专利名称：用cyp52a2a启动子增强酵母中的基因表达的制作方法
有关联邦政府支持研究或者开发的声明本发明至少部分由Department of Commerce，NIST-ATPCooperative Agreement Number 70NANB8H4033和Department ofEhergy No.DE-FC36-95GO10099的基金支持。因此政府在本发明中拥有特定的权利。
背景技术：
相关申请的交互参考本发明要求2000年7月26日提交的美国临时申请60/220850的优选权，后者的内容在此引作参考。
1.发明领域本发明涉及在酵母中提高双羧酸生产的方法和组合物，其通过用源自具有所需活性水平的酵母基因的异源启动子取代目的基因的天然启动子。
2.相关领域描述脂族双羧酸是作为原料用于制备香精、多聚体、粘合剂和大环内酯抗生素的通用化学介质。尽管已有几种合成长链、α，ω-双羧酸的化学方法，但是其合成并不简单且多数方法导致包含较短长度链的混合物。结果就必需进行广泛的纯化步骤。尽管已知长链双羧酸也能够通过微生物转化其烷烃、脂肪酸或者酯类来生产，但是因为现今生物学方法的局限化学合成依然是商业化最可行的途径。
有几种已知的酵母菌株在以烷烃或者脂肪酸为碳源培养时分泌α，ω-双羧酸作为副产品。尤其是，已知属于假丝酵母菌属(Genus Candida)的酵母如白色假丝酵母(C.albicans)，阴沟假丝酵母(C.cloacae)，季氏假丝酵母(C.guillermondii)，中间型假丝酵母(C.intermedia)，解脂假丝酵母(C.lipolytica)，麦芽糖假丝酵母属(C.maltosa)，近平滑假丝酵母(C.parapsilosis)和涎涞假丝酵母(C.zeylenoides)的酵母产生上述双羧酸(Agr.Biol.Chem.352033-2042(1971))。同时，已知多种热带假丝酵母产生链长度在C11到C18范围的双羧酸(Okino等，BM Lawrence，BDMookherjee和BJ Willis(eds)，在Flavors and FragrancesA WorldPerspective.PrQCeedings of the 10thInternational Conference ofEssential Oils，Flavors and Fragrances，Elsevier Science PublishersBV Amsterdam(1988))，这是由Buhler和Schindler在AliphaticHydrQCarbons in Biotechnology，H.J.Rehm和G.Reed(eds)，Vol.169，Verlag Chemie，Weinheim(1984)中所综述的几个专利的基础。
有关酵母代谢烷烃和脂肪酸的生物化学过程的研究已显示有三种类型的氧化反应烷烃α-氧化成为乙醇，脂肪酸ω-氧化成为α，ω-双羧酸以及脂肪酸β-氧化降解为CO2和水。前两种类型的氧化由微粒体酶类催化而最后一种类型发生在过氧化物酶体中。在热带假丝酵母中，ω-氧化途径的第一步由包含细胞色素P450单加氧酶和NADPH细胞色素还原酶的膜结合酶复合体(ω-羟化酶复合体)催化。这种羟化酶复合体负责烷烃和脂肪酸末端甲基基团的初步氧化，如在Gilewicz等人，Can.J.Microbiol.25201(1979)中所述，此处引作参考。如在Sanglard等人，Gene76121-136(1989)中所述，先前已经将编码复合体细胞色素P450和NADPH还原酶成分的基因分别鉴定为P450ALK和P450RED，并已克隆、测序，此处引作参考。也将P450ALK命名为P450ALK1。近来，已将ALK基因用符号CYP命名，RED基因用符号CPR命名。见，如，Nelson，Pharmacogenetics6(1)1-42(1996)，此处引作参考。也可参见Ohkuma等人，DNA and Cell Biology14163-173(1995)，Seghezzi等人，DNA and Cell Biology，11767-780(1992)，以及Kargel等人，Yeast 12333-348(1996)，其中每篇文献此处引作参考。另外，现在也将CPR基因指为NCP基因。见，例如，De Backer等人，Antimicrobial Agents and Chemotherapy，451660(2001)。例如，根据Nelson，(见上)的命名法，也将P450ALK命名为CYP52。由乙醇氧化酶和乙醛脱氢酶催化经过另外两个氧化步骤从烷烃最终形成脂肪酸，如在Kemp等人，Appl.Microbiol.andBiotechnol.28370-374(1988)中所述，此处引作参考。通过同一或者相似的途径可以将脂肪酸进一步氧化为对应的双羧酸。脂肪酸经由ω-羟基脂肪酸和它的醛衍生物进行到对应的双羧酸的ω-氧化过程不需要CoA活化。然而，在过氧化物酶体中脂肪酸和双羧酸经过β-氧化途径活化为对应的乙酰-CoA酯之后，都会降解导致链缩短。在哺乳动物系统中，ω-氧化的脂肪酸和双羧酸产物以相等的速度活化为它们的CoA酯，并成为线粒体和过氧化物酶体β-氧化的底物(J.BiQChem.，102225-234(1987))。在酵母中，β-氧化仅发生在过氧化物酶体中(Agr.Biol.Chem.491821-1828(1985))。
细胞色素P450单加氧酶(P450)是包括P450和CPR(NCP)的多组分酶系统中最后的单氧化酶。在某些案例，如以下的描述以及在Morgan等人Drug Metab.Disp.12358-364(1984)中所述，涉及另一个电子载体，细胞色素b5(CYTb5)和它相关的还原酶。如Nelson，见上所述，P450包括广泛存在于自然界并已从多种生物体分离出来的蛋白质超家族。这些生物体包括多种哺乳动物、鱼类、无脊椎动物、植物、软体动物、甲壳类、低等真核生物和细菌(Nelson，见上)。最先在啮齿类肝脏微粒体中第一次作为碳-单氧结合色素发现如Garfinkel，Arch.BiQChem.Biophys.77493-509(1958)所述，此处引作参考，后来基于它们在偶联CO还原的差异光谱中有450nm的吸收而命名为P450，如Omura等人J.Biol.Chem.2392370-2378(1964)所述，此处引作参考。
在真核的膜结合系统中，由细胞色素P450催化的单加氧反应需要电子经由NADPH-细胞色素P450还原酶(CPR)从NADPH转移到P450，如Taniguchi等人，Arch.BiQChem.Biophys.232585(1984)所述，此处引作参考。CPR是大约78,000Da的核黄素蛋白，每摩尔的酶包含1mol的核黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)和1mol的黄核素单核苷酸(FMN)，如Potter等人J.Biol.Chem.2586906(1983)所述，此处引作参考。CPR的FAD部分是电子进入酶的位点，同时FMN是对P450的电子供给位点，如Vermilion等人，J.Biol.Chem.2538812(1978)所述，此处引作参考。全部反应如下
底物结合到P450的催化位点显然导致构象的变化引发电子从CPR转移到P450。第一个电子转移之后，O2结合Fe2+-P450底物复合物形成Fe3+-P450底物复合物。然后这个化合物由来自CPR的第二个电子还原或者在某些案例中，由NADH经第二个电子载体细胞色素b5(CYTb5)及和它相关的NADH-细胞色素b5还原酶还原，如Guengerich等人，Arch.BiQChem.Biophs.205365(1980)，此处引作参考以及Morgan，见上所述。前述的研究多数显示CYTb5仅为转移第二个电子而包括在该途径中。将这个有反应活性的氧中的一个原子引入到底物中，同时另一个还原为水。然后氧化的底物分解，再生细胞色素P450氧化的形式，如Klassen，Amdur和Doull，Casarett andDoull”s Toxicology，Macmillan，New York(1986)所述，此处引作参考。对于CYTb5，这种蛋白质在P450表达中的作用除作为电子载体，也已经提出其它几种模型。
