杀虫基因及其用途的制作方法

专利名称：杀虫基因及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种杀虫基因及其用途，特别是涉及一种改造的PIC2-01杀虫基因及其用途。
背景技术：
植物虫害是导致农作物损失的主要因素，给农民造成重大的经济损失，甚至影响到当地人口的生存状况。为了防治植物虫害，人们通常使用广谱化学杀虫剂和生物杀虫制齐U，但二者在实际应用中都具有局限性:化学杀虫剂会带来环境污染的问题，并导致抗药性昆虫的出现；而生物杀虫制剂在环境中容易降解，在生产上需要重复施用，大大增加了生产成本。为了解决化学杀虫剂和生物杀虫制剂在实际应用中的局限性，科学家们经过研究发现将编码杀虫蛋白的抗虫基因转入植物中，可获得一些抗虫转基因植物以防治植物虫害。PIC2杀虫蛋白是众多杀虫蛋白中的一种，是不溶性伴孢结晶蛋白。PIC2蛋白被昆虫摄入进入中肠，毒蛋白原毒素被溶解在昆虫中肠的碱性环境下。蛋白N-和C-末端被碱性蛋白酶消化，将原毒素转变成活性片段；活性片段和昆虫中肠上皮细胞膜上表面上受体结合，插入肠膜，导致细胞膜出现穿孔病灶，破坏细胞膜内外的渗透压变化及PH平衡等，扰乱昆虫的消化过程，最终导致其死亡。玉米和水稻是世界上分布广泛的粮食作物，每年因植物虫害造成的粮食损失巨大，例如小菜蛾、玉米螟、棉铃虫、东方黏虫或二化螟等。已证明PIC2蛋白可以抵挡多种鳞翅目昆虫害虫(如玉米螟、棉铃虫等)的侵害，且目前鲜有依据植物的偏好密码子对PIC2杀虫蛋白的氨基酸和/或核苷酸序列进行改造的研究，尤其是针对单子叶植物(如玉米)以提高其在植物中的表达水平和效果。

发明内容
本发明的目的是提供一种杀虫基因及其用途，其是依据玉米的偏好密码子而进行的优化改造，使得PIC2-01杀虫蛋白在植物中(尤其为玉米和水稻)具有较高的表达量和毒力。为实现上述目的，本发明提供了一种杀虫基因，其核苷酸序列包括:(a)具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；或(b)与(a)的核苷酸序列同类编码，且不为SEQ ID NO: 2 ;或(c)在严格条件下与(a)或(b)限定的核苷酸序列杂交且编码具有杀虫活性的蛋白质的核苷酸序列。 所述严格条件可为在6 X SSC (柠檬酸钠)、0.5%SDS (十二烷基硫酸钠)溶液中，在65°C下杂交，然后用2XSSC、0.1%SDS和I X SSC,0.1%SDS各洗膜I次。为实现上述目的，本发明还提供了一种表达盒，包含在有效连接的调控序列调控下的所述杀虫基因。
为实现上述目的，本发明还提供了一种包含所述杀虫基因或所述表达盒的重组载体。为实现上述目的，本发明还提供了一种包含所述杀虫基因或所述表达盒的转基因宿主生物，包括植物细胞、动物细胞、细菌、酵母、杆状病毒、线虫或藻类。进一步地，所述植物为玉米、大豆、棉花、水稻或小麦。为实现上述目的，本发明还提供了一种产生杀虫蛋白质的方法，包括:获得所述转基因宿主生物的细胞；在允许产生杀虫蛋白质的条件下培养所述转基因宿主生物的细胞；回收所述杀虫蛋白质。为实现上述目的，本发明还提供了一种用于增加昆虫靶范围的方法，包括:将所述杀虫基因编码的杀虫蛋白质或所述表达盒编码的杀虫蛋白质在植物中与至少一种不同于所述杀虫基因编码的杀虫蛋白质或所述表达盒编码的杀虫蛋白质的第二种杀虫核苷酸一起表达。进一步地，所述第二种杀虫核苷酸可以编码Cry类杀虫蛋白质、Vip类杀虫蛋白质、蛋白酶抑制剂、凝集素、α-淀粉酶或过氧化物酶。可选择地所述第二种杀虫核苷酸为抑制目标昆虫害虫中重要基因的dsRNA。在本发明中，PIC2-01杀虫蛋白在一种转基因植物中的表达可以伴随着一个或多个Cry类杀虫蛋白质和/或Vip类杀虫蛋白质的表达。这种超过一种的杀虫毒素在同一株转基因植物中共同表达 可以通过遗传工程使植物包含并表达所需的基因来实现。另外，一种植物(第I亲本)可以通过遗传工程操作表达PIC2-01杀虫蛋白，第二种植物(第2亲本)可以通过遗传工程操作表达Cry类杀虫蛋白质和/或Vip类杀虫蛋白质。通过第I亲本和第2亲本杂交获得表达引入第I亲本和第2亲本的所有基因的后代植物。RNA干扰(RNA interference, RNAi)是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA(double-stranded RNA, dsRNA)诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。因此可以使用RNAi技术特异性剔除或关闭特定基因的表达。为实现上述目的，本发明还提供了一种产生抗虫植物的方法，包括:将所述杀虫基因或所述表达盒或所述重组载体导入植物。优选地，所述植物为玉米、大豆、棉花、水稻或小麦。