专利名称：一种双增强子甲胎蛋白重组启动子及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属生物技术，涉及基因表达调控，具体地说，涉及一种双增强子甲胎蛋白重组启动子的构建，该重组启动子能够在甲胎蛋白阳性的肝癌细胞内高效表达目的基因。本发明可用于在肝癌细胞内表达外源基因及制备靶向性肝癌基因治疗药物。
背景技术：
近年来随着人们生活方式及环境的改变，多种恶性肿瘤的发病率均呈上升趋势，死亡率也居高不下，恶性肿瘤在许多城市已成为第一位死亡原因，在农村位列第二位。在常规的手术、放化疗等手段之外，亟需要开发新的治疗手段以提高治疗效果，降低死亡率。肿瘤生物治疗是一种新的肿瘤治疗模式，其中基因治疗是开展较早研究的一种方式，我国批准了世界上第一个正式进入临床使用的基因药物表达野生型P53的腺病毒注射液“今又生”以及随后获得批准的溶瘤病毒药物重组人5型腺病毒(HlOl)注射液“安柯瑞”，国外也上市有用于化疗耐受的实体瘤治疗的携带Cyclin G靶向肿瘤及转移灶的逆转录病毒基因治疗药物Rexin G (该药目前在美国是治疗骨肉瘤、软组织肉瘤及胰腺癌的“孤儿药物(orphan drug)”。靶向基因治疗是目前肿瘤基因治疗研究最重要一个方面。靶向基因治疗涉及多个环节，包括载体靶向性地进入肿瘤细胞、外源基因在肿瘤细胞中靶向性地表达，以及表达的外源基因靶向性地抑制、杀伤肿瘤细胞，其中外源基因在肿瘤细胞中靶向性地表达是一个研究热点。 正常细胞在各种致癌因素的作用下逐渐发生变化直至最后发生癌变，有很多在正常组织不表达或低水平表达的基因都表现出异常高表达的现象。这些基因之所以会在肿瘤细胞中有异常高的表达，是因为肿瘤细胞中该基因的启动子被活化以及细胞内具有丰富的与该启动子相关的转录因子、转录激活因子。因此这类基因的启动子常常被作为肿瘤特异性启动子(tumor-specific promoter)用于基因治疗中调控外源基因在肿瘤细胞中的革巴向表达。肝癌在我国是最常见的危害极大的恶性肿瘤之一，发病率和死亡率均相应地占全球半数。与其它常见恶性肿瘤相比，肝癌早期诊断较难，且恶性程度高，目前的手术和介入治疗等常规方式的疗效和预后均不理想，肝移植费用既高且又仍会复发，因此肝癌基因治疗研究有很重要的意义。甲胎蛋白(alpha fetoprotein, AFP)是肝癌的肿瘤标志物，在肝癌细胞中异常表达而在正常肝细胞中不表达，因此甲胎蛋白基因的启动是一个理想的肝癌特异性启动子，在很多肝癌靶向基因治疗中都被用作外源治疗基因的表达调控元件。例如带动自杀基因在肝癌细胞中的特异性表达[7]和设计肝癌特异性溶瘤病毒[8]等。和其它一些实验性肿瘤基因治疗研究常用的广谱的hTERT、Survivin等基因启动子相比，由于甲胎蛋白的表达不同于hTERT、Survivin等基因在肿瘤细胞和许多正常组织干细胞中也阳性表达，甲胎蛋白仅限于胚胎组织或成体肝癌(包括少量胃癌)，因此基于甲胎蛋白启动子的基因治疗的特异性更好，对其它正常组织的副作用更小。但是甲胎蛋白启动子也存在和包括癌胚抗原(carcinoembryonic antigen, CEA)在内的其他一些组织特异性启动子一样的问题，即表达效率相对来说较低，而且由于不同的肝癌细胞中甲胎蛋白的表达水平有高有低，使得甲胎蛋白启动子在这些不同的肝癌细胞中的转录启动效率不一，从而影响其调控的目的基因的表达效率和所发挥的作用，最终导致基于甲胎蛋白启动子的靶向性肝癌基因治疗的效果不一，尤其是对一些甲胎蛋白表达水平较低的肝癌细胞的基因治疗效果较差。因此，从目前靶向性肝癌基因治疗的研究现状来看，要提高靶向性肝癌基因治疗的效果，必须提高特异性启动子甲胎蛋白的转录启动效率。