尽管已有几种化学途径合成长链α，ω-双羧酸如9-十八碳烯二酸(9-QCtadecenedioic acid)，这些方法是复杂的，并通常导致包含较短长度链的混合物。结果就必需进行广泛的纯化步骤。作为化学合成的替代方法，可以经由发酵方法如微生物转化其中对应的碳氢化合物如烷烃或者烯烃，脂肪酸或者酯生产长链α，ω-双羧酸如9-十八碳烯二酸。在美国专利5,254,466中描述一种以相当的产量生产基本纯化的α，ω-双羧酸的方法，该文献的全部内容此处引作参考。这种方法包括培养热带假丝酵母菌株，其中染色体POX5的两个拷贝以及每个POX4A和POX4B基因在包含氮源、有机底物和共底物的培养基中被破坏。
在热带假丝酵母宿主菌株中POX4和POX5基因的破坏在其第一步反应(由乙酰-辅酶A氧化酶催化)有效的阻断β氧化途径。POX4A和POX5基因编码长链乙酰辅酶A氧化酶的不同亚基，它们是过氧化物酶多肽(PXP)，分别命名为PXP-4和PXP-5。一个或者多个上述基因的破坏导致β氧化途径部分或者全部的失活，由此通过将底物重新导向α-氧化途径而允许提高双羧酸的产率，也阻断通过β氧化途径对双羧酸产物的再利用。
在美国申请09/302,620和国际申请PCT/US99/20797中描述以相当的产率生产基本纯化的α，ω-双羧酸的另一种方法，每篇文献的全部内容此处引作参考。这种方法包括在热带假丝酵母菌株中扩增CYP和CPR基因的拷贝数目以增加CYP和CPR(NCP)酶，并在包含有机底物的培养基中培养遗传改造过的菌株。
涉及多种饲料原料如HOSFFA(高油的向日葵油，即包括油酸的脂肪酸混合物，可购自Cognis Corp.as Edenor and Emersol)的生物转化基因具有控制它们转录调节的天然启动子。有时这些启动子不足以获得生产涉及给定的过程的基因产品如CPR或者CYTb5所需的转录水平。
因此，需要提高酵母中双羧酸产量的改良的方法。
发明概述一方面，本发明涉及用于增加微生物如酵母中双羧酸产量的改良的方法和组合物。在一个实施方案中，通过分离出涉及双羧酸生产的基因的弱启动子，并用来自具有高表达水平的酵母基因的强启动子代替该弱启动子来增加双羧酸的产量。强启动子操作性连接于涉及双羧酸生产的目的基因，该替代增加目的基因的转录水平。
另一方面，提供包含操作性连接于编码异源蛋白质开放阅读框的CYP52A2A基因启动子的核酸序列。可以使用这种核酸序列转化宿主细胞获得靶蛋白表达的增加。
另一方面，提供表达载体，包括前述的核酸构建体中的任一个。在另外一个方面，提供用一种前述的表达载体转化的宿主细胞。
另一方面，提供转化宿主细胞的方法，包括分离出CYP52A2A启动子；分离出目的基因；将CYP52A2A启动子操作性连接于目的基因的开放阅读框而产生融和基因；将融和基因插入表达载体；并用表达载体转化宿主细胞。
附图
简述图.1A-1B描述热带假丝酵母20336的CYP52A2A基因的核苷酸序列。
图.2A-2B描述热带假丝酵母20336的CPRA基因的核苷酸序列。
图.3A-3B描述热带假丝酵母20336的CPRB基因的核苷酸序列。
图.4A-4C描述热带假丝酵母20336的CYTb5基因的核苷酸序列，以及对应于所述的核苷酸序列的氨基酸序列。
图.5A-5D描述CYP52A2A/CPRB融和基因的核苷酸序列以及对应于所述的核苷酸序列的氨基酸序列。
图.6A为λZAP ExpressTM载体的示意性描述。
图.6B为pBK-CMV噬菌粒载体的图谱。
图.7.是来自Invitrogen的质粒pCR2.1TM的示意性描述。描述所选的限制性位点和其它特征的核苷酸序列(SEQ.ID.NO.33和互补链SEQ.ID.NO.34)。
图.8.描述URA3A基因的核苷酸序列以及对应于所述的核苷酸序列的氨基酸序列。
图.9是质粒pNEB193的示意性描述。
图.10是整合载体pURAin的示意性描述。
图.11描述CYP52A2A基因启动子/CYP52A5A ORF融和基因的核苷酸序列。
发明详述根据本发明，在酵母中增加双羧酸产量建立在分离来自酵母的具有所需表达水平的启动子，和将该启动子操作性连接于涉及双羧酸生产的目的基因的基础上。因此，使用高诱导性异源启动子的启动子替换因为转录增加而增加双羧酸产率，其中高诱导性异源启动子操作性连接于涉及酵母双羧酸生产的目的基因的开放阅读框(ORF)。而且，在生物转化的不同的限定时间内对特定刺激(如压力、底物、细胞死亡)反应而被诱导的基因启动子可用于目的基因启动子的替换，从而导致在生物加工的过程中限定的时间内增加双羧酸产量。
热带假丝酵母20336(SEQ.ID.NO.1)(见图.1)的基因CYP52A2A是涉及油酸代谢生产油酸双羧酸的基因家族中的一个基因，如在前述美国申请09/302,620和国际申请PCT/US99/20797中所述。在油酸发酵中这个基因的转录诱导水平高出同一基因家族其它成员许多倍(＞25)。CPR基因(在这里也指作NCP基因)例如热带假丝酵母20336(细胞色素P450还原酶，分别为图2和3)的CPRA(SEQ.ID.NO.2和CPRB(SEQ.ID.NO.3)是涉及生产双羧酸过程的其它基因。然而，在对应的发酵中这种CPR基因的转录诱导水平只高出背景3倍，这定义双羧酸生产中的速率限制因素。
可以通过用CYP52A2A启动子替代其天然启动子上调转录速度低于CYP52A2A的任何涉及脂肪酸生物转化的基因。在优选的实施方案中，CPR基因的启动子由CYP52A2A或其他CYP基因的启动子代替，这样来增加CPR基因的转录诱导。例如，CPR基因的启动子衍生自热带假丝酵母20336的CYP52A2A基因。将CYP基因的全部启动子或者其包含启动子区域上所有关键功能位点的部分操作性连接于CPR基因如来自热带假丝酵母20336的CPRB基因的开放阅读框。这反过来导致CPR蛋白质转录和生产的增加，以及对应的脂肪酸如油酸到它对应的双羧酸的转化增加。术语“操作性连接”指核苷酸序列联合从而其中一个的功能影响另一个。当启动子可以影响开放阅读框(ORF)(即，ORF处于该启动子的转录调控之下)时称它操作性连接于开放阅读框。尽管在启动子和ORF之间存在其它序列，但是应该理解为启动子仍然操作性连接于ORF。在另一个优选的实施方案中用CYP52A2A或者CYP基因的启动子用与此处的描述大致相同的方法取代CYTb5的启动子，导致CYTb5蛋白质产量增加，以及在脂肪酸到它们对应的双羧酸的转化的增加。
在本发明的一个实施方案中，采用本领域技术人员已知的常规方法分离所需的启动子。采用适合的限制酶实施剪切在启动子末端下游合适的位置切割CYP基因。然后去除CYP基因的结构部分，留下包含启动子区域的关键DNA序列。对于上游切割，选择上游充分远的位点以在残留部分中包含启动子区域所有必须的功能位点，然后用合适的限制酶切割。在这里描述的实施例中，应该理解启动子可能包括在长于实际启动子区域的核苷酸片段上，并且可将整个的片段，包括附加的核苷酸序列，用于融合目的基因。
接下来，制备启动子/目的基因开放阅读框核苷酸融合构建体。将启动子操作性连接于异源目的基因，即并非CYP52A2A基因的基因的开放阅读框，以产生用于整合进入宿主细胞的核苷酸融合构建体。融合启动子到目的基因从而它们操作性连接并且产生所需的DNA构建体的方法，在本领域众所周知。限制酶、连接酶和聚合酶是本领域技术人员经常使用的产生融合构建体的常规工具。在优选的实施方案中，构建聚合酶链式反应(PCR)引物采用PCR扩增CYP52A2A基因的启动子。用本领域技术人员已知的常规方法验证正确的序列。也通过PCR扩增并用测序校验目的基因如CPR或者CYTb5的开放阅读框(ORF)和3’非翻译区。然后，将上述两种序列采用两种PCR产物和对融合部分并非同源的起始PCR的最初引物通过PCR融合在一起。产物包括CYP52A2A启动子，目的基因ORF和3’UTR，并通过序列分析确证。
然后用启动子/目的基因ORF融合构建体产生用于转化进入任何适合的宿主细胞的DNA整合载体。例如，根据本发明适用的酵母宿主细胞包括，但并非局限于，Yarrowia，Bebaromyces，啤酒糖酵母属(Saccharomyces)，裂殖糖酵母属(Schizosaccharomyces)以及毕赤氏酵母属(Pichia)且更优选假丝酵母菌属中的种类。优选的假丝酵母种类是热带假丝酵母，麦芽糖假丝酵母，apicola，paratropicalis，白假丝酵母，阴沟假丝酵母，季氏假丝酵母，中间型假丝酵母，解脂假丝酵母，近平滑假丝酵母，以及涎沫假丝酵母。