为实现上述目的，本发明还提供了一种用于保护植物免受由昆虫害虫引起的损伤的方法，包括:将所述杀虫基因或所述表达盒或所述重组载体导入植物，使导入后的植物产生足够保护其免受昆虫害虫侵害量的杀虫蛋白质。优选地，所述植物为玉米、大豆、棉花、水稻或小麦。将所述的杀虫基因或所述的表达盒或所述的重组载体导入植物，在本发明中为将外源DNA导入植物细胞，常规转化方法包括但不限于，农杆菌介导的转化、微量发射轰击、直接将DNA摄入原生质体、电穿孔或晶须硅介导的DNA导入。为实现上述目的，本发明还提供了一种控制昆虫害虫的方法，包括:使昆虫害虫与抑制量的由所述杀虫基因编码的昆虫抑制性蛋白接触。优选地，所述昆虫害虫是鳞翅目昆虫害虫。本发明中所述的植物、植物组织或植物细胞的基因组，是指植物、植物组织或植物细胞内的任何遗传物质，且包括细胞核和质体和线粒体基因组。本发明中所述的多核苷酸和/或核苷酸形成完整“基因”，在所需宿主细胞中编码蛋白质或多肽。本领域技术人员很容易认识到，可以将本发明的多核苷酸和/或核苷酸置于目的宿主中的调控序列控制下。本领域技术人员所熟知的，DNA典型的以双链形式存在。在这种排列中，一条链与另一条链互补，反之亦然。由于DNA在植物中复制产生了 DNA的其它互补链。这样，本发明包括对序列表中示例的多核苷酸及其互补链的使用。本领域常使用的“编码链”指与反义链结合的链。为了在体内表达蛋白质，典型将DNA的一条链转录为一条mRNA的互补链，它作为模板翻译出蛋白质。mRNA实际上是从DNA的“反义”链转录的。“有义”或“编码”链有一系列密码子(密码子是三个核苷酸，一次读三个可以产生特定氨基酸)，其可作为开放阅读框(ORF)阅读来形成目的蛋白质或肽。本发明还包括与示例的DNA有相当功能的RNA和PNA (肽核酸)。本发明中核酸分子或其片段在严格条件下与本发明杀虫基因杂交。任何常规的核酸杂交或扩增方法都可以用于鉴定本发明杀虫基因的存在。核酸分子或其片段在一定情况下能够与其他核酸分子进行特异性杂交。本发明中，如果两个核酸分子能形成反平行的双链核酸结构，就可以说这两个核酸分子彼此间能够进行特异性杂交。如果两个核酸分子显示出完全的互补性，则称其中一个核酸分子是另一个核酸分子的“互补物”。本发明中，当一个核酸分子的每一个核苷酸都与另一个核酸分子的对应核苷酸互补时，则称这两个核酸分子显示出“完全互补性”。如果两个核酸分子能够以足够的稳定性相互杂交从而使它们在至少常规的“低度严格”条件下退火且彼此结合，则称这两个核酸分子为“最低程度互补”。类似地，如果两个核酸分子能够以足够的稳定性相互杂交从而使它们在常规的“高度严格”条件下退火且彼此结合，则称这两个核酸分子具 有“互补性”。从完全互补性中偏离是可以允许的，只要这种偏离不完全阻止两个分子形成双链结构。为了使一个核酸分子能够作为引物或探针，仅需保证其在序列上具有充分的互补性，以使得在所采用的特定溶剂和盐浓度下能形成稳定的双链结构。本发明中，基本同源的序列是一段核酸分子，该核酸分子在高度严格条件下能够和相匹配的另一段核酸分子的互补链发生特异性杂交。促进DNA杂交的适合的严格条件，例如，大约在45°C条件下用6.0X氯化钠/柠檬酸钠(SSC)处理，然后在50°C条件下用
2.0XSSC洗涤，这些条件对本领域技术人员是公知的。例如，在洗涤步骤中的盐浓度可以选自低度严格条件的约2.0父55(:、501:到高度严格条件的约0.2\55(:、501:。此外，洗涤步骤中的温度条件可以从低度严格条件的室温约22°C，升高到高度严格条件的约65°C。温度条件和盐浓度可以都发生改变，也可以其中一个保持不变而另一个变量发生改变。优选地，本发明所述严格条件可为在6XSSC、0.5%SDS溶液中，在65°C下与SEQ ID NO:1发生特异性杂交，然后用 2XSSC、0.1%SDS 和 I X SSC,0.1%SDS 各洗膜 I 次。因此，具有抗虫活性并在严格条件下与本发明序列I杂交的序列包括在本发明中。这些序列与本发明序列至少大约40%-50%同源，大约60%、65%或70%同源，甚至至少大约 75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多同源。即序列同一性的范围分布在至少大约40%-50%、大约60%、65%或70%同源，甚至至少大约75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更大的序列同源性。
本发明中所述的DNA分子或蛋白序列的“片段”或“截短”是指涉及的原始DNA或蛋白序列(核苷酸或氨基酸)的一部分或其人工改造形式(例如适合植物表达的序列)，前述序列的长度可存在变化，但长度足以确保(编码)蛋白质为昆虫毒素。
