一种人源杀虫基因及其编码杀虫肽与应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开一种人源杀虫基因及其编码杀虫肽与应用，所述人源杀虫基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，该基因编码的杀虫肽氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，该杀虫肽可经原核系统表达，初级培养物具有与稻纵卷叶螟中肠围食膜特异性受体BBMV的结合活性，其不经动物免疫获得，制备周期短，氨基酸序列小，适合体外大规模生产，可降低现有Bt毒素广泛使用存在的各类安全风险乃至以后可能替代Bt用于农业害虫的生物防治，减少杀虫剂的使用具有重要的科学及现实意义。
【专利说明】一种人源杀虫基因及其编码杀虫肽与应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因工程和生物防治领域，特别是一种人源杀虫基因及其编码杀虫肽 与应用。
【背景技术】
[0002] 目前全球广泛用于生物防治病虫害的杀虫基因是苏云金芽孢杆菌 Bt)产生的 Bt 毒素基因（如 CrylC、CrylAb、CrylB、CrylF、Cry2Aa 等）。苏 云金芽孢杆菌是一种昆虫性病原细菌，其产生的Bt毒素对多种农、林害虫都有具有特异性 毒杀作用。从1987年比利时植物遗传系统公司（Plant Genetic Systems)首次报道了转 Bt基因杀虫烟草获得成功，到现在，Bt基因已经被转基因到玉米、水稻、棉花、番茄、马铃 薯、烟草等主要农作物中。据2012年国际生物技术应用服务组织统计，中国种植的转Bt棉 面积就已经超过390万公顷，占棉花种植总面积的71. 5 %。然而，随着转Bt基因作物的 应用和推广，其在基因逃逸、改变土壤微生物生态结构、物种的耐药性以及危害正常免疫系 统等方面可能存在的潜在危害逐渐受到社会关注。在学术领域，"转Bt基因玉米根际微生 物和细菌生理群多样性"（王敏等，生态学杂志，2010年03期）和"转Bt基因玉米对土壤细 菌数量多样性的影响"（刘玲等，生态与农村环境学报，2011年03期）分别对室内、室外种 植转Bt玉米的土壤进行了细菌数量和多样性分析，结果都发现种植转Bt玉米的与空白对 照组相比出现显著差异；"CrylAc protoxin from Bacillus thuringiensis sp.kurstaki HD73 binds to surface proteins in the mouse small intestine，' （V0zquez_Padr0n 等，Biochem Biophys Res Commun，2000年01期)在动物试验发现，当小鼠摄取的Bt内、夕卜 毒蛋白达到10 mg/kg和100 mg/kg时，小鼠的T细胞ANAE阳性率、脾脏指数及巨噬细胞的 吞噬功能均出现了明显的抑制反应，随着摄取剂量的增加，这种抑制作用越发明显，该试验 还发现，当Bt毒素蛋白在动物体内的蓄积系数大于6. 24时，可以导致肝脏、肾脏及胃肠道 等损伤，在肝脏和肾脏中可以观察到细胞肿胀和空泡样变性异象，并且能看见肾小球血管 上皮细胞的病变，当然这也不能排除是由免疫反应造成的，同时长期大剂量使用Bt毒素蛋 白，还会导致动物白细胞总数和血红蛋白含量显著性下降，这也说明Bt毒素蛋白具有明显 的免疫抑制毒性。因此，开拓具有Bt毒素生物活性的替代生物效应物是开发生物农药领域 研究的热点。
[0003] 杀虫肽是生物体内经诱导产生的一类具有生物活性的多肽，一些Bt杀虫晶体蛋 白可在昆虫体内被分解为杀虫肽，实现杀虫的效果，因而成为目前Bt毒素生物活性的替代 生物效应物发展的新方向，抗独特型抗体（Anti-idiotype antibody,以下简称Anti-Id) 即为这样一类具有生物杀虫效果的多肽，Anti-Id是指针对位于抗体分子可变区的独特型 (Idiotype，Id)产生的特异性抗体，Bona等根据Id与Anti-Id的血清学反应以及AId的功 能，将抗独特型抗体分为4种类型（α，β，Y和ε)。其中，β型抗独特型抗体由于具有 "内影像"作用，即具有与（半）抗原相同的抗原决定簇，因而可以具有抗原的功能和生物活 性。
