专利名称：一种甘丙肽基因的单核苷酸多态位点及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种甘丙肽基因的单核苷多态位点rS694066，本发明还涉及一种检测该多态位点的方法，以及该多态在预防、辅助诊断与治疗女性抑郁症方面的用途。该发明属于生物技术领域。
背景技术：
抑郁症是发病率、致残性高，社会危害严重的精神障碍。大量研究认为抑郁症的病因复杂，涉及遗传、生化、心理和社会环境等多种因素。研究显示，单相抑郁的终生患病率在10%以上，且女性是男性的2倍左右。
单核苷酸多态性(SNP)是指基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。SNP可以出现在基因调控区和编码区，出现在编码区的SNP可能改变基因的编码使蛋白中某个氨基酸发生改变而影响其功能；而出现在基因调控区的SNP则主要影响基因的表达。SNP作为一种稳定遗传的早期突变，与疾病有着密切的相关性。当一种SNP的频率在患者明显超过非患者时，即表明该SNP与疾病关联，通过比较分析两者的单倍型和研究连锁不平衡性，可将基因组中任何未知的致病基因定位。SNP在疾病基因定位中所发挥的作用主要包括:一是在疾病定位区域中寻找致病SNP，这种SNP的出现可能直接导致了基因转录水平上和翻译水平上的变化，即改变了基因表达量或者基因产物蛋白质的组成结构，从而导致某种疾病发生或使得个体对某种特殊的环境易感；二是SNP作为一个遗传标记，与疾病或表型紧密连锁。
甘丙肽是一个由定位于11号染色体上的甘丙肽基因编码的，30个氨基酸组成的多肽，广泛分布于中枢神经系统，通过与不同的受体结合表现出多种生理效应。多项文献显示，甘丙肽与单胺类递质和应激通路关系密切，具有调节中枢5-HT能和去甲肾上腺素能神经兀的活性和表达的作用[Mann JJ.The medical management of depression.N Engl JMed2005，353:1819-1834 ；Fornaro M, Prestia D，Colicchio S, Perugi G.A systematic,updated review on the antidepressant agomelatine focusing on its melatonergicmodulation.Curr Neuropharmaco1.2010,8(3):287-304 ;Di Giannantonio M，Di 1rioG，Guglielmo R，et al.Major depressive disorder，anhedonia and agomelatine:an open-la bel study.J Biol Regul Homeost Agents.2011，25(I):109-114 ;SullivanPF, Neale MC, Kendler KS.Genetic epidemiology of major depression:review andmeta-analysis.Am J Psychiatry2000,157:1552-1562 ;Melander T, Hokfelt T, RokdCUSA，et al.Coexistence of galanin—like immunoreactivity with catecholamines，5-hydroxytryptamine, GABA and neuropeptides in the rat CNS.J Neurosc1.1986，6(12):3640-3654 ；Xu ZQ，Hokfelt T.Expression of galanin and nitric oxidesynthase in subpopulations of serotonin neurons of the rat dorsal raphenucleus.J Chem Neuroanat.1997,13(3):169-187 ；Xu Z.Q，Shi TJ, Hokfelt T.Galanin/GMAP-and NPY like immunoreactivities in locus coeruleus and noradrenergicnerve terminals in the hippocampal formation and cortex with notes on thegalanin-Rland-R2receptors.J.Comp.Neurol.1998,392(2):227-251 ；Marina RPiBrabantC， Einstein EB, et al.Effects of galanin on monoaminergic systems and HPAaxis !Potential mechanisms underlying the effects of galanin on addiction—andstress-related behaviors.Brain Research.2010，1314:206-218.]