专利名称：一个长链非编码rna基因在制备干扰和抑制剂上的应用方法
技术领域：
本发明属于肿瘤分子生物学领域，具体涉及一个新克隆的长链非编码RNA基因序列的应用方法。
背景技术：
原发性肝癌是亚洲与部分非洲地区的高发肿瘤，其病死率居我国恶性肿瘤的第二位，五年生存率只有5%左右，肝癌的防治及其发病机制研究一直是我国医学科学研究中的重要课题。肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是原发性肝癌的一种主要类型,尽管目前在肝细胞癌的诊断和治疗方面有了新的进展，但是对于其发生发展及转移的确切机制仍然存在大量未知的问题。长链非编码RNA (long non-coding RNA, IncRNA)是一类转录本长度超过200个核苷酸的非编码RNA，研究发现很多IncRNA在肿瘤的发生发展中有重要调节作用，它具有抑制肿瘤生长和促进肿瘤转移等生物学作用。IncRNA根据其基因位置可分为五种类型:正义 IncRNA(sense IncRNA)、反义 IncRNA(antisense IncRNA)、双向 IncRNA(bidirectionalIncRNA)、基因内 IncRNA(intronic IncRNA)及基因间 IncRNA(intergenic IncRNA) 之前一直被认为是转录“噪音”的IncRNA，因在基因调节中的重要功能，目前已成为继miRNA之后非编码RNA领域又一研究热点。近年的研究已表明，IncRNA参与X染色体沉默、基因组印记以及染色质修饰、转录激活、转录干扰、核内运输等多种重要的调控过程。IncRNA有望成为肿瘤诊断、治疗和预后新的标志物，同时也为肿瘤的治疗提供了新的靶点。新一代测序(Next Generation Sequencing, NGS)技术的迅猛发展将基因组水平的研究带入了一个新的阶段，许多基于全基因组的研究成为可能，RNA测序(RNA-Sequencing, RNA-Seq)就是利用新一代测序技术对生物样品转录的全部RNA进行高通量测序，以获得被测样品转录组(transcriptome)数据的一种重要新技术。最近我们利用新一代测序技术对肝细胞癌患者活检标本及正常对照肝组织样品进行RNA-Seq，在肝癌样品中检测到染色体llql3.1区域存在相邻的几个明显RNA-Seq信号峰，而在正常对照组织中却没有，且该染色体区域目前尚无已知基因登录，提示可能存在一个或多个未知的新基因。我们以此为线索，证实这几个RNA-Seq峰来自同一个新基因，并克隆了该基因全长序列。该基因全长序列为3526bp，可转录成多个转录本，将该基因全长的序列输入ORF finder软件进行开放阅读框预测，未发现明显的开放阅读框，说明该基因编码一个长链非编码 RNA (long non-coding RNA, IncRNA)。我们从肝癌及正常对照组织中抽提RNA后通过逆转录，实时定量PCR，检测了该IncRNA的表达情况，结果显示该IncRNA在肝癌组织中表达上调(P〈0.001)。我们随后又利用原位杂交的方法，进一步在大样本中验证了该IncRNA在肝癌中表达显著上调(P〈0.001)。因此针对该IncRNA的检测制剂可用于肝癌的辅助诊断。生存曲线分析发现该IncRNA表达高的患者其生存时间短于该IncRNA表达低的患者(P=0.024)。因此针对该IncRNA的检测制剂也可以用于肝癌的预后判断。我们还针对该IncRNA基因的序列设计了用于RNA干扰的短发夹RNA表达载体，利用该载体在肝癌细胞系中抑制了该IncRNA的表达，且发现抑制该IncRNA表达可抑制肝癌细胞系的生长。因此针对该IncRNA的抑制制剂也具有肝癌基因治疗的潜在用途。
发明内容