启动子是基因表达的基本调控元件，而增强子(enhancer)则可以显著提高启动子的启动效率的表达调控元件。人的甲胎蛋白基因启动子的5’侧翼有一个增强子区域，有多个肝细胞特异性转录因子结合位点，可以较大幅度地特异性地提高甲胎蛋白启动子的效率。最近的一项基于巨细胞病毒(cytomegalovirus, CMV)的早期转录增强子的功能研究表明，该增强子可以极大地提高很多基因启动子的转录启动效率。为了提高甲胎蛋白基因启动子的转录启动效率，目前在利用甲胎蛋白基因启动子进行的研究工作中，有采用一些增强子来提高其启动效率的报道，但采用的都是单一的增强子。
发明内容
本发明的目的是提供一种基因表达调控元件，即一种双增强子甲胎蛋白重组启动子，为一种DNA分子，其核苷酸序列如SEQ ID No:1所示，其中第7位至第537位为CMV早期转录增强子序列，第544位至第1364位为人甲胎蛋白基因增强子序列，第1370位至第1549位为人甲胎蛋白基因启动 子序列。本发明的另一个目的是提供一种双增强子甲胎蛋白重组启动子(基因表达调控元件)在构建外源基因表达载体中的应用。该基因表达调控元件在用于构建外源基因表达载体并导入肝癌细胞后可以在肝癌细胞内极大量地表达外源基因。本发明的再一个目的是提供一种双增强子甲胎蛋白重组启动子(基因表达调控元件)在制备用于AFP阳性的肝癌的靶向基因治疗药物中的应用。当本发明提供的基因表达调控元件用于基因治疗载体构建、进而制备基因治疗药物时，可用于AFP阳性的肝癌的靶向基因治疗。我们根据不同增强子的性质特点和工作原理，设计了用两种增强子来提高甲胎蛋白基因启动子的思路，一个是采用甲胎蛋白基因本身的增强子，该增强子位于甲胎蛋白基因上游，含有多个肝细胞核因子结合位点，具有肝细胞特异性；另一个是采用CMV早期转录增强子，因为CMV启动子是目前哺乳动物细胞中启动效率最高的启动子，其上游增强子的转录增强作用很强。因此，在本发明中我们构建了一种带有CMV早期转录增强子和甲胎蛋白自身特异性增强子的人工重组的甲胎蛋白启动子，使其能够特异性在肝癌细胞中高效率地启动目的基因的表达。双增强子带动的甲胎蛋白基因启动子的启动效率比单一增强子的效果会有较大的提闻。
本发明同现有技术相比具有以下优点及效果:
利用本发明提供的基因表达元件可以制备AFP阳性的肝癌的基因治疗药物，其特点在于以肝癌细胞特异性表达的胚胎性抗原甲胎蛋白为肿瘤细胞特异性表达调控手段、以CMV早期转录增强子和甲胎蛋白基因自身增强子两个增强子同时对甲胎蛋白启动子的效率进行提高。本发明可以用于肝癌基因靶向性基因治疗药物的研发，也可以用于在肝癌细胞中大量表达一些需要在肝癌细胞中合成的外源重组蛋白。
图1为双增强子甲胎蛋白重组启动子构建示意图。图2 CMV早期转录增强子的克隆。图3甲胎蛋白增强子的克隆。图4甲胎蛋白启动子的克隆。图5甲胎蛋白增强子一启动子的克隆。图6甲胎蛋白重组启动子带动的荧光素酶表达载体质粒的鉴定。图7肝癌细胞中双增强子甲胎蛋白启动子对荧光素酶基因表达的提高作用。
具体实施例方式本发明结合附图和具体实施例作进一步说明。这些实施例仅用于说明，但不限制本发明。实施例1:双增强子甲胎蛋白重组启动子的构建
我们按照图1所示的示意图分别克隆了 CMV早期转录增强子、AFP增强子和AFP启动子，然后构建了双增强子甲胎蛋白重组启动子。1、CMV早期转录增强子的克隆