。同时，通过给予大鼠脑室内注射甘丙肽或其不同的受体激动剂或拮抗剂后能能影响大鼠的抑郁样行为[Bing0，Moller C，Engel J.A, et al.Anxiolytic-like action of centrally administeredgalanin.Neurosci Lett.1993，164(1-2):17-20 ；Bartfai T，Lu X，Badie-Mahdavi H，etal.Galmic,a nonpeptide galanin receptor agonist，affects behaviors in seizure,pain，and forced-swim tests.Proc.Natl.Acad.Sc1.USA.2004,101 (28):10470-10475;Kuteeva E，Hokefelt T，Wardi T，et al.Galanin，galanin receptor subtypes anddepression-like behavior.Cell Mol.Life Sc1.2008，65(2):1854-1863 ；Swanson CJ,Blackburn TP, Zhang X，et al.Anxiolytic-and antidepressant-1 ike profiles ofthe galanin-3receptor(Gal3) antagonists SNAP37889and SNAP398299.Proc.Natl.Acad.Sc1.USA.2005，102(48):17489-17494 ;Barr AM，Kinney JW，Hill MN，et al.Anovel, systemically active, selective galanin receptor type-31igand exhibitsantidepressant-1 ike activity in preclinical tests.Neurosci Lett.2006,405(1-2):111-115.]。而且，甘丙肽受体拮抗剂M40可以阻断药氟西汀的抗抑郁效果[Lu XiBarr AM，Kinney JW, et al.A role for galanin in antidepressant actions with a focus onthe dorsal raphe nucleus.Proc Natl Acad Sci USA.2005，102 (3):874-879.]。因此，甘丙肽基因可能是抑郁症的一个易感基因。本研究通过对来自北京和河南两地的700例抑郁症患者和673例健康对照者进行甘丙肽基因10个SNPs位点基因分型检测，结果发现，整体样本中多态性位点rs694066位点与抑郁症高度关联；性别分层后，仅在女性样本中表现出高度关联，而男性患者无显著性关联。这一结果充分提示，甘丙肽基因可能是女性抑郁症的易感基因。经对现有国内外文献和专利检索，至今未见有任何甘丙肽基因多态性位点rs694066与女性抑郁症易感性相关的报道。
发明内容
本发明的目的就在于揭示甘丙肽基因多态性位点与抑郁症的相关性，及其在检测抑郁症方面的用途。本发明的目 的在于揭示甘丙肽基因的单核苷酸多态位点与女性抑郁症的易感性，以及该多态性位点在筛选女性抑郁症易感人群方面的用途。本发明通过对700例抑郁症患者(男性324例，女性376例)和673例健康对照者(男性313例，女性360例)的甘丙肽基因10个单核苷酸多态性位点的研究发现:甘丙肽基因SNP位点rs694066与抑郁症具有显著关联。抑郁症患者组甘丙肽基因的rs694066多态性位点基因型GG频率显著减少，AG型增多；抑郁症患者组rs694066等位基因G频率降低，A等位基因频率则升高。经过性别分层后，376例女性抑郁症患者和360例女性健康对照者纳入分析。结果显示，女性抑郁症患者组甘丙肽基因的rs694066多态性位点基因型GG频率显著减少，AG型增多；抑郁症患者组rs694066等位基因G频率降低，A等位基因频率则升高。对324例男性抑郁症患者与313例男性健康对照者分析结果显示，甘丙肽基因的多态性位点与疾病无显著性。
本发明首先提供一种检测甘丙肽基因的单核苷酸多态性的方法，包括以下步骤:
(a)确定甘丙肽基因片段的SEQ ID NO:1所示序列的第53位SNP的核苷酸；
(b)检测在所述位置是否存在单核苷酸多态，即在第53位存在A/G(在序列表中标注为R)，在其DNA互补链上为T/C等位位点。
本发明的第二方面是提供一种分离核酸，具有SEQ ID NO:1所示的序列，且第53位为A/G。