特别优选的宿主包括已经过遗传改造而使一个或者多个染色体POX4A、POX4B和两条POX5基因被破坏的热带假丝酵母菌株，如美国专利.5,254,466和5,620,878所述，每篇文献此处引作参考。这种破坏阻断β-氧化途径。β-氧化途径阻断的热带假丝酵母菌株包括H41、H41B、H51、H45、H43、H53、H534、H534B以及H5343(ATCC20962)，如在前述美国专利5,254,466中所述。
可以在适合的表达载体中克隆并表达这里所述的DNA构建体。实例包括，但并非局限于，如质粒、噬菌粒、噬菌体或者粘质粒、酵母附加体质粒、酵母人工染色体和酵母复制型质粒等载体。也可以通过将包含所需基因序列的线性DNA载体引入细胞来转化宿主细胞。当需要避免非天然(外来)DNA引入细胞时，这种线性DNA可能是有优势的。例如，用对细胞天然的DNA序列侧翼包围的所需的目的基因DNA，能够通过例如，但并非局限于，电穿孔、乙酸锂转化和原生质法的方法被引入细胞。侧翼DNA序列可以包括筛选标记和/或其它的遗传工程工具。可以用这里描述的任何表达载体转化酵母细胞。术语“表达载体”在此应用广泛并意在涵盖含有核苷酸并能够用来转化靶细胞的任何媒介物。这样表达载体涵盖此处所列包括如整合载体在内的所有载体实例。
在优选的实施方案中用DNA构建体转化酵母细胞如假丝酵母属，而获得其中的蛋白质如CPR蛋白质表达的增加，将含有用于在酵母中启动转录的可诱导的CYP启动子DNA的DNA构建体操作性连接于编码CPR蛋白质的DNA而使其能在酵母细胞中表达，CYP启动子DNA对编码该蛋白质的DNA来说为外来的或者异源的。一旦产生，即产生包含CYP52A2A启动子/目的基因ORF的嵌和体的酵母宿主细胞。
在另一个优选的实施方案中，使用DNA融合构建体转化酵母细胞如假丝酵母菌属来获得其中的CYTb5蛋白质表达的增加，含有用于在酵母中启动转录的可诱导的CYP启动子的DNA构建体可操作性的连接到编码CYTb5蛋白质的DNA上以便使其能够在酵母细胞中表达，而对于编码CYTb5蛋白质的DNA，CYP启动子DNA是外来的或者异源的。作为实例，将衍生自热带假丝酵母20336的CYP52A2A基因的CYP52A2A启动子的全部或其含有启动子区域所有关键功能位点的部分融合到CYTb5基因如来自热带假丝酵母20336的CYTb5基因(图.4描述核酸序列(SEQ.ID.NO.4)以及对应于所述的核苷酸序列的氨基酸序列)的开放阅读框。
可以采用本领域技术人员众所周知的技术测定启动子的长度。在优选的实施方案中，可以采用定量竞争性反向转录聚合酶链式反应(QC-RT-PCR)估测启动子长度，从而估测从发酵罐中分离的酵母如假丝酵母细胞中CPR和CYTb5的表达。适合时使用酶学测定和对CPR和CYTb5蛋白质均特异的抗体去验证对应蛋白质合成的增加反应启动子强度的增加。如此，通过在酵母生产宿主如热带假丝酵母、麦芽糖假丝酵母、毕赤氏酵母属等中选择性整合、扩增和过量表达CPR和CYTb5基因而提高二羧酸的产量。
用一个前述的载体转化的酵母细胞可以在包含有机底物的培养基中培养以提高双羧酸的产量。培养酵母例如发酵酵母可以通过本领域众所周知的方法完成，如前述的美国专利5,254,466中所述。
这里适合的有机底物可以是任何可被生物氧化为单-或者多羧酸的有机化合物。这种化合物可以是任何饱和的或不饱和的脂肪族化合物或者任何羧基或杂环芳香族化合物，其具有至少一个可以被生物氧化为羧基基团的末端甲基基团、末端羧基基团和/或、末端官能基团。为羧基基团衍生物的末端功能基团可以出现在底物分子中且可以通过非生物氧化的反应转化为羧基基团。例如，如果末端基团是酯，则热带假丝酵母的野生型或者这里描述的遗传改造型均不能允许酯官能度水解为羧基基团，所以可在发酵过程中的加入脂肪酶来释放自由脂肪酸。适合的有机底物包括，但并非局限于，饱和脂肪酸、不饱和脂肪酸、烷烃、烯烃和其组合。
烷烃是一种类型的饱和有机底物，在这里尤其有用。烷烃可以是线性的或环状的，支链的或直链的，替代的或未替代的。尤其优选具有从约4到25个碳原子的烷烃，其实例包括，但并非局限于，丁烷、己烷、辛烷、壬烷、十二烷、十三烷、十四烷、十六烷、十八烷等。
可以在这里使用的不饱和有机底物的实例包括，但并非局限于，内烯烃如2-戊烯、2-己烯、3-己烯、9-十八烯等；不饱和羧酸如2-己酸及其酯，油酸及其酯包括具有相对高油酸含量的甘油三酯，芥子酸及其酯包括具有相对高芥子酸含量的甘油三酯，蓖麻油酸及其酯包括具有相对高蓖麻油酸含量的甘油三酯，亚油酸及其酯包括具有相对高亚油酸含量的甘油三酯；不饱和醇如3-已烯-1-醇、9-十八烯-1-醇等；不饱和醛如3-已烯-1-醛、9-十八烯-1-醛等。如上所述之外，可以在这里使用的有机底物包括具有至少一个内在的碳碳双键和至少一个可被生物氧化为羧基基团的末端甲基，末端羧基和/或末端官能团的脂环族化合物。这种化合物的实例包括，但并非局限于，3，6-二甲基、1，4-环己二烯、3-甲基环己烯、3-甲基-1，4-环二烯等。
可以在这里使用的芳香族化合物的实例包括，但并非局限于，芳烃如邻，间，对，二甲苯；邻，间，对，甲基安息香酸；二甲基嘧啶，固醇等。有机底物也可以包括其它可被生物氧化为羧基基团的功能基团如醛或醇基。有机底物也可以包括其它不可被生物氧化为羧基基团且并不参与生物氧化的功能基团如卤素、醚等。
可以用于根据本发明的包含前述融合构建体的酵母细胞的饱和脂肪酸实例包括己酸、庚酸、辛酸、壬酸、癸酸、十一碳酸、十二(烷)酸、十四(烷)酸、十五(烷)酸、十六酸、十七酸、十八(烷)酸、二十烷酸、二十二烷酸和其组合。可以应用于遗传改造过的酵母细胞的不饱和脂肪酸包括棕榈油酸、油酸、芥(子)酸、亚油酸、亚麻酸和其组合。可以应用的烷烃和烷烃的部分包括任何组合的从C12到C24的链连接物。优选的脂肪酸混合物实例为HOSFFA(高油的向日葵油即包括大约80％油酸的脂肪酸混合物，可自Cognis Corp.as Edenor and Emersol购得)。
下述的实施例意在阐述并非限制本发明。
实施例I
CYP52A2A/CPRB融和基因的构建对CYP52A2A构建体的启动子区域设计PCR引物。采用以下列出的CYP2A#1和CYP2A fus引物扩增大约496bp的包含CYP52A2A启动子的核苷酸片段(-496bp自CYP52A2A基因的起始密码子，见图.5A位置9-504)。采用CPR fus和CPRB#2扩增CPRB的ORF(开放阅读框)和它的3’UTR。采用CYP2A#1和CPRB#2引物通过PCR将这两种PCR产物融合到一起产生包含大约500bp的3’UTR的构建体。在所有的PCR反应中，使用Platinum Pfx(Stratagene，LaJolla，CA)。表1中给出前述引物的核苷酸序列。
表1
在使用前校验所得的构建体序列(见图.5，描述核苷酸序列(SEQ.ID.NO.10)和相应于确切描述的核苷酸序列的氨基酸序列(SEQ.ID.NO.11))。生成的片段在相应的基因启动子和ORF区域包含三个碱基的替代，其序列与亲本不同但氨基酸的组成没有变化。在CYP52A2A启动子区域于483位存在“T”到“A”的替代，于CPRBORF的573位存在“T”到“C”的替代，2013位存在“C”到“T”的替代。另外，有证据表明在热带假丝酵母中密码子CTG不根据“通用遗传密码子”翻译为亮氨酸而是丝氨酸。见，例如Uede等人，BiQChemie(1994)76，1217-1222。然而，尚不能证明这个结论。所以，既然可以将图.5A中位于652-654的CTG密码子翻译成亮氨酸或者丝氨酸，就把在图.5A中出现的第十五个氨基酸命名为“X”，而“X”可以是亮氨酸或者丝氨酸。将该构建体作为PacI的敏感片段组合进整合载体，pURA in RED B产生新的载体pURA in CPR B/2A-NCP，然后转化热带假丝酵母。
在前述的美国申请09/302,620和国际申请PCT/US99/20797中描述了前述包括克隆CYP52A2A和CPRB基因、制备整合载体pURA inRED B以及用载体转化细胞的方法，这些方法也包括在以下内容中。