当核酸序列编码的多肽与参照核酸序列编码的多肽有相同的氨基酸序列时，该核酸序列与参照核酸序列是本发明所述的“同类编码”。本发明中所述调控序列包括但不限于启动子、转运肽、终止子，增强子，前导序列，内含子以及其它可操作地连接到所述杀虫基因的调节序列。所述启动子为植物中可表达的启动子，所述的“植物中可表达的启动子”是指确保与其连接的编码序列在植物细胞内进行表达的启动子。植物中可表达的启动子可为组成型启动子。指导植物内组成型表达的启动子的示例包括但不限于，来源于花椰菜花叶病毒的35S启动子、ubi启动子、水稻G0S2基因的启动子等。备选地，植物中可表达的启动子可为组织特异的启动子，即该启动子在植物的一些组织内如在绿色组织中指导编码序列的表达水平高于植物的其他组织(可通过常规RNA试验进行测定)，如PEP羧化酶启动子。备选地，植物中可表达的启动子可为创伤诱导启动子。创伤诱导启动子或指导创伤诱导的表达模式的启动子是指当植物经受机械或由昆虫啃食引起的创伤时，启动子调控下的编码序列的表达较正常生长条件下有显著提高。创伤诱导启动子的示例包括但不限于，马铃薯和西红柿的蛋白酶抑制基因(Pin I和pin II )和玉米蛋白酶抑制基因(MPI)的启动子。所述转运肽(又称分泌信号序列或导向序列)是指导转基因产物到特定的细胞器或细胞区室，对受体蛋白质来说，所述转运肽可以是异源的，例如，利用编码叶绿体转运肽序列靶向叶绿体，或者利用‘KDEL’保留序列靶向内质网，或者利用大麦植物凝集素基因的CTPP靶向液泡。所述前导序列包含但不限于，小RNA病毒前导序列，如EMCV前导序列(脑心肌炎病毒5’非编码区)；马铃薯Y病毒组前导序列,如MDMV (玉米矮缩花叶病毒)前导序列；人类免疫球蛋白质重链结合蛋白质(BiP);苜蓿花叶病毒的外壳蛋白质mRNA的不翻译前导序列(AMV RNA4);烟草花叶病毒(TMV)前导序列。所述增强子包含但不限于，花椰菜花叶病毒(CaMV)增强子、玄参花叶病毒(FMV)增强子、康乃馨风化环病毒(CERV)增强子、木薯脉花叶病毒(CsVMV)增强子、紫茉莉花叶病毒(MMV)增强子、夜香树黄化曲叶病毒(CmYLCV)增强子、木尔坦棉花曲叶病毒(CLCuMV)、鸭跖草黄斑驳病毒(CoYMV)和花生褪绿线条花叶病毒(PCLSV)增强子。对于单子叶植物应用而言，所述内含子包含但不限于，玉米hsp70内含子、玉米泛素内含子、Adh内含子1、蔗糖合酶内含子或水稻Actl内含子。对于双子叶植物应用而言，所述内含子包含但不限于，CAT-1内含子、pKANNIBAL内含子、PIV2内含子和“超级泛素”内含子。所述终止子可以为在植物中起作用的适合多聚腺苷酸化信号序列，包括但不限于，来源于农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)胭脂碱合成酶(NOS)基因的多聚腺苷酸化信号序列、来源于蛋白酶抑制剂II (pin II )基因的多聚腺苷酸化信号序列、来源于豌豆ssRUBISCO E9基因的多聚腺苷酸化信号序列和来源于α-微管蛋白(a-tubulin)基因的多聚腺苷酸化信号序列。本发明中所述“有效连接”表示核酸序列的联结，所述联结使得一条序列可提供对相连序列来说需要的功能。在本发明中所述“有效连接”可以为将启动子与感兴趣的序列相连，使得该感兴趣的序列的转录受到该启动子控制和调控。当感兴趣的序列编码蛋白并且想要获得该蛋白的表达时“有效连接”表示:启动子与所述序列相连，相连的方式使得得到的转录物高效翻译。如果启动子与编码序列的连接是转录物融合并且想要实现编码的蛋白的表达时，制造这样的连接，使得得到的转录物中第一翻译起始密码子是编码序列的起始密码子。备选地，如果启动子与编码序列的连接是翻译融合并且想要实现编码的蛋白的表达时，制造这样的连接，使得5’非翻译序列中含有的第一翻译起始密码子与启动子相连结，并且连接方式使得得到的翻译产物与编码想要的蛋白的翻译开放读码框的关系是符合读码框的。可以“有效连接”的核酸序列包括但不限于:提供基因表达功能的序列(即基因表达元件，例如启动子、5’非翻译区域、内含子、蛋白编码区域、3’非翻译区域、聚腺苷化位点和/或转录终止子)、提供DNA转移和/或整合功能的序列(即T-DNA边界序列、位点特异性重组酶识别位点、整合酶识别位点)、提供选择性功能的序列(即抗生素抗性标记物、生物合成基因)、提供可计分标记物功能的序列、体外或体内协助序列操作的序列(即多接头序列、位点特异性重组序列)和提供复制功能的序列(即细菌的复制起点、自主复制序列、着丝粒序列)。本发明中所述的“杀虫”是指对农作物害虫是有毒的。更具体地，目标昆虫是害虫，例如，但不限于，大部分鳞翅目害虫，如玉米螟、棉铃虫、东方黏虫、二化螟或大螟等。本发明中，所述杀虫基因为PIC2-01基因序列，如序列表中SEQ ID N0:1所示。所述杀虫基因为用于植物，特别是玉米转化的DNA序列，除了包含由PIC2-01基因序列编码的蛋白质的编码区外，也可包含其他元件，例如编码转运肽的编码区、编码选择性标记的蛋白质或赋予除草剂抗性的蛋白质的编码区。