以Invitrogen公司的哺乳动物表达载体pcDNA3.1(+)质粒为模板,采用聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)方法扩增质粒上第241-771位区域的序列如SEQ No:2 所示的 CMV 早期转录增强子，5'引物为:5’ -AGA TCT GAC ATT GAT TAT TGA CTA GT-3’(SEQ No:3，斜体为引入用于进一步克隆的汝./ II位点)、3^弓丨物为:5’_6^ TCC ATG GGGCGG AGT TGT TAC GA_3’(SEQ No:4，斜体为引入用于进一步克隆的及丽Y I位点)，PCR条件为:95 V，5 min ；95 V，30 s, 45 V，45 s, 72 V，45 s,共 30 个循环；最后一个循环完成后于72 1:继续反应10 min。1.2%琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物，紫外灯下切取543bp的条带，用Qiagen公司的Qiaquick凝胶回收试剂盒按照说明书操作回收该PCR产物，并按照说明书将回收产物与Takara公司的pMD19_T载体相连，于16°C连接过夜，转化感受态大肠杆菌DH5α，涂布于含有氨节
青霉素的LB琼脂平板，挑取单菌落于液体LB培养基中振荡培养过夜，收集菌体,提取质粒，Bgl II和汉I双酶切鉴定，有阳性插入片段的质粒(图2:其中M:lkb plus DNA分子量标记，I =CMV早期转录增强子扩增产物，2:pMD19-T/CMVenhancer质粒用Bglll和双酶切)进行DNA测序，序列正确者即为有CMV早期转录增强子的质粒pMD19-T/CMVenhancer。
2、人AFP基因增强子一启动子的克隆
参考有关文献，从GenBank中得到人包括AFP基因在内的第4号染色体的基因组序列(GenBank登录号:NT_006216.14)，在该序列上确定821bp的AFP增强子(SEQ No:5)和180bp的AFP启动子(SEQ No:6)区域，分别设计引物，AFP增强子上游引物为:5’ -AGA TCTCAG ATT GAA TTA TTT GCC TGT CA-3’ (SEQ No:7，斜体为引入用于进一步克隆的汝./ II位点)，下游引物为:5，-WA TCC TAG GAA GTT TTC GCA ATA ATA C_3’ (SEQ No:8，斜体为引入用于进一步克隆的及I位点)，扩增产物总长应为833 bp ;AFP启动子上游引物为:5' -AGA TCT GCC CCA AAG AGC TCT GTG T-3’ (SEQ No:9，斜体为引入用于进一步克隆的Bgl II 位点)，下游引物为:ΠΑ TCC AAA TCA TGC TGA AAT TCT TTT ATA CTC-3’ (SEQNo:10，斜体为引入用于进一步克隆的SaMl I位点)，扩增产物总长应为191 bp。人肝癌细胞H印G2培养于含10%胎牛血清的RPMI1640培养液中，5% CO2, 37 V。收集生长旺盛HepG2细胞，按参考文献提取基因组DNA并定量。以此基因组DNA为模板，采用PCR方法分别扩增人AFP基因的增强子和启动子，PCR条件均为:95 °C变性5 min，然后进行30个循环的扩增:95 0C , 30 S，58 0C , 30 S，72 V 30 S。最后一个循环完成后于72 1:继续反应10 min。获得AFP增强子片段(833 bp)和AFP启动子片段(191 bp)，参见图3、4 (图3中M:DL2000 DNA分子量标记，1:AFP增强子扩增产物，2:pGEM_T Easy/AFPenhancer质粒用BglW和汉3ΜΠ双酶切。图4中M:DL2000 DNA分子量标记，I =AFP启动子子扩增产物，2:pGEM-T Easy/AFPpromoter质粒用i^7II和双酶切)。