实施例II定量竞争性反向转录聚合酶链式反应(QC-RT-PCR)的方法QC-RT-PCR是用来定量RNA样品中特异RNA数量的技术。这种技术应用通过反转录和接下来使用聚合酶链式反应的扩增合成与原始样品中RNA分子互补的特异性DNA分子。通过向样品中加入不同数量的竞争者RNA分子，能够确定目的RNA分子的浓度(例如，CPR或者CYTb5基因的mRNA转录产物)。随着时间测定特异mRNA转录物的水平，后者对生长热带假丝酵母培养物的发酵生长培养基中加入脂肪酸或者烷烃底物反应，以此分离和鉴定涉及这些底物氧化的基因。
A.引物设计QC-RT-PCR的第一个要求是设计用于反转录和其后PCR反应的引物对。需要这些引物对目的基因是唯一且特异的。表2列出了用QC-RT-PCR测量热带假丝酵母20336中CYTb5基因表达所用的引物。
表2.在QC-RT-PCR反应中用来测定热带假丝酵母CYTB5基因表达的引物。
F＝正向B＝反向B.设计和合成竞争者DNA模板在体外从竞争者DNA模板合成竞争者RNA，前者具有T7聚合酶启动子、并优选相对于天然目的RNA序列带有小部分缺失例如大约10到25个核苷酸。采用长度在42到46个核苷酸的PCR引物合成用于体外合成竞争者RNA的DNA模板。在该实施例中，表3列出了用于合成CYTb5竞争者DNA的引物对。
表3.QC-RT-PCR测定CYTb5基因表达所用的合成竞争者RNA模板的正向和反向引物。
伴随相应的反向引物使用正向引物来合成竞争者DNA模板。根据厂商推荐的说明书在标准的Taq Gold聚合酶PCR反应(Perkin-Elmer/Applied Biosystems，Foster City，CA)中组合引物对。PCR反应的混合物包含终浓度均达250nM的每种引物，和10ng用作模板的热带假丝酵母染色体DNA。将反应混合物置于热循环仪(thermQCycler)达25到35个循环，在PCR反应期间采用可能的最高退火温度以确保均一的PCR产物(这里为62℃)。将PCR产物或者凝胶纯化或者过滤纯化以去除未结合的核苷酸和引物。然后采用(A260/280)方法定量竞争者模板DNA。
C.合成竞争者RNA采用来自Ambion Biosciences(Ambion Inc.，Austin，Texas)的Megascript T7试剂盒在体外转录竞争者模板DNA产生竞争者RNA。将250ng竞争者DNA模板与体外转录试剂混和，反应混合物37℃温育4小时。然后通过凝胶电泳检测所得的RNA制备物来确定获得最高产量和质量的竞争者RNA的条件。可能需要根据厂商说明书最优化该步骤。然后采用DNaseI限制性内切酶去除DNA模板。然后通过(A260/280)方法定量RNA竞争者。将RNA连续稀释(1ng/ml到1毫微微克(fg)/ml)用于QC-RT-PCR反应，原始的材料储存于-70℃。
D.QC-RT-PCR反应根据厂商推荐的说明书采用rTth聚合酶试剂盒(Perkin-Elmer/Applied Biosystems，Foster City，CA)进行QC-RT-PCR反应。以终浓度为200mM的每种dNTP、1.25单位的rTth聚合酶、1.0mM MnCl2、1X厂商随酶附送的10X缓冲液、100ng从热带假丝酵母的发酵生长培养物中分离的总RNA和1.25mM适合的反向引物在10μl体积中进行反转录反应。为了定量热带假丝酵母中CyTb5的表达，适合的反转录引物为3740-179C(见表2)。为每种鉴定的RNA样品准备了几种反应混合物。为了定量CYTb5的表达，一系列8到12个前述的QC-RT-PCR反应混合物等分到不同的反应试管中。将每毫升包含100pg到100fg的CYTb5竞争者RNA的1ml系列稀释液加到每只试管中使反应混合物并于终体积达到10μl。根据厂商推荐的反转录发生的次数混和QC-RT-PCR反应混合物70℃温育15分钟。15分钟的温育完成后，降低样品温度至4℃以终止反应，将40的PCR反应混合物加入到反应中使总体积达50μl。由水溶液组成的PCR反应混合物包含0.3125mM正向引物3740-179A(见表2)，3.125mM MgCl2和1X Perkin-Elmer随酶提供的螯合缓冲液。将反应混合物置于Perkin-Elmer GeneAmp PCR System2400热循环仪(Perkin-Elmer/Applied Biosystems，Foster City，CA)，进行其后的PCR循环94℃1分钟之后94℃10秒钟，然后58℃40秒钟共17到22个循环。以最终58℃温育2分钟然后保持在4℃完成PCR反应。在某些反应中，没有产生可检测的PCR产物，将样品返回热循环仪进行另外的循环，重复该过程直到产生足够的PCR产物来用HPLC定量。产生足够的PCR产物所必须的循环数目是100ng总细胞RNA中靶mRNA量的函数。在CYTb5基因高表达的培养物中，有充分的CYTB5 mRNA信使存在就需要较少的PCR循环(≤17)来产生可以定量数量的PCR产物。存在的靶mRNA的浓度越低，产生可检测数量的产物所需要的PCR循环就越多。
E.HPLC定量QC-RT-PCR反应完成以后，通过HPLC和琼脂糖凝胶电泳分析并定量样品。将5到15μl的QC-RT-PCR反应混合物注射到配备Waters484可调监测仪(Waters Corp.，Milford，MA)的WatersBio-Compatible625 HPLC。将监测仪设置监测波长254nm。HPLC包括Sarasep brand DNASepTM柱(Sarasep.Inc.，San Jose，CA)，后者置于烤箱中且温度设定为52℃。根据厂商的推荐安装柱子在注射器和柱子之间有30cm加热的PEEK管道。设定系统将Sarasep brand Guard柱子置于注射器之前。另外，烤箱内在柱子的正前面有0.22mm的过滤圆盘。使用两种缓冲液产生洗脱梯度以从QC-RT-PCR反应中分离和定量PCR产物。缓冲液A包含0.1M三乙基乙酸铵(TEAA)和5％的乙氰(体积比体积)。缓冲液B包含0.1M TEAA和25％的乙氰(体积比体积)。将QC-RT-PCR样品注射到HPLC，75％缓冲液A/25％缓冲液B到45％缓冲液A/55％缓冲液B的线性梯度以每分钟0.85ml的流速走柱6分钟。与来自CYTb5 mRNA(U)的较大QC-RT-PCR反应产物相比，竞争者RNA的较小QC-RT-PCR产物先从HPLC柱子上洗脱下来。用附带的Waters Corporation 745数据模块绘图和定量QC-RT-PCR产物的量。将通过峰面积测定的CYTb5 mRNAQC-RT-PCR产物的量(U)与竞争者QC-RT-PCR产物的量(C)的对数比绘图，并确定竞争者RNA与CYTb5 mRNA产物的量相等所需的量。
实施例III从热带假丝酵母ATCC 20336A.纯化基因组DNAA.构建基因组文库用来自YEPD琼脂平板的热带假丝酵母20336单克隆接种到50mlYEPD肉汤(见附录)，30℃过夜生长。将5ml过夜培养物接种到100ml新鲜的YEPD肉汤中，30℃振荡培养4到5个小时。通过离心收集细胞，用灭菌的蒸馏水洗涤两次，在4ml原生质体缓冲液(1M山梨醇，50mM EDTA，14mM巯基乙醇)中重悬浮，轻微振荡37℃温育30分钟。加入05.ml 2mg/ml的酶解酶(ICN Pharmaceuticals，Inc.，Irvine，CA)，轻微振荡37℃温育30到60分钟。通过SDS裂解监测原生质的形成。通过简单的离心(4,000转/分，3分钟)收集原生质并用不含有巯基乙醇的原生质缓冲液洗涤一次。然后在包含100mg/mlRNase(Qiagen Inc.，Chatsworth，CA)的4ml裂解缓冲液(0.2MTris/pH8.0，50mM EDTA，1％SDS)中重悬浮收集的原生质，并于37℃温育30到60分钟。