本发明中PIC2-01基因序列对危害玉米的大多数鳞翅目害虫具有毒性。本发明中的植物，特别是玉米，在其基因组中含有外源DNA，所述外源DNA包含PIC2-01基因序列，通过表达抑制量的该蛋白而保护其免受害虫的威胁。抑制量是指致死的或亚致死的剂量。同时，植物在形态上应是正常的，且可在常规方法下培养以用于产物的消耗和/或生成。此外，该植物可基本消除对化学或生物杀虫剂的需要(所述化学或生物杀虫剂为针对由PIC2-01基因序列编码的蛋白质所靶向的昆虫的杀虫剂)。植物材料中杀虫晶体蛋白(ICP)的表达水平可通过本领域内所描述的多种方法进行检测，例如通过应用特异引物对组织内产生的编码杀虫蛋白质的mRNA进行定量，或直接特异性检测产生的杀虫蛋白质的量。可以应用不同的试验测定植物中ICP的杀虫效果。本发明中目标昆虫主要为鳞翅目害虫，更具体地为亚洲玉米螟或二化螟等。此外，包含本发明杀虫基因(PIC2-01基因)序列的表达盒在植物中还可以与至少一种编码除草剂抗性基因的蛋白质一起表达，所述除草剂抗性基因包括但不限于，草胺膦抗性基因(如bar基因、pat基因)、苯敌草抗性基因(如pmph基因)、草甘膦抗性基因(如EPSPS基因)、溴苯腈(toomoxynil)抗性基因、磺酰脲抗性基因、对除草剂茅草枯的抗性基因、对氨腈的抗性基因或谷氨酰胺合成酶抑制剂(如PPT)的抗性基因，从而获得既具有高杀虫活性、又具有除草剂抗 性的转基因植物。本发明提供了一种杀虫基因及其用途，具有以下优点:
1、表达量高。本发明杀虫基因PIC2-01为依据玉米的偏好密码子对杀虫蛋白质PIC2-01进行的优化，同时去除了使mRNA不稳定的序列、PolyA加尾信号和内含子剪切类似位点，且提高了 GC含量，完全符合玉米基因的特性，使得本发明杀虫基因特别适合在单子叶植物中表达，尤其是玉米和水稻，其表达量高且稳定性好。2、毒力强。本发明杀虫基因PIC2-01为依据玉米的偏好密码子对杀虫蛋白质PIC2-01进行的优化，同时去除了使mRNA不稳定的序列、PoIyA加尾信号和内含子剪切类似位点，且提高了 GC含量，使得本发明杀虫基因不仅特别适合在单子叶植物中表达，尤其是玉米和水稻，而且还显著增强了 PIC2-01杀虫蛋白对昆虫害虫的毒力，尤其是鳞翅目昆虫害虫。3、杀虫谱广。本发·明杀虫蛋白质PIC2-01蛋白不仅对玉米螟等鳞翅目害虫表现出较高的抗性，而且首次报道了本发明杀虫蛋白质PIC2-01蛋白对二化螟也具有较高的活性，因此在植物上应用前景广阔。下面通过附图和实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。


图1为本发明杀虫基因及其用途的含有PIC2-01核苷酸序列的重组克隆载体DBNOlBa-T构建流程图；图2为本发明杀虫基因及其用途的含有PIC2-01核苷酸序列的重组表达载体DBN100056构建流程图；图3为本发明杀虫基因及其用途的含有天然序列的重组表达载体DBN100056N构建流程图；图4为本发明杀虫基因及其用途的转基因玉米植株的PIC2杀虫蛋白质的mRNA相对含量图；图5为本发明杀虫基因及其用途的转基因玉米植株接种亚洲玉米螟的抗虫效果图；图6为本发明杀虫基因及其用途的转基因水稻植株的PIC2杀虫蛋白质的mRNA相对含量图；图7为本发明杀虫基因及其用途的转基因水稻植株接种二化螟的抗虫效果图。
具体实施例方式下面通过具体实施例进一步说明本发明杀虫基因及其用途的技术方案。第一实施例、PIC2基因的选择、优化改造和合成1、选择用于优化的PIC2-01基因序列选择张杰等人于2003年登记的序列号为AAK63251.1的天然CrylBa3基因的氨基酸序列为本发明杀虫基因PIC2-01优化的依据，天然CrylBa3基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:2所示，天然CrylBa3基因的氨基酸序列如序列表中SEQ ID N0:3所示。2、优化上述PIC2-01氨基酸序列保持上述PIC2-01氨基酸序列(1228个氨基酸)不改变，对编码相应于上述PIC2-01氨基酸序列(1228个氨基酸)的核苷酸序列(3687个核苷酸)依据玉米偏好性密码子进行优化改造。密码子优化改造的策略主要包括:依据玉米的偏好密码子、不稳定序列的改造、G+C含量的提高等。天然PIC2基因的G+C含量较低，A+T含量很高，一方面，如果直接将天然基因序列导入植物基因组中可能会被误认为是植物基因调控序列，同时在这些天然基因中会出现A+T富含区域，类似于基因启动子中的TATA盒，这些区域则会导致基因的异常转录；另一方面，在转录的mRNA中聚腺苷酸化信号序列(AAUAAA)、与mRNA剪接相关的小RNA互补序列会导致 RNA不稳定。