[0004] 目前普遍采用噬菌体展示技术，通过构建噬菌体抗体库，经特异性筛选，可以获得 具有靶标抗原类似效应的抗独特型抗体，采用噬菌体展示技术筛选特异性抗体的过程称为 "淘选（Panning)"，主要包括结合、洗漆、洗脱和扩增4个步骤，Raats等采用抗皮质醇单克 隆抗包被做为固相抗原直接进行筛选，在进行筛选之前，用相同种属的阴性单克隆抗体进 行负筛选以避免筛选到与抗体恒定区结合的重组抗体片段，最终成功筛选到针对皮质醇的 Anti-Id ;G〇letZ等同样利用噬菌体抗体展示系统并研究比较了不同洗脱方法对抗独特型 抗体片段筛选结果的影响，最终筛选到的96个克隆中有28个为具有抗独特型特性的阳性 克隆。目前针对可替代Bt活性效应物，特别是抗Bt毒素类型的抗独特型单链抗体（以下简 称Anti-Id ScFvs)小分子多肽等相关材料及产品还未见报道。
【发明内容】
[0005] 针对目前目前转Bt毒素作物及其毒素制剂的广泛应用存在的安全隐患及超敏反 应等问题，提供一种具有Bt毒素生物活性的可替代人源杀虫基因及其编码杀虫肽，本发明 是这样实现的： 一种人源杀虫基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0006] 一种如本发明所述人源杀虫基因编码的杀虫肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所 /Jn 〇
[0007] -种含有本发明所述人源杀虫基因的原核载体。
[0008] 如本发明所述人源杀虫基因编码的杀虫肽在农作物害虫防治方面的应用。
[0009] -种含有如本发明所述人源杀虫基因编码的杀虫肽的杀虫剂。
[0010] 本发明从公开的人类基因库中，筛选获得具有杀虫活性的" β "类型抗Cry2Aa毒 素独特型单链抗体(杀虫肽)，并对其进行氨基酸与核苷酸测序，该杀虫肽经原核系统表达， 初级培养物具有与稻纵卷叶螟中肠围食膜特异性受体BBMV的结合活性，不经动物免疫获 得，制备周期短，氨基酸序列小，适合体外大规模生产，此外，该杀虫肽作为全新的新杀虫基 因资源，对探索拓展具有模拟Bt毒素生物活性的新型杀虫基因资源，降低现有Bt毒素广泛 使用存在的各类安全风险乃至以后可能替代Bt用于农业害虫的生物防治，减少杀虫剂的 使用具有重要的科学及现实意义。
【专利附图】
【附图说明】
[0011] 图1为F2 ELISA检测结果示意图。
[0012] 图2为F2生物学测定结果示意图。
[0013] 图3为分别喂食经F2、CK+、CK-浸泡过的水稻叶片后的稻纵卷叶螟三龄幼虫死亡 情况示意图。
[0014] 图4为分别喂食经F2、CK+、CK-浸泡过的甘蓝片后的小菜蛾三龄幼虫死亡情况示 意图。
【具体实施方式】
[0015] 实施例所涉及的试剂和培养基配方： (1)2XTY液体培养基： 在900 mL双蒸水中加入16 g胰蛋白胨，10 g酵母提取物和5 g NaCl，搅拌混匀，用双 蒸水定容到I L，置于高压灭菌锅中，12rC，20min灭菌，冷却后，置于4°C保存备用。
[0016] (2 ) 2 X TY-AG 液体培养基： 在2XTY的培养基中加入终浓度为100 μ g/ml氨苄青霉素和质量比为1 %的葡萄糖。
[0017] (3 ) 2 X TY-AK 液体培养基： 在2XTY的培养基中加入终浓度为100 μ g/ml氨苄青霉素、50 μ g/ml卡那霉素。
[0018] (4 ) 2 X TY-AKG 液体培养基： 在2XTY的培养基中加入终浓度为100 μ g/ml氨苄青霉素、50 μ g/ml卡那霉素和质 量比为1 %葡萄糖。
[0019] (5) TYE固体培养基： 在900 ml双蒸水中加入15.0 g琼脂糖，8 g NaCl，10 g胰蛋白胨，5 g酵母提取物，用 双蒸水定容到I L，置于高压灭菌锅中，12rC，20min灭菌，冷却后，置于4°C保存备用。
[0020] (6 ) TYE-AG 固体培养基： 在TYE固体培养基中加入终浓度为100 μ g/ml氨苄青霉素和质量比为1 %葡萄糖。