本发明的目的是提供一个新克隆IncRNA基因的应用方法，具体是该长链非编码RNA基因在制备干扰和抑制剂上的应用方法；根据该基因序列，设计并合成了用于RNA干扰封闭该长链非编码RNA表达的短发夹结构RNA真核表达载体，利用该载体成功地在肝癌细胞系中抑制了该长链非编码RNA的表达。一个长链非编码RNA基因在制备干扰和抑制剂上的应用方法，根据该长链非编码RNA基因制备了用于干扰其表达，并导致抑制肝癌细胞生长的制剂；该基因转录本序列为序列表中SEQ ID NO:1-12所不的核苷酸序列中的任一条；或者是与序列表中SEQ ID NO:1-12任一条所示的 序列具有90%以上同源性的核苷酸序列；或者是与序列表中SEQ ID NO:1-12任一条所示的序列经硫代修饰或/和甲氧基修饰得到的核苷酸序列。所述的制剂是针对新克隆的长链非编码RNA基因设计的用于RNA干扰的短发夹RNA表达载体。所述的用于制备用于RNA干扰的短发夹RNA表达载体所需的4条干扰靶点序列如下:shRNA-Ι:GGACAAGGTCCAAGCTCTTACshRNA-2: GCAGTGCAGCAGTATCATTGCshRNA-3: GCAGCAGTATCATTGCTTAGCshRNA-4: GCAGCTCTGTGTGAGATTTGT。针对4条干扰靶点序列，以及载体，设计可形成发夹结构的寡核苷酸单链及其反向互补序列，它们退火后即可形成两端分别带限制性酶切位点粘性末端的DNA双链；具体序列如下:shRNA-ι:5’ -GATCCCC GGACAAGGTCCAAGCTCTTAC TTCAAGAGA GTAAGAGCTTGGACCTTGTCCTTTTTA-3’3 ' -GGG CCTGTTCCAGGTTCGAGAATG AAGTTCTCT CATTCTCGAACCTGGAACAGGAAAAATTCGA-5， shRNA-2:5’ -GATCCCC GCAGTGCAGCAGTATCATTGC TTCAAGAGA GCAATGATACTGCTGCACTGCTTTTTA-3’3’ -GGG CGTCACGTCGTCATAGTAACG AAGTTCTCT CGTTACTATGACGACGTGACGAAAAATTCGA-5， shRNA-3:5’ -GATCCCC GCAGCAGTATCATTGCTTAGC TTCAAGAGA GCTAAGCAATGATACTGCTGCTTTTTA-3’3， -GGG CGTCGTCATAGTAACGAATCG AAGTTCTCT CGATTCGTTACTATGACGACGAAAAATTCGA-5， shRNA-4:
5’ -GATCCCC GCAGCTCTGTGTGAGATTTGT TTCAAGAGA ACAAATCTCACACAGAGCTGCTTTTTA-3’3，-GGGCGTCGAGACACACTCTAAACA AAGTTCTCTTGTTTAGAGTGTGTCTCGACGAAAAATTCGA-5，。所述的用于RNA干扰的短发夹RNA表达载体的制备方法具体如下:I) shRNA 的设计首先根据新克隆的长链非编码RNA基因，寻找shRNA祀点，4条靶点序列如下:shRNA-Ι:GGACAAGGTCCAAGCTCTTACshRNA-2: GCAGTGCAGCAGTATCATTGCshRNA-3: GCAGCAGTATCATTGCTTAGCshRNA-4: GCAGCTCTGTGTGAGATTTGT ；以广泛使用的在人类基因组中没有任何靶点的Scramble序列作为阴性对照，其序列如下:Scramble:GACACGCGACTTGTACCAC2)针对这4条祀点序列，及Scramble序列，以及OligoEngine公司pSUPER载体，设计可形成发夹结构的寡核苷酸单链及其反向互补序列，它们退火后即可形成两端分别带限制性酶切位点BglII和HindIII粘性末端的DNA双链；具体需合成的各条寡核苷酸序列及它们配对退回后形成的DNA双链如下:shRNA-Ι:5 ' -GATCCCC GGACAAGGTCCAAGCTCTTACTTCAAGAGA GTAAGAGCTTGGACCTTGTCCTTTTTA-313’ -GGG CCTGTTCCAGGTTCGAGAATG AAGTTCTCT CATTCTCGAACCTGGAACAGGAAAAATTCGA-5， shRNA-2:5 ' -GATCCCC GCAGTGCAGCAGTATCATTGC TTCAAGAGA GCAATGATACTGCTGCACTGCTTTTTA-313’ -GGG CGTCACGTCGTCATAGTAACG AAGTTCTCT CGTTACTATGACGACGTGACGAAAAATTCGA-5， shRNA-3:`