因此，优化后的PIC2-01基因序列除了有较高的G+C含量夕卜，还改变DNA和转录成mRNA中出现的不稳定结构,从而保证蛋白的正常翻译；再一方面，完全应用玉米的偏好密码子改造天然PIC2核苷酸序列，排除酶切位点和一些序列的修饰，玉米的密码子使用偏好性可参考 http://www.kazusa.0r.jp/codon/cg1-bin/showcodon.cgi species=381124。基于以上优化策略，得到PIC2-01核苷酸序列，G+C含量从原来的39%提高到55%，使其更加符合玉米基因的特性。所述PIC2-01核苷酸序列共含有3687个核苷酸，编码1228个氨基酸，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:1所示。3、合成上述PIC2-01核苷酸序列所述PIC2-01核苷酸序列(如序列表中SEQ ID NO:1所示)由南京金斯瑞生物科技有限公司合成；合成的所述PIC2-01基因序列(SEQ ID NO:1)的5’端还连接有SphI酶切位点，所述PIC2-01基因序列(SEQ ID NO:1)的3’端还连接有SpeI酶切位点。第二实施例、重组表达载体的构建及重组表达载体转化农杆菌1、构建含有PIC2-01核苷酸序列的重组克隆载体DBNOlBa-T将合成的PIC2-01核苷酸序列连入克隆载体pGEM-T(Promega，Madison, USA, CAT:A3600)上，操作步骤按Promega公司产品pGEM_T载体说明书进行，得到重组克隆载体DBNOlBa-T，其构建流程如图1所示(其中，Amp表示氨苄青霉素抗性基因；fl表示噬菌体fl的复制起点；LacZ为LacZ起始密码子；SP6为SP6RNA聚合酶启动子；T7为T7RNA聚合酶启动子；PIC2_01为PIC2-01核苷酸序列(SEQ ID NO:1) ;MCS为多克隆位点)。然后将重组克隆载体DBNOlBa-T用热激方法转化大肠杆菌Tl感受态细胞(Transgen, Beijing, China, CAT:CD501)，其热激条件为:50 μ I大肠杆菌Tl感受态细胞、10 μ I质粒DNA (重组克隆载体DBNOlBa-T)，42°C水浴30秒；37°C水浴I小时(IOOrpm转速下摇床摇动)，在表面涂有IPTG (异丙基硫代-β -D-半乳糖苷)和X-gal (5-溴-4-氯-3-Π引哚-β-D-半乳糖苷)的氨苄青霉素(100毫克/升)的LB平板(胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaC110g/L，琼脂15g/L，用NaOH调pH至7.5)上生长过夜。挑取白色菌落，在LB液体培养基(胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaC110g/L，氨苄青霉素100mg/L，用NaOH调pH至7.5)中于温度37 °C条件下培养过夜。碱法提取其质粒:将菌液在12000rpm转速下离心lmin，去上清液，沉淀菌体用100 μ I冰预冷的溶液I (25mM Tris-HCl，IOmM EDTA (乙二胺四乙酸)，50mM葡萄糖，pH8.0)悬浮；加入150 μ I新配制的溶液II (0.2Μ NaOH，1%SDS (十二烷基硫酸钠))，将管子颠倒4次，混合，置冰上3-5min ;加入150 μ I冰冷的溶液III (4Μ醋酸钾，2Μ醋酸)，立即充分混匀，冰上放置5-10min ;于温度4°C、转速12000rpm条件下离心5min，在上清液中加入2倍体积无水乙醇，混匀后室温放置5min ;于温度4°C、转速12000rpm条件下离心5min，弃上清液，沉淀用浓度(V/V)为70%的乙醇洗涤后晾干；加入30 μ I 含 RNase (20 μ g/ml)的 TE(10mM Tris-HCl, ImM EDTA，PH8.0)溶解沉淀;于温度 37°C下水浴30min,消化RNA ;于温度_20°C保存备用。提取的质粒经StyI和EcoRV酶切鉴定后，对阳性克隆进行测序验证，结果表明重组克隆载体DBNOlBa-T中插入的所述PIC2-01核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，即PIC2-01核苷酸序列正确插入。2、构建含有PIC2-01核苷酸序列的重组表达载体DBN100056用限制性内切酶SphI和SpeI分别酶切重组克隆载体DBNOlBa-T和表达载体DBNBC-Ol (载体骨架:pCAMBIA2301 (CAMBIA机构可以提供))，将切下的PIC2-01核苷酸序列片段插到表达载体DBNBC-Ol的SphI和SpeI位点之间，利用常规的酶切方法构建载体是本领域技术人员所熟知的，构建成重组表达载体DBN100056，其构建流程如图2所示(Kan:卡那霉素基因；RB:右边界；Ub1:玉米Ubiquitin(泛素)基因启动子(SEQ ID NO:4)；PIC2-01:PIC2-01核苷酸序列(SEQ ID NO:1) ;Nos:胭脂碱合成酶基因的终止子(SEQ IDNO:5) ；PM1:磷酸甘露糖异构酶基因(SEQ ID NO:6) ;LB:左边界)。