将蛋白质变性，并用等体积的氯仿/异戊醇(24∶1)通过手动颠倒轻微的混和两相来抽提蛋白两次。通过10,000转/分离心10分钟分离两相，回收包含高分子量DNA的水相。将Nacl加入水层至终浓度0.2M，通过加入2体积的乙醇沉淀DNA。用洁净的玻璃棒缠绕沉淀的DNA，并将其在TE缓冲液(10mM Tris/pH8.0，1mM EDTA)中重悬浮，允许其4℃过夜溶解。对于溶解的DNA，加入无任何DNase活性的RNase(Qiagen Inc.，Chatsworth，CA)至终浓度为50mg/ml，37℃温育30分钟。然后加入蛋白酶(Qiagen Inc.，Chatsworth，CA)至终浓度为100mg/ml，55-60℃温育30分钟。用等体积的酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)，等体积的氯仿/异戊醇(24∶1)各抽提溶液一次。将0.1体积的3M醋酸钠和2体积的冰冷的乙醇(200proof)加到水相，用玻璃棒缠绕高分子量的DNA，溶解在1到2ml的TE缓冲液中。
B.制备用于PCR扩增CYTb5基因的基因组DNA用单克隆接种5个5ml YEPD培养基，30℃过夜生长。将培养物1200×g离心5分钟。吸除上清液，将0.5ml的山梨醇溶液(0.9M山梨醇，0.1M Tris-Cl/pH8.0，0.1M EDTA)加入到沉淀中。通过涡流重悬浮沉淀，将1ml 2-巯基乙醇和50ml 10mg/ml酶解酶溶解加到混合物中。在旋转摇床(200转/分)上37℃温育试管1小时。然后将试管1200×g离心5分钟，吸除上清液。在0.5ml 1×TE(10mM Tris-Cl/pH8.0，1mM EDTA)中重悬浮原生质沉淀，并转移到1.5ml微量离心管中。通过加入50ml 10％SDS然后在65℃温育20分钟裂解原生质。接下来，加入200ml 5M醋酸钾，混和后，将试管在冰上温育至少30分钟。13,000×g离心5分钟去除细胞碎片。小心去除上清液并转移到新的微量离心管中。通过加入1ml 100％(200proof)乙醇然后13,000×g离心5分钟沉淀DNA。用1ml 70％的乙醇洗涤DNA沉淀接着13,000×g离心5分钟。真空条件下部分干燥DNA后，在200ml 1×TE中重悬浮。通过在260nm/280nm(A260/280)的吸收比率确定DNA的浓度。
实施例IV构建热带假丝酵母20336基因组文库采用λZAP ExpressTM载体(Stratagene，LaJolla，CA)(图.6A)构建基因组文库。用Sau3A1部分消化基因组DNA，消化的DNA电泳之后从琼脂糖凝胶中纯化范围在6到12kb的片段。然后根据厂商的方案将这些DNA片段连接到BamHI消化的λZAP ExpressTM载体臂上。设定三种连接获得接近9.8×105的独立克隆。收集文库，根据厂商说明书扩增，获得供长期储存的高滴定度(＞10噬斑形成单位/ml)的储液。感染大肠杆菌XL1 Blue-MRF’细胞之后确定包装的噬菌体文库的滴定度。在LB培养基或者含有10mM MgSO4和0.2％麦芽糖的NZCYM(见附录)中分别37℃或者30℃过夜振荡培养大肠杆菌XL1Blue-MRF’细胞。然后将细胞离心，并在0.5到1体积的10mM MgSO4中重悬浮。将200ml该大肠杆菌培养物与包装的噬菌体文库的几种稀释液混和，并于37℃温育15分钟。对该混合物，加入2.5ml LB顶层琼脂糖或者NZCYM顶层琼脂糖(保持于60℃)(见附录)，并铺于82mm有盖培养皿中的LB琼脂或者NCZYM琼脂上。允许噬菌体在37℃过夜繁殖以获得不连续的噬菌斑，确定噬菌体滴度。
实施例V筛选基因组文库λZAP ExpressTM载体是能够作为噬菌体或者质粒DNA繁殖(噬菌体转化为质粒之后)的噬菌粒载体。所以，能够通过噬菌斑杂交(筛选λ形式的文库)或者通过菌落杂交(噬菌体转化为质粒之后筛选质粒形式的文库)来筛选在这种载体中构建的基因组文库。从噬菌体λZAPExpressTM(Stratagene，LaJolla，CA)切出质粒pBK-CMV(图.6B)的机制需要辅助噬菌体如ExAssitTM(Stratagene)和大肠杆菌菌株如XLOR(Stratagene)的辅助。质粒pBK-CMV能够在大肠杆菌中自主复制。
A.筛选基因组文库(噬菌斑形式)1)λ文库铺平板在包含10mM MgSO4和0.2％麦芽糖的LB培养基(25m1)于37℃，250转/分过夜培养大肠杆菌XL1 Blue-MRF’细胞。然后将细胞离心(2,200×g 10分钟)，并在0.5体积的10mM MgSO4中重悬浮。将500ml该大肠杆菌培养物与包含25,000扩增的λ噬菌体颗粒的噬菌体悬浮液混和，并于37℃温育15分钟。对该混合物，加入6.5mlNZCYM顶层琼脂糖(保持于60℃)(见附录)，并铺于150mm有盖培养皿中的80-100ml NCZYM琼脂上。允许噬菌体37℃过夜繁殖以获得不连续的噬菌斑。过夜生长之后在进行噬菌斑提起(lift)之前，将平板在冰箱中存放1-2小时。
2)噬菌斑提起和DNA杂交将Magna LiftrTM尼龙膜(Micro Separations，Inc.，Westborough，MA)置于琼脂表面与噬菌斑完全接触，在室温允许转移噬菌斑到尼龙膜进行5分钟。噬菌斑转移之后，将膜置于两片用0.5N NaOH，1.0MNaCl溶液饱和的Whatman 3MTM(Whatman，Hillsboro，OR)滤纸上，室温静置10分钟以使DNA变性。通过在干燥的Whatman 3M滤纸TM短暂的接触去除过量的变性溶液。然后将膜转移到用0.5MTris-HCl(pH8.0)，1.5MNaCl饱和的两片Whatman 3MTM滤纸上，静置5分钟以中和。然后在200-500ml 2×SSC中短暂地洗涤膜，空气中晾干，并于80℃烘烤30-40分钟。然后用标记的DNA探测膜。
用200-500ml 5×SSC，0.5％SDS，1mM EDTA(pH 8.0)的溶液在42℃振荡(60转/分)预洗涤膜1-2小时以从膜上去除细菌碎片。用包含0.5M NaCl和5％封闭剂的ECL GoldTM缓冲液(Amersham)42℃预杂交膜(在相当于0.125-0.25ml/cm2膜的体积中)1-2小时。根据厂商的方案采用QIAEX IITM凝胶提取试剂盒(Qiagen Inc.，Chatsworth，CA)从琼脂糖凝胶中纯化用作探针的DNA片段，并采用Amersham ECLTM直接核酸标记试剂盒(Amersham)标记。将标记的DNA(5-10ng/ml杂交溶液)加到预杂交过的膜上，允许杂交进行过夜。第二天，在包含0.1(高严紧性)或者0.5(低严紧性)×SSC，0.4％SDS和360g/l尿素的缓冲液中(在相当于2ml/cm2膜的体积中)42℃振荡(60转/分)洗涤膜两次，每次20分钟。接着在2×SSC中(在相当于2ml/cm2膜的体积中)室温洗涤5分钟。采用ECLTM核酸检测试剂产生杂交信号，并采用Hyperfilm ECLTM(Amersham)检测。
采用广口巴氏吸管从主平板上移走包含与X-射线胶片正信号对应的噬菌斑的琼脂块。通过用X-射线胶片同平板排比筛选噬菌斑。在这个阶段，一般获得多个噬斑。通过过夜浸泡于1ml SM缓冲液(Sambrook等人，见上文)从琼脂块上洗脱出噬菌体粒子。然后稀释噬菌体洗出夜，用新鲜生长的大肠杆菌XL1 Blue-MRF’细胞铺平板以获得每个85mm NCZYM琼脂平板上有100-500个噬菌斑。如前，将噬菌斑转移到Magna Lift尼龙膜，再次采用同一探针探测。通过移出琼脂块挑选出与X-射线胶片上的信号对应的单个分离良好的噬菌斑，通过过夜浸泡于0.5ml SM缓冲液洗脱出噬菌体。
B.转化λ克隆为质粒形式将分离的λ克隆转化为质粒形式用于进一步分析。通过向大肠杆菌菌株BM25.8感染噬菌斑完成从噬菌斑到质粒形式的转化。大肠杆菌菌株在含有10mM MgSO4和0.2％麦芽糖的LB液体培养基中以250转/分31℃过夜培养直到OD600达到1.1-1.4。移取10ml体积的过夜培养物，与100ml 1M MgCl2混和。移取200ml体积的细胞，与150ml洗脱出的噬菌体悬浮液混和，31℃温育30分钟。将LB液体培养基(400ml)加到试管，31℃继续振荡250转/分温育1小时。将1-10ml感染细胞的悬浮液铺平板到含有100mg/ml氨卡青霉素(SigmaChemical Company，St.Louis，MO)的LB琼脂糖上。挑选分离良好的克隆，并在含有100mg/ml氨卡青霉素的5ml LB液体培养基中37℃，250转/分培养过夜。从这些培养物中分离质粒DNA并分析。为将λZAP ExpressTM载体转化为质粒形式，使用大肠杆菌菌株XL1Blue-MRF’和XLOR。根据厂商(Stratagene)的单噬菌体切出方案进行转化。