5 ' -GATCCCC GCAGCAGTATCATTGCTTAGC TTCAAGAGA GCTAAGCAATGATACTGCTGCTTTTTA-3’3， -GGG CGTCGTCATAGTAACGAATCG AAGTTCTCT CGATTCGTTACTATGACGACGAAAAATTCGA-5， shRNA-4:5’ -GATCCCC GCAGCTCTGTGTGAGATTTGT TTCAAGAGA ACAAATCTCACACAGAGCTGCTTTTTA-3’3， -GGG CGTCGAGACACACTCTAAACA AAGTTCTCT TGTTTAGAGTGTGTCTCGACGAAAAATTCGA-5， Scramble5， -GATCCCC GACACGCGACTTGTACCAC TTCAAGAGA GTGGTACAAGTCGCGTGTCTTTTTA-313’ -GGGCTGTGCGCTGAACATGGTG AAGTTCTCT CACCATGTTCAGCGCACAG AAAAATTCGA-5’3) shRNA 载体构建
化学合成上述4个shRNA和对照的10条单链oligo序列，将合成好的oligo用oligo annealing buffer溶解成20 μ Μ,互补单链各取10 μ I混合；然后将oligo混合物在PCR仪中95°C加热5分钟，然后自然冷却至室温，形成双链oligo片段；用BglII和Hind III双酶切pSUPER质粒，回收3.1kb的载体片段，将退火后的粘性末端的DNA和酶切回收的载体按照3:1的物质的量的比例混合，用T4连接酶，16°C连接过夜；转化E.coil感受态，挑选转化子，菌落PCR以及测序鉴定，再用Cla I和EcoR I酶切构建好的PSUPER质粒，2%的琼脂糖DNA凝胶电泳，以空白pSUPER为空白对照，判断插入了目的片段的阳性克隆。本发明首次发现了一个新克隆的长链非编码RNA基因序列，并通过原位杂交、荧光实时定量PCR等方法证明该基因在肝癌组织中的特异性表达，为肝癌的辅助诊断和预后预测提供了强有力的分子生物学工具。也提供了一个具有肝癌潜基因治疗潜力和前景的RNA干扰载体，具有深远的意义和推广性。
图1为肝细胞癌和正常对照样品RNA-Seq结果及其在染色体上的位置图，表明通过RNA-seq我们发现了一个新基因；其中A =RNA-Seq发现的信号峰位于染色体llql3.1区段；B =RNA-Seq信号峰与邻近基因的位置关系；C:肝细胞癌(HCC)和正常对照(Normal)样品中RNA-Seq结果的对比，及克隆扩增该新基因全长序列所用引物设计示意图；图2为RT-PCR证实染色体llql3.1区段的RNA-Seq峰转录自同一个基因且剪接成多个转录本；
A:以肝癌组织cDNA为模板用引物IF和2R及IF和3R进行RT-PCR扩增，PCR产物的电泳结果；B:引物IF和2R及IF和3R扩增的PCR产物经TA_clone、测序后发现的不同转录本剪接方式；C:引物3F和4R及4F和5R进行RT-PCR扩增的结果；D:引物3F和4R及4F和5R扩增的PCR产物经TA-clone、测序发现的不同转录本剪接方式；图3为GeneRacer克隆新基因5’和3’全长序列；A:GeneRacer实验策略草图；B:3’ GeneRacer PCR产物电泳结果；C:5’和3’ GeneRacer测序结果得到的该基因5’端和3’端不同的剪接形式；图4为新克隆的基因及12种不同转录本，开放阅读框预测结果显示为长链非编码RNA ；A:通过测序获得的新克隆基因12种代表性转录本剪接形式；B:0RF Finder预测该新基因，未发现明显的开放阅读框，表明该基因编码长链非编码RNA ；图5为实时定量PCR检测该IncRNA在10例正常肝组织和36例肝癌组织中表达的结果；其中:N代表正常组织，T代表肝癌组织；图6为原位杂交检测新克隆IncRNA在正常肝组织(左)及肝癌组织中的表达(右)；表明该IncRNA在正常肝组织中不表达，而在肝癌组织中高表达；图7为新克隆的IncRNA生存曲线分析结果；根据新克隆IncRNA的表达水平将51例肝癌患者分组，IncRNA高表达患者组(28例患者，细虚线)生存时间短于IncRNA低表达患者(23例患者，粗实线)，表明新克隆的IncRNA可用于肝癌患者预后判断；图8为针对该新克隆的IncRNA设计并构建shRNA表达载体，干扰肝癌细胞系HepG2中该IncRNA的表达；表明设计的4个shRNA载体均可干扰H印G2细胞内该IncRNA的表达，四个shRNA载体混合转染细胞，效果更佳；图9为shRNAs干扰肝癌细胞H印G2中新克隆IncRNA的表达后细胞的生长曲线，表明干扰细胞内新克隆IncRNA的表达可以抑制HepG2细胞的生长。
具体实施例方式以下结合具体实施方式
进一步说明本发明，而非限制本发明。一、新的IncRNA基因克隆与分析1.材料与方法:1.1试剂及试剂盒琼脂糖(agrose)等常用生化试剂、胶回收试剂盒购自上海华舜生物工程有限公司，lkbladder DNA 分子量 Marker 购自 Invitrogen 公司 j[^RNeasy Mini Kit (Qiagen)抽提试剂盒抽提高质量的RNA, SuperScript III (Invitrogen)试剂盒将RNA逆转录成cDNA。1.2新一代测序技 术进行RNA测序人肝癌组织样品和正常肝组织样品提取总RNA后，过柱纯化，保留200nt以上的RNA ；然后富集mRNA，并用二价阳离子高温加热的方法将mRNA片断化；以mRNA短片段为模板；用六碱基随机引物反转录合成双链cDNA，经纯化、末端修复、加碱基A、加测序接头的步骤，经琼脂糖凝胶电泳回收片段，并进行PCR扩增完成测序文库的制备；构建好的文库经cBot扩增，用i I lumina soIexa进行测序；对illumina solexa进行RNA测序的结果进行分析:包括去除低质量、污染、接头的序列，将RNA测序结果与人类基因组参考序列进行比对和映射，在肝癌样品中检测到染色体llql3.1区域存在相邻的几个明显RNA-Seq信号峰，而在正常对照组织中却没有，且该染色体区域目前尚无已知基因登录，提示可能存在一个或多个未知的新基因。1.3克隆新基因序列 为了验证在11号染色体所检测到的各个RNA-Seq峰是否来自同一个RNA序列，我们针对各个RNA-Seq峰分别设计了正向(Forward, F)引物和反向(Revise, R)引物,利用相邻峰对应引物组合进行PCR扩增.各引物所在的大致位置和方向见图1C，对应的序列如下:IF: 5，-CCCTTGTTTAGCCTCTGCTG-3，，2F: 5，-CCTCTGTCACTGCCACAAAA-3，，2R: 5，-CATGTGGTGAGTGGCTGTG-3，，3F: 5，-TCACTTACCCCTGCGACTCT-3，，3R: 5 ’ -CATCACAGGGTGTGTTTTGC-3’，4F: 5 ’ -GCCCTGCTCTATCAGCAAAC-3，，4R: 5 ’ -GCCTGCTGAGTTTGCTGATA-3’，5R: 5 ’ -CCCAAACCAAGCTGACAAAT-3，。依次对应序列表中SEQ ID NO: 13-20。
利用GeneRacer试剂盒(Invitrogen)扩增未知RNA的5’端及3’端全长序列,针对本项目RNA序列用于GeneRacer反应的基因特异性引物(Gene Specific Primer, GSP)大致位置和方向见图1C，序列如下:Racer Rl:5’ -GCAGAGGCTAAACAAGGGGGTCCTG-3，，序列表中 SEQ ID NO:21 ；Racer F5:5’ -CACTGAATGCCCCACGTCAAAGAAA-3，；序列表中 SEQ ID NO:22 ；RT-PCR 或者 GeneRacer PCR 的产物均用 TA clone 试剂盒(Invitrogen)进行连接、转化，挑选阳性克隆用Sanger法测序，以获得插入片段的序列。