将重组表达载体DBN100056用热激方法转化大肠杆菌Tl感受态细胞，其热激条件为:50μ I大肠杆菌Tl感受态细胞、10μ I质粒DNA(重组表达载体DBN100056)，42°C水浴30秒；37°C水浴I小时(IOOrpm转速下摇床摇动)；然后在含50mg/L卡那霉素(Kanamycin)的LB固体平板(胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaC110g/L，琼脂15g/L，用NaOH调pH至7.5)上于温度37°C条件下培养12小时，挑取白色菌落，在LB液体培养基(胰蛋白胨IOg/L，酵母提取物5g/L，NaC110g/L，卡那霉素50mg/L，用NaOH调pH至7.5)中于温度37°C条件下培养过夜。碱法提取其质粒。将提取的质粒用限制性内切酶SphI和SpeI酶切后鉴定，并将阳性克隆进行测序鉴定，结果表明重组表达载体DBN100056在SphI和SpeI位点间的核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO:1所示核苷酸序列，即PIC2-01核苷酸序列。3、构建含有天然序列的重组表达载体DBN100056N(正对照)按照本发明第二实施例中I所述的构建含有PIC2-01核苷酸序列的重组克隆载体DBNOlBa-T的方法，利用天然序列(SEQ ID NO: 7)构建含有天然序列的重组克隆载体DBNOlBaR-T0对阳性克隆进行测序验证，结果表明重组克隆载体DBNOlBaR-T中插入的天然序列为序列表中SEQ ID N0:7所示的核苷酸序列，即天然序列正确插入。按照本发明第二实施例中2所述的构建含有PIC2-01核苷酸序列的重组表达载体DBN100056的方法，利用天然序列构建含有天然序列的重组表达载体DBN100056N，其构建流程如图3所示(载体骨架:pCAMBIA2301 (CAMBIA机构可以提供)；Kan:卡那霉素基因；RB:右边界；Ub1:玉米Ubiquitin(泛素)基因启动子(SEQ ID NO:4) ；mN:天然序列(SEQ IDNO:7) ；Nos:胭脂碱合成酶基因的终止子(SEQ ID NO:5) ；PM1:磷酸甘露糖异构酶基因(SEQID NO:6) ;LB:左边界)。对阳性克隆进行测序验证，结果表明重组表达载体DBN100056N中插入的天然序列为序列表中SEQ ID N0:7所示的核苷酸序列，即天然序列正确插入。4、重组表达载体转化农杆菌对己经构建正确的重组表达载体DBN100056和DBN100056N(天然序列)用液氮法转化到农杆菌 LBA4404(Invitrgen，Chicago, USA, CAT:18313-015)中，其转化条件为:100 μ L农杆菌LBA4404、3 μ L质粒DNA (重组表达载体)；置于液氮中10分钟，37°C温水浴10分钟；将转化后的农杆菌LBA4404接种 于LB试管中于温度28°C、转速为200rpm条件下培养2小时,涂于含50mg/L的利福平(Rifampicin)和100mg/L的卡那霉素(Kanamycin)的LB平板上直至长出阳性单克隆，挑取单克隆培养并提取其质粒，用限制性内切酶StyI和BglII酶切后进行酶切验证，结果表明重组表达载体DBN100056和DBN100056N(天然序列)
结构完全正确。第三实施例、转入PIC2-01核苷酸序列的玉米植株的获得及验证1、获得转入PIC2-01基因序列的玉米植株按照常规采用的农杆菌侵染法，将无菌培养的玉米品种综31 (Z31)的幼胚与第二实施例中4所述的农杆菌共培养，以将第二实施例中2和3构建的重组表达载体DBN100056和DBN100056N(天然序列)中的T-DNA(包括玉米Ubiquitin基因的启动子序列、PIC2-01核苷酸序列、天然序列、PMI基因和Nos终止子序列)转入到玉米染色体组中，获得了转入PIC2-01核苷酸序列的玉米植株和转入天然序列的玉米植株(正对照)；同时以野生型玉米植株作为负对照。对于农杆菌介导的玉米转化，简要地，从玉米中分离未成熟的幼胚，用农杆菌悬浮液接触幼胚，其中农杆菌能够将PIC2-01核苷酸序列传递至幼胚之一的至少一个细胞(步骤1:侵染步骤)，在此步骤中，幼胚优选地浸入农杆菌悬浮液(OD66tl=0.4-0.6，侵染培养基(MS盐4.3g/L、MS维他命、干酪素300mg/L、鹿糖68.5g/L、葡萄糖36g/L、乙酰丁香酮(AS)40mg/L、2，4-二氯苯氧乙酸(2，4_D) lmg/L, pH5.3))中以启动接种。幼胚与农杆菌共培养一段时期(3天)(步骤2:共培养步骤)。