述，核糖核酸酶特异地切割RNA/DNA杂合体的RNA链，但并不消化单链RNA。这样，核糖核酸酶不会降解游离的复合引物。游离引物与复合体III中靶核酸的引物互补位点杂交(图1B)。此杂交导致形成复合体IV(图1B)，复合体中仅引物的5′RNA部分与靶链杂交。通过部分杂交的引物的3′DNA部分进行引物延伸产物5′最末端序列的置换，导致形成复合体V(图1C)，该复合体为DNA聚合酶的底物。引物沿靶链的延伸导致第一引物延伸产物(VI)从复合体中置换出来。循环进行RNaseH切割过程、游离复合引物的杂交和链置换产物的产生，以形成多条单链DNA产物(VII)。置换的延伸产物与靶序列完全互补且不包含不与靶互补的3’末端部分。
通过前启动子模板3′末端部分(A)与置换的引物延伸产物3’末端杂交，前启动子模板寡核苷酸(PTO)与置换的延伸产物结合形成复合体VIII(图1C)。如此处所述，PTO的3’末端可被封闭或不被封闭。当前启动子模板的3′末端不被封闭时，模板将沿置换的引物延伸产物进行延伸。置换的延伸产物的3′末端将在核苷酸(DNA)聚合酶作用下沿已杂交的前启动子模板的B部分延伸形成复合体IX(见图1D)，该复合体在一个末端包含用于DNA依赖的RNA聚合酶的双链启动子序列。复合体IX在图1D中描绘为PTO的3’末端封闭的由聚合酶延伸而产生的启动子模板寡核苷酸(PTO)杂交产物。另外，当启动子模板的3’末端不被封闭时，3’末端沿置换的引物延伸产物的延伸导致形成了完全的双链复合体。DNA依赖的RNA聚合酶将转录两种形式的复合体IX延伸的置换引物延伸产物。RNA聚合酶的选择要考虑到其转录复合体的部分双链体或完全双链体形式的能力。此转录步骤产生了多拷贝的正义单链RNA(X)(图1D)。
希望从每一引物延伸产物产生的RNA转录本的产量优选地为至少约1，更优选地至少约50，甚至更优选地至少约75，仍更优选地至少约100，且最优选地为至少约1000。
如在图IE中所示，第二组步骤(第二转录组件)使用第二寡核苷酸引物4，该引物相对于靶核酸序列而言，为与复合引物同义)、如第一组件中应用的启动子模板寡核苷酸、RNA依赖的DNA聚合酶或反转录酶(RT)、DNA依赖的DNA聚合酶、RNaseH和DNA依赖的RNA聚合酶。如本领域内已知的，DNA聚合酶、反转录酶和RNaseH酶活性可包含在同一种酶内。
这两个组件组合进行或顺序进行。为了简单起见，此处描述的步骤为顺序步骤。第一组步骤的反应混合物中的一份与包含以上提到的组分的混合物合并，且扩增反应等温进行。
第二引物4与第一组件的RNA产物的3’末端序列杂交。因此第二引物通常设计为与这样的序列互补，所述序列在第一组步骤中所用复合引物的互补序列的上游，该第二引物如为巢式引物。第二引物通常(尽管并非必需)为DNA寡核苷酸(通常但并非必需为非复合引物)。杂交引物通过反转录进行延伸形成RNA/DNA双链复合体XI(图IE)。复合体XI的RNA链经RNaseH切除产生单链DNA产物XII(图IE)，该产物相对于靶核酸序列为反义(即互补)，与第一组步骤的引物延伸产物类似。
引物延伸产物XII的3’末端通常与启动子模板寡核苷酸的3’末端互补(如第一组步骤的引物延伸产物)。产物XII与启动子模板寡核苷酸的杂交导致形成了复合体XIII(图1E)。引物延伸产物的3’末端沿启动子模板寡核苷酸通过反转录进行延伸，形成部分的双链体XIV(图IF)，该双链体在一端具有双链启动子序列。部分的双链体XIV为用于转录的底物，在DNA依赖的RNA聚合酶作用下形成正义RNA产物X(图1F)。