实施例VI克隆并鉴定热带假丝酵母20336细胞色素b5(CYTb5)基因用PCR片段作探针从按照实施例IV所述构建的热带假丝酵母ATCC20336基因组文库中分离CYTb5基因。用寡核苷酸引物PCR扩增啤酒糖酵母的基因组DNA之后产生用于CYTb5的PCR片段探针，其中设计引物以采用来自国家生物技术信息中心(National Center forBiotechnology Information)的啤酒糖酵母CYTb5基因扩增某区域。以啤酒糖酵母CYTb5序列为基础产生正向引物3698-66A，5’ATAAGAATGCGGCCGCTG AACGAGAACCACATCCAGGAG3’(SEQ.ID.NO.16)，和反向引物3698-66B 5’CCTTAATTAAGGATAACCACATCCATACGTCGC3’(SEQ.ID.NO.17)。根据厂商推荐的说明书在用Taq DNA聚合酶(Perkin-Elmer/Applied Biosystems，FosterCity，CA)的PCR反应中联合成对使用这些引物。获得大约1036bp的PCR产物。根据厂商的推荐采用Qiaquick(Qiagene，Chatsworth，CA)从琼脂糖凝胶纯化产物，并将其连接到pCR2.1TM载体(图.7Invitrogen，LaJolla，CA)。该PCR片段在分离热带假丝酵母20336Cytb5同源物时用作探针。采用该CYTb5探针筛选基因组文库(见实施例IV和V)，获得包含全长CYTb5基因的克隆。该克隆包含具有调控和蛋白质编码区域的基因(图.4)。387个核苷酸的开放阅读框编码129氨基酸的CYTb5蛋白质(图.4)。
实施例VII构建CYP52A2A/CYTb5融和基因以与上述实施例I相似的方式，将包含CYP52A2A启动子的496bp的核苷酸片段融合到CYTb5的开放阅读框以产生CYP52A2A启动子/CYTb5 ORF融和产物。采用CYP2A#1和CYP2A/b5 fus(TGTGTCGGTCATGGTCGTGATGTG SEQ.ID.NO.18)引物扩增CYP52A2A启动子区域。采用b5/2A fus(CACATCACGACCATGACCGACACA SEQ.ID.NO.19)和b5#2(CCCTTAATTAAGGGGGGATGGAAGTGGCCGSEQ.ID.NO.20)引物扩增CYTb5的ORF和它的3’UTR。采用CYP52A#1和b5#2引物通过PCR将这两种PCR产物融合到一起，使用前校验所得的构建体然后组合入整合载体pURA in RED B，作为PacI敏感片段产生新的载体然后转化入热带假丝酵母。
实施例VIII将CYP52A2A/CYTb5和CYP52A2A/CPRB融和基因整合到热带假丝酵母基因组中为了将所选基因整合入热带假丝酵母染色体，必须有靶DNA序列，该序列可以是基因能够插入其中的完整的或者不完整的基因。也必须有筛选整合事件的方法。在某些案例中，靶DNA序列和供筛选的标记是同一的，如果这样那么必须有方法在整合事件之后回复靶基因作为筛选标记的用途。在热带假丝酵母和它的后代中，符合这些条件的一个基因是URA3A，编码乳清酸核苷-5’-磷酸脱羧酶。使用它作为整合靶点，可以转化热带假丝酵母的ura-变异株而经同源重组再生URA+基因型。依赖于整合载体的设计，能够将一个或者多个基因同时整合入基因组。使用断裂URA3A基因，同源整合会产生至少一个拷贝的插入URA3A基因断裂部分之间的目的基因。而且，因为URA3A和URA3B基因之间的高度序列相似性，构建体的整合能够发生在URA3A和URA3B两个位点。接下来，基于交叉URA3A和URA3B基因的一致序列设计在URA基因部分有缺失的寡核苷酸，能够使用该寡核苷酸产生热带假丝酵母转化株，后者仍是ura-但是仍然携带一个或者多个新整合的所选基因。也能够经由其它方法如传统的诱变或者通过自发突变分离热带假丝酵母的ura-变异株。采用充分确定的方案，能够通过使用5-氟乳清酸(5-FOA)辅助ura-菌株的筛选，如在Boeke等人，Mol.Gen.Genet.197345-346(1984)所述，此处引用作为参考。已经充分证明了这种操作热带假丝酵母的方法的使用，如在Picataggio等人，Mol.And Cell.Biol.114333-4339(1991)；Rohrer等人，Appl.Microbiol.Biotechnol.36650-654(1992)；Picataggio等人，Bio/Technology 10894-898(1992)；美国专利5,648,247；美国专利5,620,878；美国专利5,204,252；美国专利5,254,466所述，此处引用作为参考。
A.构建URA整合载体，pURAin基于热带假丝酵母20336中URA3A基因1712bp的序列设计并合成引物。在PCR中对热带假丝酵母20336基因组DNA使用URA3A引物对#1a AGGCGCGCCGGAGTCCAAAAAGACCAACCTCTG，和(SEQ.ID.NO.21)#1b，CCTTAATTAATACGTGGATACCTTCAAGCAAGTG，(SEQ.ID.NO.22)扩增URA3A在核苷酸733到1688之间的序列，如图.8中所示，它描述了核酸序列(SEQ.ID.NO.23)和相应于确切描述的核酸序列的氨基酸序列(SEQ.ID.NO.24)。设计引物将唯一的5’AscI和3’PacI限制性位点引入扩增所得的URA3A片段。选择AscI和PacI位点，因为在CYTb5或者CPRB基因中不存在这些位点。在PCR中用热带假丝酵母20336基因组DNA作为模板使用URA3A引物对#2扩增如图.8所示URA3A序列的核苷酸9至758。设计URA3A引物对#2a CCTTAATTAAGCTCACGAGTTTTGGGATTTTCGAG(SEQ.ID.NO.25)和#2b GGGTTTAAACCGCAGAGGTTGGTCTTTTTGGACTC(SEQ.ID.NO.26)将唯一的5’PacI和3’PmeI限制性位点引入扩增所得的URA3A片段。在CYTb5或者CPRB基因中也不存在PmeI位点。将URA3A基因的PCR片段纯化，用AscI、PacI、PmeI限制酶消化，并连接到经过凝胶纯化、Qiaex II清洗的AscI-PmeI消化的质粒pNEB193(图.9)，该质粒购自New EnglandBiolabs(Beverly，MA)。使用T4 DNA连接酶(New England Biolabs)用等摩尔数目的DNA末端在16℃进行16小时连接反应。根据厂商的建议将连接物转化入大肠杆菌XL1 Blue细胞(Stratagene，LaJolla，CA)。分离，培养白色菌落，并分离质粒DNA且用AscI-PmeI消化以确定修饰的URA3A插入在pNEB193中。将所得的基础整合载体命名为pURAin(图.10 SEQ.ID.NO.27)。
B.构建pURAin RED B下一步是将CPRB融和基因克隆入pURAin整合载体。在本发明优选的方面，除了通过合成限制性位点序列特异性提供的DNA以外，没有其他外源DNA组合进被克隆入热带假丝酵母基因组的DNA中也即，除了限制性位点DNA，只有天然热带假丝酵母DNA序列组合进基因组。根据厂商的建议用PacI消化，Qiaex II清洗，以及用虾碱性磷酸酶(SAP)(United States BiQChemical，Cleveland，OH)去磷酸化pURAin。以每pmol DNA末端0.2单位的酶浓度用SAP于37℃1小时对大约500ng PacI线性化的pURAin去磷酸化。通过65℃20分钟热灭活终止反应。
在使用之前，将使用上述引物衍生的CPRBPacI片段测序并与CPRB比较以确定PCR没有引入会导致氨基酸变化的DNA碱基变化。确定之后，将CPRB连接于也已用PacI消化过的质粒pURAin。如前所述将PacI消化的pURAin去磷酸化，并连接于CPR Expand Hi-FiPCR产物。将连接混合物转化入大肠杆菌XL1 Blue-MRF’(Stratagene)选择并筛选几个抗性克隆，得到包含载体序列即转化的URA3A基因和20336扩增的CPRB基因(图.3)的正确构建体。AscI-PmeI消化确定成功的构建体。将这种载体命名为pURAin RED B。