1.4序列分析及生物信息学预测所用软件新一代测序技术进行RNA-Seq发现的新基因，我们用传统的Sanger法测序进行了验证，并用Sanger法测序克隆了该基因的全长序列，Sanger法测序所获得的序列用DNAStar软件(DNASTAR Inc.)进行组装和校对；新克隆基因潜在开放阅读框(Open Reading Frame, 0RF)米用美国国立生物信息研究所(National Center forBiotechnology Information, NCBI)开发的在线分析软件 ORF Finder(www.ncb1.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)进行预测；潜在开放阅读框编码的多肽序列输入Pfam(http://pfam.sanger.ac.uk/)数据库与已知蛋白结构域是否有同源性。2 结果
2.1RNA-Seq在染色体llql3.1区域发现多个相邻的RNA信号峰通过新一代测序技术对肝细胞癌活检组织及正常对照样品中的RNA进行高通量测序(RNA-Seq)，并以人类基因组参考序列(Build37.3，Hgl9)为模版对RNA-Seq序列进行组装，我们发现肝癌组织中在染色体llql3.1区域(图1A)距11号染色体短臂末端物理距离65.6Mb附近(图1B)存在6个相邻的较明显的RNA信号峰(图1C)，除第5个峰只有50个左右测序读长(reads)支持外,其余每个峰都有超过100个reads支持,最高达到近400个reads支持(图1C下半部分)，而同一染色体区域正常对照样品中则没有或仅有痕量的reads (图1C上半部分)，表明在所检测的肝癌组织中这一染色体区段转录出了一条或多条RNA序列，且转录水平较高；这些RNA信号峰所在的染色体部位没有已知基因登录(图1B)。为了验证这几个RNA-Seq峰到底是来自几个独立的RNA序列还是来自同一条RNA序列，我们针对各个RNA-Seq峰分别设计了正向和反向引物(图1C)，然后以肝癌组织cDNA为模板，用相邻峰对应的引物配对进行PCR扩增。2.2RT-PCR证实llql3.1区域多个RNA-Seq峰转录自同一个基因以肝癌组织cDNA为模版，用引物IF和2R进行PCR扩增，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳发现扩增出多条目的带，引物IF和3R也同样得到了多条带(图2A).将目的条带分别割胶纯化、TA克隆，挑选阳性克隆进行测序，发现引物IF和2R获得的PCR产物覆盖了第1、2和3个RNA-Seq峰，且存在至少2种转录后剪接形式，同样的，引物IF和3R扩增的PCR产物覆盖了第广4个RNA-Seq峰，存在至少3种转录后剪接形式(图2B).
用引物3F和4R、4F和5R等组合PCR扩增也得到了类似的结果(图2C和图2D)，证实染色体llql3.1区段测得的这几个相邻的RNA-Seq峰实际上转录自同一个基因，它们对应的DNA片段为同一个基因的不同外显子，且由PCR和测序结果可知该基因转录的RNA存在多种剪接方式.利用引物IF和5R我们扩增了该基因更多种类型的转录本。由于PCR扩增得到的是DNA双链，仅从测序结果我们还无法判断该RNA的实际方向，也还没得到该RNA5’和3’端全长序列，因此我们进一步利用GeneRacer试剂盒扩增该RNA的5’和3’端全长。2.3GeneRacer 克隆 RNA 全长序列GeneRacer所用引物GeneRacer试剂盒(Invitrogen)提供见图3A,首先用烟草酸性焦磷酸酶(Tobacco Acid Pyrophosphatase,TAP)去除RNA5’端帽子(cap)结构，然后在去除帽子结构的RNA5’端用RNA连接酶(RNA Iigase)连接一段特异性RNA接头序列(该接头序列由GeneRacer试剂盒(Invitrogen)提供图3A中左端黑色粗线条部分)，接下来用5’端增加了另一段特异性接头的oligo-dT为引物该接头序列由GeneRacer试剂盒(Invitrogen)提供,对RNA进行逆转录,获得cDNA的第一条链,此时cDNA就在两头都分别加上了两段特异性的接头序列。