引物4与产物X杂交将重新启动描述为第二转录组件的过程，然后产生了循环扩增过程或指数级扩增。在第二组步骤中，目的起始序列扩增的程度将由启动子模板寡核苷酸和第二引物的浓度所限定。
作为以上描述的证据，本发明方法适用于靶核苷酸的高效扩增以及应用该扩增方法如进行此处所述的等温测序。
方法2基于TSO的增强的线性核酸扩增在一个实施方案中，本发明基于TSO的线性扩增方法与引物延伸产物的转录相连以提供增强的核酸扩增。该新型扩增方法(方法2)的一个实施方案的图解描述在图2A-2E中显示。
本发明的基于TSO的核酸扩增方法利用复合引物，如此处描述。本发明扩增方法中应用的第二种寡核苷酸为模板转换寡核苷酸(TSO)，如上所描述。待扩增的核酸靶可为DNA或RNA。对RNA靶的扩增，需要根据本领域已知方法的进行起始cDNA的合成步骤。本发明基于TSO的增强的线性扩增方法产生多拷贝与靶DNA序列同质(即为正义)的RNA产物。
单链靶核酸与复合引物、TSO寡核苷酸、DNA聚合酶、核糖核酸酶如RNaseH、DNA依赖的RNA聚合酶和核苷酸如脱氧核糖核苷三磷酸(dNTPs)和核糖核苷三磷酸(rNTPs)在适合核酸杂交和扩增的反应介质中结合，这一点为本领域已知。在一个实施方案中，转录在不同的温度进行，通常在低于之前步骤的温度下进行。在另一实施方案中，本方法的所有步骤均在等温条件下进行。
在一个实施方案中，TSO作为终止序列行使功能并提供前启动子序列。在另一实施方案中，TSO不包含前启动子序列。在该实施方案中，前启动子序列由包含前启动子序列且可与引物延伸产物的3′部分杂交以使引物延伸产物的转录得以发生的另一寡核苷酸如PTO单独提供。
单复合引物和TSO然后与同一待扩增的核酸链杂交。在靶核酸变性步骤之前，这两种寡核苷酸可加到怀疑包含核酸靶的样本中。这两种寡核苷酸与靶链的杂交导致形成了三分子复合体XV(图2A)。
由DNA聚合酶进行引物延伸。引物沿复合体XV(图2A)的靶核酸链延伸并在TSO杂交位点处终止。模板从靶链转换到TSO的5′非杂交部分，且进一步沿TSO模板的引物延伸导致形成三分子复合体XVI，该复合体XVI包含靶核酸、TSO和第一引物延伸产物。第一引物延伸产物为包含靶依赖部分(即与靶核酸互补的序列)和TSO依赖部分(即与TSO非杂交部分互补的序列)的独特DNA。
复合体XVI(图2A)为RNA聚合酶和核糖核酸酶(如RNaseH)的底物。DNA依赖的RNA聚合酶结合到复合体XVI的功能性双链启动子，并转录第一引物延伸产物以产生正义RNA产物X(图2A)。可特异降解RNA/DNA异源双链体中RNA链的核糖核酸酶(如RNaseH)降解复合体XVI中引物延伸产物的5′部分，形成三分子复合体XVII(图2B)。
游离复合引物与复合体XVII(图2B)中靶核酸的引物互补位点杂交。该杂交过程导致形成了复合体XVIII(图2B)，其中仅引物的RNA部分(通常为5′RNA部分)与靶链杂交。将引物延伸产物的5′最末端序列用部分杂交引物的3′DNA部分(XVIII)替换，导致形成复合体XIX(图2B)，该复合体为DNA聚合酶的底物。引物沿靶链(XIX；图2B)的延伸导致第一引物延伸产物XX从复合体中的置换。重复引物延伸和链置换导致产生多拷贝的多核苷酸(XX；图2C)，该多核苷酸在很大程度上与靶核酸互补。