优选地，幼胚在侵染步骤后在固体培养基(MS盐4.3g/L、MS维他命、干酪素300mg/L、鹿糖20g/L、葡萄糖10g/L、乙酰丁香酮(AS) IOOmg/L、2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)lmg/LJ|^g8g/L，pH5.8)上培养。在此共培养阶段后，可以有一个选择性的“恢复”步骤。在“恢复”步骤中，恢复培养基(MS盐4.3g/L、MS维他命、干酪素300mg/L、鹿糖30g/L、2, 4- 二氯苯氧乙酸(2，4_D) lmg/L、琼脂8g/L, pH5.8)中至少存在一种己知抑制农杆菌生长的抗 生素(头孢霉素)，不添加植物转化体的选择剂(步骤3:恢复步骤)。优选地，幼胚在有抗生素但没有选择剂的固体培养基上培养，以消除农杆菌并为侵染细胞提供恢复期。接着，接种的幼胚在含选择剂(甘露糖)的培养基上培养并选择生长着的转化愈伤组织(步骤4:选择步骤)。优选地，幼胚在有选择剂的筛选固体培养基(MS盐4.3g/L、MS维他命、干酪素300mg/L、蔗糖5g/L、甘露糖12.5g/L、2，4- 二氯苯氧乙酸(2，4-D) lmg/L、琼脂8g/L，pH5.8)上培养，导致转化的细胞选择性生长。然后，愈伤组织再生成植物(步骤5:再生步骤)，优选地，在含选择剂的培养基上生长的愈伤组织在固体培养基(MS分化培养基和MS生根培养基)上培养以再生植物。筛选得到的抗性愈伤组织转移到所述MS分化培养基(MS盐4.3g/L、MS维他命、干酪素300mg/L、蔗糖30g/L、6-苄基腺嘌呤2mg/L、甘露糖5g/L、琼脂8g/L，pH5.8)上，25°C下培养分化。分化出来的小苗转移到所述MS生根培养基(MS盐2.15g/L、MS维他命、干酪素300mg/L、蔗糖30g/L、吲哚-3-乙酸lmg/L、琼脂8g/L，pH5.8)上，25°C下培养至约IOcm高，移至温室培养至结实。在温室中，每天于28°C下培养16小时，再于20°C下培养8小时。2、用TaqMan验证转入PIC2-01核苷酸序列的玉米植株分别取转入PIC2-01核苷酸序列的玉米植株和转入天然序列的玉米植株的叶片约IOOmg作为样品，用Qiagen的DNeasy Plant Maxi Kit提取其基因组DNA,通过Taqman探针荧光定量PCR方法检测PIC2基因的拷贝数。同时以野生型玉米植株作为负对照，按照上述方法进行检测分析。实验设3次重复，取平均值。检测PIC2基因拷贝数的具体方法如下:步骤11、分别取转入PIC2-01核苷酸序列的玉米植株、转入天然序列的玉米植株和野生型玉米植株的叶片各lOOmg，分别在研钵中用液氮研成匀浆，每个样品取3个重复；步骤12、使用Qiagen的DNeasy Plant Mini Kit提取上述样品的基因组DNA,具体方法参考其产品说明书；步骤13、用NanoDrop2000 (Thermo Scientifc)测定上述样品的基因组DNA浓度；步骤14、调整上述样品的基因组DNA浓度至同一浓度值，所述浓度值的范围为80_100ng/μ I ；步骤15、采用Taqman探针荧光定量PCR方法鉴定样品的拷贝数，以经过鉴定已知拷贝数的样品作为标准品，以野生型玉米植株的样品作为对照，每个样品3个重复，取其平均值；荧光定量PCR引物和探针序列分别是:以下引物和探针用来检测PIC2-01核苷酸序列:引物I(CFl):TGCGGTGTCTAACCACTCAGC 如序列表中 SEQ ID NO:8 所示；引物2 (CRl):ATGCACAGGGAGTCTTCGATTC 如序列表中 SEQ ID NO: 9 所示；探针I (CPl):CAGATGGACCTCCTGCCAGATGCG 如序列表中 SEQ ID NO: 10 所示；以下引物和探针用来检测天然序列:引物3(CF2):CCTATGGCCGCTTTCAGTTG 如序列表中 SEQ ID NO: 11 所示；引物4(CR2):TGTGGTGCGCATCGATTC 如序列表中 SEQ ID NO: 12 所示；探针2(CP2):CTCCGCACCTTCCGATTGGGCT 如序列表中 SEQ ID NO: 13 所示；PCR反应体系为:
Jump Start Taq ReadvM ix ( Sigma )10μ1
50x引物/探针混合物Ιμ
基因组DNA3μ
水(ddH20 ) μ 所述50 X引物/探针混合物包含ImM浓度的每种引物各45 μ 1，100 μ M浓度的探针50μ I和860 μ IlXTE缓冲液，并且在4°C，贮藏在琥珀试管中。PCR反应条件为:
步骤温度时间
2195 "C5 分钟
2295 C30 秒
2360 0CI 分钟