用1.5%的琼脂糖凝胶进行电泳分离PCR产物，同上用凝胶回收试制盒按照说明书操作回收预期大小的目的PCR产物，并与pGEM-T Easy载体按照使用说明建立连接体系以克隆相应片段，于16 1:连接过夜，转化感受态大肠杆菌DH5 α，涂布于含有氨苄青霉素的LB琼脂平板，提取转化子质粒DNA，用汝7 II和ifeMl I双酶切检测有无相应大小的插入片段，将有预期大小插入片段的质粒DNA送至Invitrogen公司测序，测序结果与基因组序列(NT_006216.14)核对验证其正确性。序列正确者分别命名为 pGEM-T Easy/AFPenhancer (含 AFP 增强子)和 pGEM-T Easy/AFPpromoter(含AFP启动子)。用奴7 II和I双酶切pGEM-T Easy/AFPenhancer,同上电泳分离并回收AFP增强子片段,插入pGEM-T Easy/AFPpromoter质粒的AFP启动子前的兔「7 II位点，经酶切鉴定得到质粒pGEM T-Easy/AFPenhancer-promoter,其兔1./ II和I之间即为获得的大小为1018bp的重组AFP基因增强子一启动子(AFPenhancer-promoter),参见图5(图中M:DL2000 DNA 分子量标记，1:pGEM_T Easy/AFPenhancer-promoter质粒用沒貧711 和Bamm双酶切)。 3、双增强子AFP重组启动子的构建
用Bgl II和BanM I双酶切有CMV早期转录增强子的质粒pMD19_T/CMVenhancer，同上电泳分离并回收543bp的CMV早期转录增强子，插入上述得到的pGEM T-Easy/AFPenhancer-promoter 质粒的兔1./ II 位点，经酶切鉴定，得到质粒 pGEM-T Easy/CMVenhancer-AFPenhancer-promoter,其/^./ II和I之间序列即得到的1555bp的双增强子AFP重组启动子(SEQ No:1, CMVenhancer-AFPenhancer-promoter)。实施例2:甲胎蛋白重组启动子带动的荧光素酶表达载体的构建
首先用 Bgl II 和 BamW I 分别双酶切质粒 pGEM-T Easy/AFPenhancer-promoter和 pGEM-T Easy/CMVenhancer-AFPenhancer-promoter,电泳分离并分别回收 1018bp的 AFPenhancer-promoter 和 1567bp 的 CMVenhancer-AFPenhancer-promoter 片段，各自插入PGL4.10的|7 II位点，用II和历/ d III双酶切鉴定插入方向，正确的插入AFPenhancer-promoter的质粒应出现4223 bp, 653 bp和384 bp三条带，正确的插入CMVenhancer-AFPenhancer-promoter 的质粒应出现 4223 bp, 927 bp 和 653 bp 三条带，结果(图6，其中M:lkb plus DNA分子量标记，1:pGL4.10/AFP质粒用々§.7ΙΙ和历双酶切，2:pGL4.10/CMVenhancer-AFP质粒用^§.7ΙΙ和历idIII双酶切)表明，两个载体均正确构建，因此得到带有AFPenhancer-promoter的突光素酶报告基因质粒pGL4.10/AFP 和带有 CMVenhancer-AFPenhancer-promoter 的突光素酶报告基因质粒 pGL4.10/CMVenahncer-AFP0实施例3:双增强子AFP重组启动子对荧光素酶表达的提高