以上描述产生的引物延伸产物用作提供了包含前启动子序列的TSO的实施方案中的转录模板。置换的引物延伸产物(XX；图2C)与游离TSO寡核苷酸杂交形成部分双链体XXI(图2C)。复合体(双链体)XXI包含位于一端的双链部分和分别来源于引物延伸产物和TSO的两条非互补单链。此部分双链体中的双链部分包含一个完全的功能性双链启动子用于DNA依赖的RNA聚合酶。后者识别部分双链体XXI中的启动子，并转录引物延伸产物，以形成多拷贝的正义RNA产物X(图2C)。
如在方法1中所描述和在图2D-E中所显示的，以上描述的等温扩增通过将反应混合物和第二引物4、反转录酶、RNaseH、DNA依赖的RNA聚合酶和所需的核苷三磷酸组合，而与进一步的扩增相连。第二引物4如在方法1中所示与正义RNA产物的5′部分杂交，并通过反转录酶延伸形成RNA/DNA杂合双链体XXII(图2D)。RNaseH切除XXII的RNA链，产生单链反义DNA引物延伸产物XXIII(图2D)。该引物延伸产物的3′末端与TSO的一段序列互补。该引物延伸产物与游离TSO的杂交导致形成复合体XXIV(图2D)。DNA聚合酶沿TSO的5′末端对该引物延伸产物的3′末端进行延伸，形成部分双链体XXV(图2E)。后者为DNA依赖的RNA聚合酶的底物，因为在其一端包含双链启动子序列。引物延伸产物的转录导致产生了多拷贝的正义单链RNA产物X(图2E)。
第二引物4与RNA产物杂交，并通过反转录酶延伸重新启动如上描述的过程，这样使得如在方法1中描述的靶核酸序列得以循环扩增。
基于前启动子TSO的扩增方法本发明基于前启动子TSO的方法以应用模板转换机制形成独特的引物延伸产物为基础。本发明的核酸扩增方法包括通过核苷酸聚合酶进行的引物延伸和不依赖于引物的转录。该方法应用单引物和可在引物延伸过程中实现模板转换的前启动子TSO。引物和前启动子TSO两者均与同一靶核酸链互补。前启动子TSO包含与靶多核苷酸互补的3’部分；以及包含不能与靶(在一组给定的条件下)杂交的5′部分，其中不能杂交的5′部分包含启动子的单链序列(其通常为TSO的5′最末端序列)，该启动子用于根据本发明方法扩增步骤中所用的DNA依赖的RNA聚合酶。在一些实施方案中，与前启动子序列紧挨的前启动子TSO的序列(如前启动子序列的3′)设计为在RNA聚合酶作用下可实现最大化转录的序列。此类序列在本领域内已知并在此描述。能够实现模板转换的TSO序列可根据本领域内已知的标准进行设计(见Patel等，美国国家科学院院报(1996)，932969-2974)；美国专利号5,679,512；5,683,879和6,030,774。
基于前启动子TSO的扩增方法通常使用几种酶DNA依赖的DNA聚合酶、DNA依赖的RNA聚合酶、在RNA/DNA杂合体中切除RNA的酶(如RNaseH)和RNA依赖的DNA聚合酶(如反转录酶)。酶活性可由单独的酶或由多种组合(即具有多种活性的一种或几种酶)提供。根据本发明方法扩增所用的酶可由商业渠道获得，这一点为本领域的技术人员所已知。
引物和前启动子TSO通常以高浓度提供，浓度与那些通常用于PCR方法的类似。靶多核苷酸的扩增水平通常由这些寡核苷酸的浓度限定。虽然引物通过掺入延伸产物而消耗，但前启动子TSO并不掺入延伸产物。如在图3A-B和5A-B中所描述，前启动子TSO参与起始的模板转换用以形成独特的复合体，该复合体为DNA依赖的RNA聚合酶的底物(一种转录过程)。在某些实施方案中，前启动子TSO也参与结合单链DNA产物(该单链DNA产物为从第一转录组件的RNA转录本进行反转录而产生)，以形成用于转录的第二底物，如在图3B中所示。应当理解，可以应用任何包含前启动子序列且包含可与该单链DNA产物杂交的区域的多核苷酸。例如可使用PTO。