24回到步骤22,重复40次利用SDS2.3 软件(Applied Biosystems)分析数据。实验结果表明，PIC2-01核苷酸序列和天然序列均己整合到所检测的玉米植株的染色体组中，而且转入PIC2-01核苷 酸序列 的玉米植株和转入天然序列的玉米植株均获得了含有单拷贝PIC2基因的转基因玉米植株。第四实施例、转基因玉米植株的RT-PCR检测1、转基因玉米植株的杀虫蛋白质(PIC2蛋白)的mRNA含量检测分别取0.2g转入PIC2-01核苷酸序列的玉米植株和转入天然序列的玉米植株(正对照)的新鲜叶片(心叶)作为样品，液氮研磨收集100-200mg组织，后加入Iml所述TRIZOL提取液，涡旋使样品充分裂解，室温放置5min ;加入0.2ml氯仿(chloroform)剧烈振荡混勻15s,室温放置IOmin ;4°C下，12000rpm的转速下离心IOmin,取上清液加入0.5ml (或0.5X开始体积)的RNase-Free水，再加入Iml的异丙醇(1:1体积)，充分混勻，室温放置IOmin,沉淀；4°C下，12000rpm的转速下离心IOmin,取沉淀加入Iml质量分数为75%的乙醇洗涤RNA沉淀；4°C下，8000rpm的转速下离心lOmin，去上清，RNA稍晾干约10-15min，加入100 μ I体积的RNase-Free水充分溶解；RNA样品DAaseI酶切，如:20μ I RNA 样品(彡 5 μ g,溶于水或者 TE Buffer)
权利要求
1.一种杀虫基因，其特征在于，其核苷酸序列包括: (a)具有SEQID NO:1所示的核苷酸序列；或 (b)与(a)的核苷酸序列同类编码，且不为SEQID NO: 2 ;或 (c)在严格条件下与(a)或(b)限定的核苷酸序列杂交且编码具有杀虫活性的蛋白质的核苷酸序列。
2.一种表达盒，其特征在于，包含在有效连接的调控序列调控下的权利要求1所述杀虫基因。
3.一种包含权利要求1所述杀虫基因或权利要求2所述表达盒的重组载体。
4.一种包含权利要求1所述杀虫基因或权利要求2所述表达盒的转基因宿主生物，其特征在于，包括植物细胞、动物细胞、细菌、酵母、杆状病毒、线虫或藻类。
5.根据权利要求4所述转基因宿主生物，其特征在于，所述植物为玉米、大豆、棉花、水稻或小麦。
6.—种产生杀虫蛋白质的方法，其特征在于，包括: 获得权利要求4或5所述转基因宿主生物的细胞； 在允许产生杀虫蛋白质的条件下培养所述转基因宿主生物的细胞； 回收所述杀虫蛋白质。
7.一种用于增加昆虫靶范围的方法，其特征在于，包括:将权利要求1所述杀虫基因编码的杀虫蛋白质或权利要求2所述表达盒编码的杀虫蛋白质在植物中与至少一种不同于权利要求1所述杀虫基因编码的杀虫蛋白质或权利要求2所述表达盒编码的杀虫蛋白质的第二种杀虫核苷酸一起表达。
8.根据权利要求7所述用于增加昆虫靶范围的方法，其特征在于，所述第二种杀虫核苷酸可以编码Cry类杀虫蛋白质、Vip类杀虫蛋白质、蛋白酶抑制剂、凝集素、α _淀粉酶或过氧化物酶。
9.根据权利要求7所述用于增加昆虫靶范围的方法，其特征在于，所述第二种杀虫核苷酸为抑制目标昆虫害虫中重要基因的dsRNA。
10.一种产生抗虫植物的方法，其特征在于，包括:将权利要求1所述杀虫基因或权利要求2所述表达盒或权利要求3所述重组载体导入植物。
11.根据权利要求10所述产生抗虫植物的方法，其特征在于，所述植物为玉米、大豆、棉花、水稻或小麦。
12.一种用于保护植物免受由昆虫害虫引起的损伤的方法，其特征在于，包括:将权利要求I所述杀虫基因或权利要求2所述表达盒或权利要求3所述重组载体导入植物，使导入后的植物产生足够保护其免受昆虫害虫侵害量的杀虫蛋白质。
13.根据权利要求12所述用于保护植物免受由昆虫害虫引起的损伤的方法，其特征在于，所述植物为玉米、大豆、棉花、水稻或小麦。
14.一种控制昆虫害虫的方法,其特征在于,包括:使昆虫害虫与抑制量的由权利要求1所述杀虫基因编码的昆虫抑制性蛋白接触。
15.根据权利要求14所述控制昆虫害虫的方法，其特征在于，所述昆虫害虫是鳞翅目昆虫害虫。
全文摘要
本发明涉及一种杀虫基因及其用途，所述杀虫基因的核苷酸序列包括(a)具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；或(b)与(a)的核苷酸序列同类编码，且不为SEQ ID NO:2；或(c)在严格条件下与(a)或(b)限定的核苷酸序列杂交且编码具有杀虫活性的蛋白质的核苷酸序列。本发明杀虫基因特别适合在单子叶植物中表达，尤其是玉米和水稻，不仅显著提高了PIC2-01杀虫蛋白的表达量和稳定性，而且还显著增强了PIC2-01杀虫蛋白对昆虫害虫的毒力，尤其是鳞翅目昆虫害虫。
文档编号C12N15/63GK103146717SQ20131005890
公开日2013年6月12日 申请日期2013年2月25日 优先权日2013年2月25日
发明者丁德荣 申请人:北京大北农科技集团股份有限公司, 北京大北农科技集团股份有限公司生物技术中心