针对这两端的接头序列，GeneRacer试剂盒(Invitrogen)分别提供了 5’和3’端的GeneRacer公共引物，再在我们感兴趣的目的基因序列中设计基因特异性引物(gene specific primer, GSP,即前述的Racer Rl和Racer F5)与公共的5’或3’ GeneRacer引物组合进行PCR扩增就可以得到我们感兴趣的基因5’和3’端全长序列。将肝癌组织RNA用GeneRacer试剂盒逆转录的cDNA(两头已加接头)为模板，利用图1C中设计的2条基因特异性GeneRacer引物Racer Rl和Racer F5与试剂盒中的GeneRacer3’公共引物进行PCR扩增(图3B)，结果Racer Rl与GeneRacer3’公共引物未能扩出目的条带，而Racer F5与GeneRacer3’引物则扩出了非常清楚的目的条带,表明RacerF5靠近目的基因的3’末端，其对应的图1C中第6个RNA-Seq峰就是该新基因的第6号外显子.利用GeneRacer试剂盒中提供的Hela细胞cDNA为模板，Racer F5与GeneRacer3’引物也未扩出特异性条带，表明该基因在Hela细胞中不表达或者表达很弱。图3B中RacerF5与GeneRacerf’公共引物扩增产物电泳结果除了有一条很强的目的条带外，在该条带上方还有两条较弱的条带(图中 箭头所示)，表明该基因3’末端可能同样存在可变剪接。将PCR产物TA clone，Sanger法测序，我们获得了该新基因3’端三种不同转录本的序列(图3C右边部分).我们接下来用Racer Rl与GeneRacerf’公共引物进行扩增，获得了该新基因5’端6种不同转录本的序列(图3C左边部分).
2.4新克隆的基因有多个转录本且没有明显的开放阅读框我们在其他肝癌组织样本中进一步大量PCR，TA克隆和测序分析，得到了该基因更多的转录本序列，图4A是在肝癌组织中表达频率比较高的12种转录本剪接模式。将该基因不同的转录本序列输入NCBI的ORF finder软件进行开放阅读框预测，发现该基因没有明显的开放阅读框(所有潜在的开放阅读框均小于500bp)。将所有潜在ORF编码翻译为多肽序列与Pfam数据库中已知的蛋白或者结构域进行比对，也未发现有同源性，表明该基因可能编码一个长链非编码RNA (long non-coding RNA, IncRNA)。二、荧光实时定量PCR1.材料与方法:10例正常肝脏组织和36例肝癌组织抽提总RNA，2 μ g RNA经逆转录成cDNA后，进行荧光实时定量PCR。新克隆IncRNA引物为5’ -GTCCGTCAGTCCCTCACCT-3’(序列表中SEQIDNO:23)和 5’ -ATACAGCCCCAGACCCAAAC-3’(序列表中 SEQ ID NO:24)。用于对照的18S 引物为 5’ -TCTTAGCTGAGTGTCCCGCG-3’(序列表中 SEQ ID NO:25)和 5’ -ATCATGGCCTCAGTTCCGAA-3’(序列表中 SEQ ID NO:26),荧光实时定量PCR反应体系
权利要求
1.一个长链非编码RNA基因在制备干扰和抑制剂上的应用方法，其特征在于，根据该长链非编码RNA基因制备了用于干扰其表达，并导致抑制肝癌细胞生长的制剂；该基因转录本序列为序列表中SEQ ID NO:1-12所示的核苷酸序列中的任一条；或者是与序列表中SEQ ID NO:1-12任一条所示的序列具有90%以上同源性的核苷酸序列；或者是与序列表中SEQ ID NO:1-12任一条所示的序列经硫代修饰或/和甲氧基修饰得到的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的应用方法，其特征在于，所述的制剂是针对该长链非编码RNA基因设计的用于RNA干扰的短发夹RNA表达载体。
3.根据权利要求1或2所述的应用方法，其特征在于，所述的用于制备用于RNA干扰的短发夹RNA表达载体所需的4条 干扰靶点序列如下:shRNA-1: GGACAAGGTCCAAGCTCTTACshRNA-2: GCAGTGCAGCAGTATCATTGCshRNA-3:GCAGCAGTATCATTGCTTAGCshRNA-4:GCAGCTCTGTGTGAGATTTGT。