[0021] (7) PBS 溶液 称取 NaCl 8.0 g，KCl 0.2 g，Na2HP04*12H20 2.9 g，KH2P04 0.2 g，分别加入到蒸馏 水中，充分溶解后，定容到I L。
[0022] (8) PBST 溶液 0. 05%PBST是在PBS溶液中加入体积比为0. 05%的吐温-20。
[0023] 0· 1%PBST是在PBS溶液中加入体积比为0· 1%的吐温-20。
[0024] (9)PEG/NaCl 溶液： 称取20 g PEG 8 000,14. 61 g NaCl，加80 ml去离子水，定容到100 ml，置于高压灭 菌锅中，121°C，20min灭菌，冷却后，置于4°C保存备用。
[0025] (10)柠檬酸盐缓冲液（CPBS，底物缓冲液，PH5.5): 取C6H7O8 (柠檬酸）21 g，Na2HPO4 ·12Η20 71.6 g，分别加入到蒸馏水中充分溶解后定容 到I L。
[0026] (11)四甲基联苯胺（TMB)溶液： 称取10 mg四甲基联苯胺溶于I ml二甲基亚砜中，避光，置于4 °C保存备用。
[0027] (12)底物显色溶液： 10 ml 配方成分：9.875 ml CPBSU00 μ I TMB 溶液、25 μ 1 体积比为 20% H202。
[0028] (I3) 3% 的 MPBS 溶液： 称取3g脱脂奶粉，溶解于80mlPBS溶液中，加 PBS溶液定容到IOOml。
[0029] 实施例中所述HRP-羊抗兔I gG是以3%的MPBS溶液稀释。
[0030] 实施例所涉及材料来源： BBMV、不相关的抗独特型单链抗体、非"β "类型的Anti-Id ScFv、甘蓝叶片、小菜蛾三 龄幼虫均由江苏省农业科学院农业部农产品质量安全控制技术与标准重点实验室提供； 阴性血清：采集自I. 5-2. Okg的纯种雄性新西兰大白兔，采集时间为免疫前一周； 抗Cry2Aa多克隆抗体：以Cry2A蛋白标准品（上海佑隆生物科技有限公司）作为免疫 原，选取三只I. 5-2. Okg的纯种雄性新西兰大白兔作为试验动物，具体免疫程序如下：首 次免疫采用每只200微克免疫原与等体积弗氏完全佐剂混和，乳化成油包水结构后进行背 部皮下多点注射（40点左右)，两周后用同样剂量的免疫原与等体积不完全弗氏佐剂进行 加强，此后每隔两周加强一次，最后一次用等体积的生理盐水稀释免疫原，直接耳缘静脉注 射，8天后心脏采血，制备血清，添加终浓度为0. 01%的硫柳汞，然后将血清以"当代免疫学 技术与应用"（巴德年，北京医科大学，中国协和医科大学联合出版社，1998. 309-322)所 记载的方法提纯，获得抗Cry2Aa多克隆抗体。
[0031] 人源化的噬菌体抗体库、TGl细菌和辅助噬菌体KM13购于英国Source BioScience 公司； HRP-羊抗M13-IgG购于武汉博士德公司； Cry2Aa毒素和CrylAb毒素购于上海佑隆生物科技有限公司； 水稻叶片和纵卷叶螟三龄幼虫由扬州绿源生物化工有限公司提供。
[0032] 实施例1筛选杀虫肽 (1) 取人源化的噬菌体抗体库菌液2〇μ 1加入到200ml2XTY-AG液体培养基中，37°C 恒温培养到OD6c?为0. 4,取50 ml菌液，加入I X 10 12 pfu辅助噬菌体KM13进行超感染，于 37°C孵育30 min后以3300 g离心10 min,弃上清液，用100ml2 X TY-AKG液体培养基重悬 沉淀，30 °C培养过夜；次日3300g离心30 min，收集上清液并加入20 ml PEG/NaCl溶液， 冰浴I h后再3300g离心30 min,用4mlPBS重悬沉淀；重悬液以11600g离心10 min,上清 液即为扩增的噬菌体抗体库； (2) 取步骤1获得的扩增的噬菌体抗体库进行4轮淘筛：筛选方法采取正负筛选，以阴 性血清作为负筛选，抗Cry2Aa多克隆抗体作为正筛选，先负后正，负细胞培养瓶中包被阴 性血清，正细胞培养瓶瓶中包被抗Cry2Aa多克隆抗体，洗脱方法采用四轮竞争洗脱： 第一轮筛选先将4mL100 μ g /ml的阴性血清和4mL100 μ g /ml的抗Cry2Aa多克隆抗 体分别包被于负细胞培养瓶与正细胞培养瓶底部，4 °C过夜，次日先用PBS清洗负细胞培 养瓶3次后加入步骤1获得的Iml扩增的噬菌体抗体库，4 ml 3%的MPBS溶液，置于摇床 于室温下缓慢摇动I h，再静置I h，用PBS清洗正细胞培养瓶，再将静置Ih后的负细胞培 养瓶中液体吸入正细胞培养瓶中，置于摇床于室温下缓慢摇动I h，再静置I h，之后弃去正 细胞培养瓶中液体，用I ml 0.05%PBST溶液洗正瓶10次，加入Iml 10mg/ml的胰蛋白酶（ Trypsin)洗脱特异性结合的噬菌体抗体，洗脱时间为30min，洗脱液即为第1轮淘筛的噬 菌体抗体； 第2、3、4轮淘筛的包被抗Cry2Aa多克隆抗体和阴性血清浓度仍然为IOOyg /ml， 所使用的噬菌体抗体为前一轮淘筛获得的噬菌体抗体，淘筛方法仍用第1轮的正负筛选 策略，不同的是第二轮采用〇. 1%PBST溶液洗正瓶10次，加入Iml 10mg/ml的胰蛋白酶（ Trypsin)后竞争洗脱lh，第三、四次均用0. 1%PBST溶液洗正瓶20次，之后加入500μ 1浓 度为IOOug /mlCry2Aa多克隆抗体代替胰蛋白酶竞争洗脱，第三轮竞争洗脱时间为lh，第 四轮竞争洗脱时间为30min。
[0033] 取第4轮淘筛的噬菌体抗体10 μ 1侵染I ml处于对数生长期的TGl细菌，37 °C孵育I h后，涂布于TYE-AG固体培养基上，37 °C培养过夜；次日随机挑取单菌落，接种 到含100 μ 1/孔2 X TY-AG液体培养基的96孔板中，37 °C培养过夜；次日从板孔中吸出 2μ1菌液转接到新的96孔板孔中，37 °C孵育2 h，每孔加入25μ1滴度为IO12的辅助噬菌 体KM13,30 °C孵育2 h，1800 g离心10 min，用150 μ? 2XTY-AK液体培养基重悬沉淀后 30 °C培养过夜，次日1800 g离心30 min，分别取上清液； (3)取4 μ g /ml的抗Cry2Aa多克隆抗体加入到96孔板中，100 μ 1/孔，4 °C过夜， 次日每孔分别加入100 μ 1步骤2获得的上清液，阴性对照加 100 μ I 2XTY-AK液体培养 基，37 °C水浴2 h，每孔用250μ IPBST洗板后，每孔加入ΙΟΟμΙ 1:5000稀释的HRP-羊抗 M13-IgG，37°C孵育2 h;每孔加入100 μ?底物显色溶液，室温下反应10~20 min至出现蓝 色，最后每孔加入50 μ?浓度为2 mol/L的H2S04快速终止反应后用酶标仪测定0D450 值，其中溶液0D450值/阴性对照0D450值大于2. 1的，判断为阳性，与该溶液对应的步骤 2中的上清液即为筛选到的含有抗Cry2Aa毒素独特型单链抗体，即杀虫肽的上清液。
[0034] 以Sanger测序法测定筛选到的杀虫肽核苷酸序列为SEQ ID NO. 1如下： ccggcccttt ggcatgcaat ttctatttca ggagacagtc ataatgaaat acctattgcc 60 tacggcagcc gctggattgt tattactcgc ggcccagccg gccatggccg aggtgcagct 120 gttggagtct gggggaggct tggtacagcc tggggggtcc ctgagactct cctgtgcagc 180 ctctggattc acctttagca gctatgccat gagctgggtc cgccaggctc cagggaaggg 240 gctggagtgg gtctcaagta ttgattctta tggtactaat acagattacg cagactccgt 300 gaagggccgg ttcaccatct ccagagacaa ttccaagaac acgctgtatc tgcaaatgaa 360 cagcctgaga gccgaggaca cggccgtata ttactgtgcg aaagctttta attcttttga 420 ctactggggc cagggaaccc tggtcaccgt ctcgagcggt ggaggcggtt caggcggagg 480 tggcagcggc ggtggcgggt