与其它基于转录的等温扩增方案(如NASBA、TMA等)不同，本发明基于前启动子TSO的方法不需要形成完整的双链DNA产物，其中所述完整的双链DNA产物为那些先前描述的基于转录的核酸扩增方法中重要的中间体。既然不需要双链中间体DNA产物，那么就不需要应用正向和反向引物对(用于沿靶多核苷酸链及其互补链的引物延伸)。这样通过消除引物二聚体的形成降低了引物延伸反应的复杂性，所述引物二聚体为两条或多条引物杂交并延伸形成的双链底物，可用于以靶不依赖方式进行包含双链启动子的转录。应用本发明此处描述的单引物降低了该过程的复杂性。该过程通过应用不必被延伸的启动子模板而得以进一步简化，例如通过在第一引物延伸步骤和在与第二引物延伸产物的杂交中应用同一种前启动子TSO而简化该过程。
本发明基于前启动子TSO方法的一个示例性实施方案靶核酸的扩增通常基于单链靶，因此通常使靶成为单链(如果不是单链的话)。因此，如果靶核酸是双链DNA，扩增的第一步是变性以产生单链靶。当靶核酸为RNA时，扩增可直接由单链靶RNA进行，如以下所示。另外，也可通过本领域已知的方法从RNA靶合成cDNA而进行扩增。
如在图3A-B中所示，在本发明方法的一个实施方案中，TSO和单引物与靶核酸链杂交形成三分子复合体I。复合体的靶链可为如在图3A-B所示的DNA，或为如在图4A-B所示的RNA。
DNA聚合酶沿复合体I的靶链进行引物延伸。当靶为DNA时，酶通常为DNA依赖的DNA聚合酶，但当靶为RNA时，酶通常为RNA依赖的DNA聚合酶(如反转录酶)。
如图3A-B和4A-B中所示，引物延伸从靶转换到前启动子TSO的5′非杂交部分，转换点为TSO与靶结合处，因此有效终止了靶特异序列的复制。沿TSO 5′非杂交部分的延伸导致形成了独特的延伸产物，该产物由靶相关部分和TSO相关部分组成。由靶、TSO和第一引物延伸产物形成的独特三分子复合体II(图3A和4A)包含双链启动子区域，因此使它成为DNA依赖的RNA聚合酶的底物。
如在图4A-B中所示，当靶为RNA时，复合体II的RNA链可被(但不是必需)RNaseH降解形成复合体IIa，该复合体包含前启动子TSO和第一引物延伸产物。该复合体还包含双链启动子且为RNA聚合酶的底物。
DNA依赖的RNA聚合酶与复合体II(图3)和IIa(图4)的双链启动子结合，并启动独特引物延伸产物的转录。该过程导致产生多拷贝的单链RNA产物，该产物与靶多核苷酸同义。
第二引物与正义RNA产物杂交形成复合体III(图3A和4B)。第二引物通常且优选地为与第一引物相同。在第一和第二引物不同的实施方案中，第二引物通常与第一引物的极性相同。沿RNA产物的引物延伸通过RNA依赖的DNA聚合酶(如反转录酶)进行，产生DNA/RNA的异质双链体IV(图3A和4B)。
复合体IV的RNA链用RNaseH消化，产生在RNA依赖的DNA聚合酶作用下形成的引物延伸的单链DNA产物(第二引物延伸产物)。游离的前启动子多核苷酸(在图3B中为前启动子TSO)与单链DNA产物的3′部分杂交形成复合体V(图3B)。如果用于第一步的前启动子多核苷酸为TSO，则与TSO上序列互补的位于第二引物延伸产物(DNA)上的序列可能已在模板转换过程掺入第二引物延伸产物。