4.根据权利要求3所述的应用方法，其特征在于， 针对4条干扰靶点序列，以及载体，设计可形成发夹结构的寡核苷酸单链及其反向互补序列，它们退火后即可形成两端分别带限制性酶切位点粘性末端的DNA双链；具体序列如下:shRNA-Ι:5’-GATCCCC GGACAAGGTCCAAGCTCTTAC TTCAAGAGA GTAAGAGCTTGGACCTTGTCC TTTTTA-3，3’ -GGG CCTGTTCCAGGTTCGAGAATG AAGTTCTCT CATTCTCGAACCTGGAACAGGAAAAATTCGA-5， shRNA-2:5’-GATCCCC GCAGTGCAGCAGTATCATTGC TTCAAGAGA GCAATGATACTGCTGCACTGC TTTTTA-3’3 ' -GGG CGTCACGTCGTCATAGTAACG AAGTTCTCT CGTTACTATGACGACGTGACGAAAAATTCGA-5， shRNA-3:5’-GATCCCC GCAGCAGTATCATTGCTTAGC TTCAAGAGA GCTAAGCAATGATACTGCTGC TTTTTA-3，3’ -GGG CGTCGTCATAGTAACGAATCG AAGTTCTCT CGATTCGTTACTATGACGACGAAAAATTCGA-5， shRNA-4:5’-GATCCCC GCAGCTCTGTGTGAGATTTGT TTCAAGAGA ACAAATCTCACACAGAGCTGC TTTTTA-3’3’ -GGGCGTCGAGACACACTCTAAACA AAGTTCTCTT GTTTAGAGT GT GTCTCGACGAAAAATTCGA-5，。
5.根据权利要求2所述的应用方法，其特征在于，所述的用于RNA干扰的短发夹RNA表达载体的制备方法具体如下: I) shRNA的设计 首先根据新克隆的长链非编码RNA基因，寻找shRNA靶点，4条靶点序列如下:shRNA-Ι:GGACAAGGTCCAAGCTCTTACshRNA-2:GCAGTGCAGCAGTATCATTGCshRNA-3:GCAGCAGTATCATTGCTTAGCshRNA-4:GCAGCTCTGTGTGAGATTTGT ； 以广泛使用的在人类基因组中没有任何靶点的Scramble序列作为阴性对照，其序列如下:Scramble:GACACGCGACTTGTACCAC 2)针对这4条祀点序列，及Scramble序列，以及OligoEngine公司pSUPER载体,设计可形成发夹结构的寡核苷酸单链及其反向互补序列，它们退火后即可形成两端分别带限制性酶切位点BglII和HindIII粘性末端的DNA双链；具体需合成的各条寡核苷酸序列及它们配对退回后形成的DNA双链如下:
6.一种制备权利要求2所述的载体的干扰靶点序列，其特征在于，序列如下: shRNA-Ι:GGACAAGGTCCAAGCTCTTACshRNA-2: GCAGTGCAGCAGTATCATTGCshRNA-3: GCAGCAGTATCATTGCTTAGCshRNA-4:GCAGCTCTGTGTGAGATTTGT。
7.一种制备权利要求2所述的载体的发夹结构的寡核苷酸单链及其反向互补序列，其特征在于，序列如下:shRNA-Ι:
全文摘要
本发明涉及一个新克隆的长链非编码RNA基因的应用方法，具体是该长链非编码RNA基因在制备干扰和抑制剂上的应用方法；根据该基因序列，设计并合成了用于RNA干扰封闭该长链非编码RNA表达的短发夹结构RNA真核表达载体，利用该载体成功地在肝癌细胞系中抑制了该长链非编码RNA的表达。
文档编号C12N15/11GK103160537SQ20131005980
公开日2013年6月19日 申请日期2013年2月26日 优先权日2013年2月26日
发明者李桂源, 熊炜, 曾朝阳, 李小玲, 向波, 李夏雨, 黄宏斌, 廖前进, 张文玲, 范松青, 石磊, 周鸣, 马健, 向娟娟, 彭淑平, 周艳宏 申请人:中南大学