C.构建包含CYP52A2A/CPRB和CYP52A2A/CYTb5融和基因的载体选择前面构建的整合载体pURAin RED B作为起始载体。用PacI部分消化这种载体，并凝胶分离线性化片段。通过用T4 DNA聚合酶处理破坏活性PacI，将载体再连接。接下来分离和完全消化这种新质粒产生只有一个活性PacI位点的载体。将这个片段凝胶分离、去磷酸化并连接到CYP52A2A/CPRBPacI片段。或者，将这个片段凝胶分离、去磷酸化并连接到CYP52A2A/CYTb5 PacI片段。
D.确定CYP52A2A/CPRB融和基因的整合基于包含用于转化热带假丝酵母的CYP52A2A/CPRB融和基因的载体构建体，设计方案来检测整合。用PacI消化来自转化株的基因组DNA，其中PacI剪切和释放融和基因但不剪切CYP52A2A和CPRB基因内部。预期消化在URA3A或者URA3B位点发生整合的基因组DNA将导致3.04Kb片段。这些消化物与CPRB基因的片段Southern杂交以筛选这些整合事件。来自用PacI消化的Southern的带信号强度作为整合事件的数目的测量(即，杂交信号越强存在的CYP52A2A/CPRB融和基因的拷贝越多)。
在30℃，170转/分于10ml SC-尿嘧啶培养基培养热带假丝酵母URA原养型微生物用于准备基因组DNA。通过前述方法分离基因组DNA。用PacI消化基因组DNA。使用0.95％琼脂糖凝胶制备DNA印迹杂交。根据Sambrook等人(见上文)碱转移法将DNA从凝胶转移到MagnaCharge尼龙滤膜(MSI Technologies，Westboro，MA)。对于DNA印迹杂交，使用3.3Kb CPRB DNA片段作为杂交探针。根据ECL试剂盒说明书，采用ECL直接标记和检测系统(Amersham)标记300ng CPRB DNA进行DNA印迹杂交。在体积相应于0.125ml/cm2的30ml杂交液中处理印迹。并于在42℃预杂交1小时之后，加入300ngCPRB探针，42℃继续杂交16小时。杂交之后，在包含尿素的一级洗涤液中于42℃洗涤印迹2次，每次20分钟。室温进行2次二级洗涤，每次5分钟，之后根据指导说明进行检测。按照建议暴露印迹16小时。
通过检测PacI3.04Kb片段确定整合，其中片段来自转化株基因组DNA但在热带假丝酵母20336对照中没有。将这种菌株命名为HDC25。
实施例IX将CYP52启动子融合于CPR和CYP52的ORF基于QC-RT-PCR分析，确定CYP52A2A启动子是ATCC 20336中CYP52家族的最强诱导型启动子。产生以下启动子/ORF组合CYP52A2A启动子/CPR ORF(HDC25)，和CYP52A2A启动子/CYP52A5A ORF(HDC28)。
A.构建CYP52A2A/CYP52A5A融合基因设计PCR引物以保存前面所述的CYP52A2A构建体中使用的同一启动子区域。采用CYP2A#1(SEQ.ID.NO.6)和CYP2A/5A RC fus(SEQ.ID.NO.28)引物扩增CYP52A2A启动子的496bp。采用CYP2A/5A fus(SEQ.ID.NO.29)和CYP5A#2(SEQ.ID.NO.30)引物扩增CYP52A2A的ORF和它的3’UTR。采用CYP2A#1和CYP5A#2通过PCR将上述两种PCR产物融合在一起产生包含大约687bp3’UTR的构建体。在所有的PCR反应中，使用Platinam Pfx(Stratagene，LaJolla，CA)。表1和表4中列出前述的核苷酸序列。
为了测序最小化，分离来自基因组文库质粒pPal3(CYP52A5A)的1632bp的Aat II/MluI片段，用来取代CYP52A2A启动子/CYP52A5AORF PCR产物中相应的片段。在使用前验证所得构建体的序列(SEQ.ID.NO.31)(见图.11)。将构建体作为PacI敏感片段组合入整合载体pURA in来产生新的载体，pURAin 2A-5A，然后转化入热带假丝酵母。成功的使用这种构建体产生菌株HDC28-1，-2，-3和-4。在SEQ.ID.NO.32中列出CYP52A5A蛋白质的氨基酸序列表4
B.转化株分析分离来自转化株的基因组DNA之后，用PacI消化DNA。根据标准的DNA印迹杂交方法处理PacI消化物，并用3.3Kb CYP52A5A片段探测。只有获得整合构建体的那些菌株DNA印迹杂交时产生预期的2.7Kb带c.菌株比较当比较菌株HDC28-1和菌株H5343(基础菌株)，表明与比较的菌株相比HDC28-1具有从HOSFFA产生更多油酸双羧酸的能力。下表列出了与H5343相比随着时间油酸双羧酸产量的增加转化时间 总产量 ％相对H5343(hr) (g/Kg) 的提高H5343 HDC28-116 8.8 16.9 9225 15.429.2 89.641 25.942.8 65.248 24.949.2 97.664 24.963.7 155.873 38.767.5 74.4当比较菌株HDC25和菌株H5343(基础菌株)，表明与比较的菌株相比HDC28-1具有从HOSFFA产生更多油酸双羧酸的能力。下表列出了与H5343相比随着时间在油酸双羧酸产量上的增加转化时间总产量 ％相对H5343(hr)(g/Kg) 的提高H5343HDC2517 11.4 12.812.327 20.9 22.57.741 31.3 33.98.368 38 51.836.3可以理解对于此处描述的实施方案和实施例能够做多种改造。所以，不应该将上述描述理解为限制，而仅是作为优选实施方案的范例。例如，能够使用生物(biolistic)基因转移技术完成宿主细胞的转化。尽管此处提出对双羧酸生产的参考文献，但意即本发明对多羧酸也适用。本领域技术人员会预想出仍属于所附权利要求范围的多种实施方案和实施例的其它改造。
附录培养基成分LB液体培养基细菌用胰化蛋白胨10g细菌用酵母提取物5g氯化钠 10g蒸馏水 1,000mlLB琼脂细菌用胰化蛋白胨10g细菌用酵母提取物5g氯化钠 10g琼脂15g蒸馏水 1,000mlLB顶层琼脂糖细菌用胰化蛋白胨10g细菌用酵母提取物5g氯化钠 10g琼脂糖 7g蒸馏水 1,000mlNZCYM液体培养基细菌用酪蛋白消化物 10g细菌用酪蛋白水解氨基酸 1g细菌用酵母提取物 5g氯化钠 5g硫酸镁(无水的) 0.98g蒸馏水 1,000mlNZCYM琼脂细菌用酪蛋白消化物 10g细菌用酪蛋白水解氨基酸 1g细菌用酵母提取物 5g氯化钠 5g硫酸镁(无水的) 0.98g琼脂 15g蒸馏水 1,000mlNZCYM顶层琼脂糖细菌用酪蛋白消化物 10g细菌用酪蛋白水解氨基酸 1g细菌用酵母提取物 5g氯化钠 5g硫酸镁(无水的) 0.98g琼脂糖 7g蒸馏水 1,000mlYEPD液体培养基细菌用酵母提取物 10g细菌用蛋白胨 20g葡萄糖 20g蒸馏水 1,000mlYEPD琼脂*细菌用酵母提取物 10g细菌用蛋白胨 20g葡萄糖20g琼脂 20g蒸馏水1,000mlYNB酵母提取物 3g/L麦芽糖 3g/L蛋白胨 5g/L右旋糖 10g/LDCA2培养基g/l蛋白胨 3.0酵母提取物 6.0醋酸钠 3.0酵母氮碱(Difco)6.7(Yeast Nitrogen Base)葡萄糖(无水) 50.0磷酸钾(二盐基，三水合物) 7.2磷酸钾(单盐基，无水) 9.3DCA3培养基g/l0.3M磷酸缓冲液，pH7.5甘油 50酵母氮碱(Difco) 6.7排出(Drop-out)mix腺嘌呤0.5g精氨酸2g天门冬氨酸2g谷氨酰胺2g甘氨酸2g纤维醇2g亮氨酸10g蛋氨酸2g苯丙氨酸2g丝氨酸2g色氨酸2g缬氨酸2g丙氨酸2g天门冬酰胺2g半胱氨酸2g谷氨酸2g组氨酸2g异亮氨酸2g赖氨酸2g邻-氨基苯甲酸0.2g脯氨酸2g苏氨酸2g酪氨酸2gSC-尿嘧啶*细菌用无氨基酸酵母氮碱 6.7g葡萄糖 20gBacto-琼脂 20g排出混合物 2g蒸馏水 1,000ml*见Kaiser等人，酵母遗传学方法，冷泉港实验室出版社Methods inYeast Genetics，Cold Spring Harbor Laboratory Press，USA(1994)，此处引用作为参考。
序列表<110>Craft，David L.