人肝癌细胞H印3B、HepG2和SMMC7721培养于含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液中，5% CO2, 37 °C。取生长旺盛的上述细胞调至4X IO5细胞/mL，接种于24孔板，2 X IO5细胞/500 PL/孔，培养过夜。提取、纯化两种荧光素酶报告基因质粒pGL4.10/AFP和pGL4.10/CMVenahncer-AFP，溶解于无菌水中，在紫外分光光度计上测定260 nm处光吸收值进行定量。分别各取I Kg上述纯化的带甲胎蛋白基因增强子-启动子的荧光素酶报告载体pGL4.10/AFP、pGL4.10/CMVenahncer-AFP 及不带启动子的 pGL4.10 质粒，分别与 10 ng 的内参质粒pGL4.74混合,用无血清培养液调至50 μι,再各取2 μ 转染试剂Lipofectamine2000用无血清培养液稀释至50 PL，将稀释的DNA和转染试剂混合均匀，室温放置20 min形成转染复合物后逐滴加入24孔板的细胞中，混匀后置培养箱中培养。每种转染设三复孔。按照双荧光素酶活性检测试剂盒说明进行共转染报告基因质粒和内参质粒后细胞内萤火虫突光素酶(Firefly luciferase)和海肾突光素酶(Renilla Iuciferase)的活性检测:转染24 h后的细胞用预冷的PBS洗两遍，然后用100 μ Passive Lysis Buffer冰浴下裂解细胞15 min ;移至微量离心管并充分振荡，4 1:下13000 r/min离心15 s ;取20 PL上清至100 μ LAR II混匀，在化学发光检测仪GloMax 20/20 (Promega公司)上检测10 S，记录萤火虫荧光素酶活性；加入100 μ Stop&Glo试剂，混匀后再检测10 S，记录海肾荧光素酶活性。以萤火虫荧光素活性/海肾荧光素活性作为相对荧光素酶活性单位(Relative Luciferase Unit, RLU)，以不带启动子的pGL4.10转染细胞的相对荧光素酶活性为背景，计算分别用PGL4.10/AFP和pGL4.10/CMVenhancer-AFP两种报告基因转染的各种细胞中的相对荧光素酶活性，分析CMV早期转录增强子对甲胎蛋白基因增强子-启动子转录效率及特异性的影响。从图7可以看出，双增强子甲胎蛋白基因重组启动子可以在人肝癌细胞Ifep3B、!fepG2和SMMC7721中大大地提高荧光素酶的活性(和单一的甲胎蛋白基因增强子的作用相比，分别提高33.07倍、134.22倍和465.18倍)，即在这些细胞中大大提高了其所调控的荧光素酶基因的表达。
权利要求
1.一种双增强子甲胎蛋白重组启动子，为一种DNA分子，其核苷酸序列如SEQ ID No:1所示，其中第7位至第537位为CMV早期转录增强子序列，第544位至第1364位为人甲胎蛋白基因增强子序列，第1370位至第1549位为人甲胎蛋白基因启动子序列。
2.根据权利要求1所述的一种双增强子甲胎蛋白重组启动子在构建外源基因表达载体中的应用。
3.根据权利要求1所述的一种双增强子甲胎蛋白重组启动子在制备用于AFP阳性的肝癌的靶向基因治疗药物中的 应用。
全文摘要
本发明提供一种双增强子甲胎蛋白重组启动子，是一种基因表达调控元件，为一种DNA分子，其核苷酸序列如SEQIDNo1所示。该基因表达调控元件为带有CMV早期转录增强子和甲胎蛋白增强子双重增强子的重组人甲胎蛋白启动子，能够特异性在肝癌细胞中高效率地启动目的基因的表达。双增强子带动的甲胎蛋白基因启动子的启动效率比单一增强子的效果会有较大的提高，在用于构建外源基因表达载体并导入肝癌细胞后可以在肝癌细胞内极大量地表达外源基因。可在构建外源基因表达载体中的应用，也可在制备用于AFP阳性的肝癌的靶向基因治疗药物中的应用。
文档编号C12N15/63GK103088029SQ20131006006
公开日2013年5月8日 申请日期2013年2月26日 优先权日2013年2月26日
发明者叶景佳, 曹江, 陈萍, 李春春, 陈丽红 申请人:浙江大学