前启动子多核苷酸(图3B中所示为TSO)与DNA产物的结合产生TSO的5′突出端，因此复合体V中单链DNA产物的3′末端沿前启动子多核苷酸(TSO)延伸以复制启动子序列。这导致形成了复合体VI(图3B)，该复合体包含一功能性双链启动子序列。复合体VI为DNA依赖的RNA聚合酶的底物。聚合酶与双链启动子结合并转录第二引物延伸产物以产生多拷贝的正义RNA产物。RNA产物为用于如以上描述的进一步引物杂交和延伸的底物。这样，循环扩增过程以产生多拷贝的正义RNA产物。
如果不有意终止，扩增可一直进行，直到所有游离TSO与第二引物延伸产物杂交或引物被完全消耗。
如在图3A-B中所示，在第一引物延伸产物的转录后一旦形成RNA产物，对DNA靶或RNA靶扩增而得到的该RNA产物是相同的，且从该步骤以后的扩增方案是相同的。
每个转录步骤(即第一或第二引物延伸产物的转录)预期导致产生的产物优选地至少约1、更优选地至少约100、更优选地至少约500、且最优选地至少约1000条源自起始模板的单链RNA产物的拷贝(在第一转录组件中，模板为靶多核苷酸；在第二转录组件中，模板为第一转录组件中产生的RNA转录本)。
本发明扩增方法的扩增产物为单链，因此用本领域已知的多种方法易于检测。用于单链核酸检测的同类或异类的方法是已知的，并适于本发明扩增方法中反应产物的检测和定量。
用于本发明方法中的组分和反应条件模板核酸待扩增的核酸靶包括任何来源的纯化或非纯化核酸，其可为DNA(dsDNA和ssDNA)或RNA(包括tRNA、mRNA、rRNA)、线粒体DNA和RNA、叶绿体DNA和RNA、DNA/RNA杂合体或它们的混合物、基因、染色体、质粒、生物材料的基因组或其片段，其中所述生物材料例如微生物(如细菌、酵母、病毒、类病毒、霉菌、真菌、植物、动物、人。核酸的获得和纯化应用本领域内的标准技术。在一些实施方案中，RNA靶的扩增需要起始的cDNA合成，这一点为本领域内已知。DNA/RNA杂合体的扩增需要杂合体的变性以获得ssDNA或ssRNA，或变性后由反转录步骤获得cDNA。靶核酸可仅为复杂混合物(如生物样本)的一小部分，且可由多种生物材料通过领域内已知的步骤获得。
靶多核苷酸扩增的起始步骤是获得单链多核苷酸。如果靶多核苷酸为双链，起始步骤为靶变性。变性步骤可为领域内已知的热变性或任一其它方法，如碱处理。
复合引物一方面，本发明的方法使用由RNA和DNA部分组成的复合引物。如此设计引物的复合结构可使接下来通过结合新的(另外的)复合引物而置换引物延伸产物，并在聚合酶的作用下可对新引物进行延伸。此外，引物延伸产物RNA部分的切除导致产生的扩增产物不用作复合引物扩增的底物，如以下所描述。
本发明的方法和组合物中应用的复合引物包含至少一个RNA部分，该部分能够(a)与靶核酸(模板)上的序列结合(杂交)，此过程不依赖其DNA部分与靶核酸上序列的杂交；和(b)当与靶DNA杂交时可由核糖核酸酶切除。复合引物与靶核酸结合形成部分的异质双链体，其中仅引物的RNA部分在与核糖核酸酶如RNaseH接触时被切除，而靶链仍保持完整，这样使得另一复合引物可退火。
复合引物也包含能与靶核酸(模板)上的序列杂交的3′DNA部分，以至于它与靶序列(模板)的杂交优于在DNA聚合酶作用下从靶核酸置换下来的核酸链与靶序列(模板)的杂交。此类引物的合理设计基于已知的影响核酸结合亲和力的因素，如序列长度和/或同一性以及杂交条件。在一个优选的实施方案中，复合引物3′DNA部分与靶核酸上其互补序列的杂交优于置换链5′末端的同源序列与靶核酸的杂交。
产生适于通过聚合延伸的引物在领域内已知，如在PCT
发明者N·库尔恩, N 库尔恩 申请人:纽亘技术公司