Wilson，C.RonEirich，DudleyZhang，Yeyan<120>用CYP52A2A启动子增强酵母中的基因表达<130>U0012 OS/OAAP(1010-49)<160>34<170>PatentIn version3.1<210>1<211>3948<212>DNA<213>热带假丝酵母<400>1gacctgtgac gcttccggtg tcttgccacc agtctccaag ttgaccgacg cccaagtcat 60gtaccacttt atttccggtt acacttccaa gatggctggt actgaagaag gtgtcacgga 120accacaagct actttctccg cttgtttcgg tcaaccattc ttggtgttgc acccaatgaa 180gtacgctcaa caattgtctg acaagatctc gcaacacaag gctaacgcct ggttgttgaa 240caccggttgg gttggttctt ctgctgctag aggtggtaag agatgctcat tgaagtacac 300cagagccatt ttggacgcta tccactctgg tgaattgtcc aaggttgaat acgaaacttt 360cccagtcttc aacttgaatg tcccaacctc ctgtccaggt gtcccaagtg aaatcttgaa 420cccaaccaag gcctggaccg gaaggtgttg actccttcaa caaggaaatc aagtctttgg 480ctggtaagtt tgctgaaaac ttcaagacct atgctgacca agctaccgct gaagtgagag 540ctgcaggtcc agaagcttaa agatatttat tcattattta gtttgcctat ttatttctca 600ttacccatca tcattcaaca ctatatataa agttacttcg gatatcattg taatcgtgcg 660tgtcgcaatt ggatgatttg gaactgcgct tgaaacggat tcatgcacga agcggagata 720aaagattacg 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ggtatcttta cgttggatgg1620cgccggctgg aagcacagca gatctatgtt gagaccacag tttgccagag aacagatttc1680ccacgtcaag ttgttggagc cacacgttca ggtgttcttc aaacacgtca gaaaggcaca1740gggcaagact tttgacatcc aggaattgtt tttcagattg accgtcgact ccgccaccga1800gtttttgttt ggtgaatccg ttgagtcctt gagagatgaa tctatcggca tgtccatcaa1860tgcgcttgac tttgacggca aggctggctt tgctgatgct tttaactatt cgcagaatta1920tttggcttcg agagcggtta tgcaacaatt gtactgggtg ttgaacggga aaaagtttaa1980ggagtgcaac gctaaagtgc acaagtttgc tgactactac gtcaacaagg ctttggactt2040gacgcctgaa caattggaaa agcaggatgg ttatgtgttt ttgtacgaat tggtcaagca2100aaccagagac aagcaagtgt tgagagacca attgttgaac atcatggttg ctggtagaga2160caccaccgcc ggtttgttgt cgtttgtttt ctttgaattg gccagaaacc cagaagttac2220caacaagttg agagaagaaa ttgaggacaa gtttggactc ggtgagaatg ctagtgttga2280agacatttcc tttgagtcgt tgaagtcctg tgaatacttg aaggctgttc tcaacgaaac2340cttgagattg tacccatccg tgccacagaa tttcagagtt gccaccaaga acactaccct2400cccaagaggt ggtggtaagg acgggttgtc tcctgttttg gtgagaaagg 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cagttgaagg tttgcaccta acgttgcccc gtgtcaactc aatttgacga 3360gtaacttcct aagctcgaat tatgcagctc gtgcgtcaac ctatgtgcag gaaagaaaaa 3420atccaaaaaa atcgaaaatg cgactttcga ttttgaataa accaaaaaga aaaatgtcgc 3480acttttttct cgctctcgct ctctcgaccc aaatcacaac aaatcctcgc gcgcagtatt 3540tcgacgaaac cacaacaaat aaaaaaaaca aattctacac cacttctttt tcttcaccag 3600tcaacaaaaa acaacaaatt atacaccatt tcaacgattt ttgctcttat aaatgctata 3660taatggttta attcaactca ggtatgttta ttttactgtt ttcagctcaa gtatgttcaa 3720atactaacta cttttgatgt ttgtcgcttt tctagaatca aaacaacgcc cacaacacgc 3780cgagcttgtc gaatagacgg tttgtttact cattagatgg tcccagatta cttttcaagc 3840caaagtctct cgagttttgt ttgctgtttc cccaattcct aactatgaag ggtttttata 3900aggtccaaag accccaaggc atagtttttt tggttccttc ttgtcgtg3948<210>2<211>4206<212>DNA<213>热带假丝酵母<400>2catcaagatc atctatgggg ataattacga cagcaacatt gcagaaagag cgttggtcac 60aatcgaaaga gcctatggcg ttgccgtcgt tgaggcaaat gacagcacca acaataacga 120tggtcccagt gaagagcctt cagaacagtc cattgttgac gcttaaggca cggataatta 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1.包含CYP52A2A基因启动子的核酸序列，其操作性连接于编码异源蛋白质基因的开放阅读框。
2.根据权利要求1的核酸序列，其中异源蛋白质是ω-羟化酶复合体成员。
3.根据权利要求2的核酸序列，其中编码异源蛋白质的基因选自CPR、CYTb5、和CYP52A2A。
4.根据权利要求3的核酸序列，其中CPR是CPRA或者CPRB。
5.根据权利要求3的核酸序列，其选自SEQ.ID.NO.10和SEQ.ID.NO.30的序列。
6.根据权利要求1的核酸序列，其中CYP52A2A基因的启动子包含在较大的核酸片段上，后者的序列与CYP52A2A基因开放阅读框上游的序列对应。
7.包含包括CYP52A2A基因启动子核酸序列的表达载体，该启动子操作性连接于异源蛋白质编码基因的开放阅读框。
8.根据权利要求7的表达载体，其中异源蛋白质是ω-羟化酶复合体成员。
9.根据权利要求8的表达载体，其中编码异源蛋白质的基因选自CPR、CYTb5、和CYP52A2A。
10.根据权利要求9的表达载体，其中CPR是CPRA或者CPRB。
11.根据权利要求7的表达载体，其中表达载体选自质粒、噬菌粒、噬菌体、粘质粒、酵母人工染色体和线性DNA载体。
12.根据权利要求11的表达载体，其中质粒选自酵母附加体质粒和酵母复制型质粒。
13.根据权利要求7的表达载体，其中CYP52A2A基因启动子包含于与CYP52A2A基因开放阅读框上游的序列对应的较大的核苷酸片段中。
14.含有包含CYP52A2A基因启动子的核酸序列的宿主细胞，其中该启动子操作性连接于异源蛋白质编码基因的开放阅读框。
15.根据权利要求14的宿主细胞，其中核酸序列包含在表达载体中。
16.根据权利要求14的宿主细胞，其中异源蛋白质是ω-羟化酶复合体成员。
17.根据权利要求16的宿主细胞，其中编码异源蛋白质的基因选自CPR、CYTb5、和CYP52A2A。
18.根据权利要求17的宿主细胞，其中CPR是CPRA或者CPRB。
19.根据权利要求14的宿主细胞，其中宿主细胞选自Yarrowia、假丝酵母属、Bebaromyces、糖酵母属、裂殖糖酵母属和毕赤氏酵母属。
20.根据权利要求19的宿主细胞，其中假丝酵母宿主细胞选自热带假丝酵母、麦芽糖假丝酵母、C.apicola、C.paratropicalis、白色假丝酵母、阴沟假丝酵母、季也蒙氏假丝酵母、中间型假丝酵母、解脂假丝酵母、近平滑假丝酵母和涎沫假丝酵母。
21.根据权利要求14宿主细胞，其中CYP52A2A基因启动子包含于与CYP52A2A基因开放阅读框上游的序列对应的较大的核苷酸片段中。
22.转化宿主细胞的方法，其包括分离CYP52A2A基因启动子；分离靶基因；将CYP52A2A基因的启动子操作性连接于靶基因的开放阅读框(ORF)而产生融和基因；将融和基因插入表达载体；并且用表达载体转化宿主细胞。
23.根据权利要求22的方法，其中靶基因编码的蛋白质为ω-羟化酶复合体成员。
24.根据权利要求23的方法，其中靶基因是CPR、CYTb5、和CYP52A2A。
25.根据权利要求24的方法，其中靶基因CPR是CPRA或者CPRB。
26.根据权利要求22的方法，其中CYP52A2A基因的启动子包含于与CYP52A2A基因开放阅读框上游的序列对应的较大的核苷酸片段中。
27.根据权利要求22的方法，其中宿主细胞选自Yarrowia、假丝酵母属、Bebaromyces、糖酵母属、裂殖糖酵母属和毕赤氏酵母属。
28.根据权利要求27的方法，其中Candida宿主细胞选自热带假丝酵母、麦芽糖假丝酵母、C.apicola、C.paratropicalis、白色假丝酵母、阴沟假丝酵母、季也蒙氏假丝酵母、中间型假丝酵母、解脂假丝酵母、近平滑假丝酵母和涎沫假丝酵母。
29.根据权利要求22的蛋白质，其进一步包括在含有有机底物的培养基中培养转化的宿主细胞。
30.根据权利要求29的方法，其中宿主细胞是产生一或多种多羧酸的酵母细胞。
全文摘要
本发明提供包含CYP启动子的核酸序列，该启动子操作性连接编码异源蛋白质的核酸以增强该核酸的转录。同时提供包含上述核酸序列的表达载体和宿主细胞。此处描述的方法和组合物特别用于由酵母细胞生产多羧基酸。
文档编号C12N1/19GK1444649SQ01813276
公开日2003年9月24日 申请日期2001年7月25日 优先权日2000年7月26日
发明者D·L·克拉夫特, C·R·威尔森, D·艾里希, Y·张 申请人:科金斯公司