cgacggacat ccagatgacc cagtctccat cctccctgtc 540 tgcatctgta ggagacagag tcaccatcac ttgccgggca agtcagagca ttagcagcta 600 tttaaattgg tatcagcaga aaccagggaa agcccctaag ctcctgatct atgctgcatc 660 cgctttgcaa agtggggtcc catcaaggtt cagtggcagt ggatctggga cagatttcac 720 tctcaccatc agcagtctgc aacctgaaga ttttgcaact tactactgtc aacagtatag 780 ttctagtcct tctacgttcg gccaagggac caaggtggaa atcaaacggg cggccgcaca 840 tcatcatcac catcacgggg ccgcagaaca aaaactcatc tcagaagagg atctgaatgg 900 ggccgcatag actgttgaaa gttgtttagc aaaacctcat acagaaaatt catttactaa 960 cgtctggaaa gacgacaaaa ctttaaatcg ttacgctaac 1000 以Sanger测序法测定筛选到的杀虫肽氨基酸序列为SEQ ID NO. 2,如下： MKYLLPTAAAGLLLLAAQPAMAEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAAS GFTFSSYAMmR 60 H-CDR2 QAPGKGLEffVS SIDSYGTNTDYADSmWT ISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAK 120 H-CDR3 ---------Link----------- AFNSFDmGQGTLYTYSS GGGGSGGGGSGGGGSIX) IQMTQSPSSLSASVGDRVTITCJMS 180 L-CDRl L-CDR2 ^/^ZMYQQKPGKAPKLLIY^^Z^iGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATY 240 L-CDR3 His-tag YCW755S^7FGQGTKVEIKRAAAHHHHHHGAAEQKLISEEDLNGAA 288 申请人:将此杀虫肽自命名为F2。
[0035] 实施例2制备F2的初级培养物 将实施例1筛选到的含有杀虫肽的上清液按体积比1:100转接到10 ml 2XTY-AG液 体培养基中，37 °C孵育2 h，加入100 μ 1滴度为IO12的辅助噬菌体KM13进行救援，30 °C 孵育2 h，1800 g离心10 min，去上清液，用2XTY-AK液体培养基重悬沉淀菌种，于30 °C、 250 rpm振荡培养过夜；次日1 800 g离心30 min，其上清液即为含有F2初级培养物的上 清液。
[0036] 实施例3 F2的亚型鉴定 (1)竞争抑制ELISA检测实验 实验分为6个实验组与相应的对照组，分别依表1配制溶液 表1竞争抑制ELISA检测实验溶液配制
【权利要求】
1. 一种人源杀虫基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
2. 如权利要求1所述人源杀虫基因编码的杀虫肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
3. -种含有权利要求1所述人源杀虫基因的原核载体。
4. 如权利要求2所述杀虫肽在农作物害虫防治方面的应用。
5. -种含有权利要2所述杀虫肽的杀虫剂。
【文档编号】C12N15/12GK104498501SQ201410735997
【公开日】2015年4月8日 申请日期:2014年12月5日 优先权日:2014年12月5日
【发明者】刘贤金, 刘媛, 谢雅晶, 武爱华, 张霄, 徐重新, 赵岩岩, 仲建锋 申请人:江苏省农业科学院