本发明的第三个方面提供了一对特异性的核酸引物，具有SEQ ID NO:2或SEQ IDNO:3所示序列，且特异性地扩增出含甘丙肽基因部分序列的SEQ ID NO:1所示序列中第53位单核苷酸多态的扩增产物。
优选的核苷酸引物的序列如SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3所示，长度各为22bp，能特异性的扩增出SEQ ID NO:1所示的序列，该序列包含rs694066单核苷酸多态位点。
本发明的第四个方面还提供了一种抑郁症易感人群进行遗传筛查试剂盒。
该试剂盒是利用高温连接酶实现对基因多态性位点的识别。其原理为高温连接酶一旦检测到DNA与互补的两条寡聚核苷酸接头对应处存在着基因点突变类型的碱基错配，则连接反应就不能进行。如图1所示右边的探针与模板有一个碱基不配对，所以连接反应不能进行，没有连接产物；左边的探针与模板DNA完全互补，故进行连接反应。通过温控循环该特异性连接反应可反复进行，达到线性扩增的效果。
所述试剂盒还包括用于PCR扩增反应的试剂和用于连接酶反应试剂，其中PCR扩增试剂是由分离包装的上下游引物、无MgCl2的缓冲液、DNA聚合酶、MgCl2、dNTP和水组成，其中引物的序列为:
上游引物:5'-TTTCGCGAGCTATCCAAAG-3' (SEQ ID NO:2)
下游引物:5'-GTCCAGCCTCGTTTTTCCTT-3' (SEQ ID NO:3)
连接酶检测反应试剂是由分离包装的探针、连接缓冲液、连接酶和去离子水组成，其中探针序列为:
rs694066_modify:5'-
P-GGCATGGCAGAGGACTTAGAACAATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-FAM-3 ' ， SEQ IDNO:4，其Y端磷酸化，3'端标记有5 (6)-羧基荧光素(FAM)；
rs694066_A:5'-
TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGAATGGGTGCACCCAGGCTTTCCT-3' , SEQ ID NO:5 ；
rs694066_G:5;-
TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGAATGGGTGCACCCAGGCTTTCCC-3'，SEQIDN0:6。
试剂盒检测rs694066SNP位点的步骤如下:
1.样本基因组DNA的提取:按照常规 的DNA提取方法进行DNA提取；
2.目的基因片段(包含SEQ ID NO:1所示序列)的PCR扩增；
3.连接酶反应检测rs694066位点多态性。
上述试剂盒检测rs694066位点多态性的结果判定及原理:当rs694066多态性位点基因型为AG时，其分型截图如图2双峰图所示，当rs694066多态性位点基因型为GG时，其分型截图如图2双峰图所示单峰图所示。其原理是上述设计的探针rs694066_A*度上比探针rs694066_G多2个碱基，所以通过检测连接酶反应产物的大小，就可知样本rs694066位点的基因型。通过上述试剂盒检测rs694066位点基因型时，如果连接酶反应的产物有大小两种片段，那rs694066位点的基因型为AG ;当只有一种产物的情况下，如产物片段较小时，rs694066位点的基因型为AA，如产物片段较大时，rs694066位点的基因型为GG，大产物片段比小产物片段多两个碱基；所以当连接产物即既包括较大片段和较小片段时，样本rs694066位点的基因型为AG，该样本个体就容易患抑郁症。利用本发明所提供的与抑郁症相关的多态位点的核酸序列，可构建对抑郁症易感人群进行遗传学筛选的试剂盒。
图1连接反应原理示意图；图2Genemapper对多态性位点rs694066的分型截图。
具体实施例方式通过参阅下述实施例可以更容易地了解本发明的内容，这些实施例只是为进一步说明本发明，并不意味着限定本发明的范围。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例一收集血 液样本及提取基因组DNA所有研究对象来自于2008年11月至2010年7月首都医科大学附属北京安定医院、北京大学第六医院、北京回龙观医院、湖南中南大学湘雅第二医院、河南省精神病院门诊和或住院患者和各中心周围的健康个体。所有受试者均进行SCID-1筛查。入组对象年龄均在18 60岁之间、汉族，排除重大躯体疾病者。甘丙肽基因多态性与抑郁症关联研究共纳入抑郁症患者700例，男性324例，女性376例)。对照组所有对照者均来自各研究分中心周围的、同期健康、汉族个体，年龄在18 60岁之间，排除有重大躯体疾病及精神障碍，纳入673例健康对照者(男性313例，女性360例)。本研究经过首都医科大学附属北京安定医院伦理学委员会批准。研究对象的资料收集、血样标本的采集均经过研究对象的同意，并签署知情同意书。所有患者抽取外周肘静脉血5mL，置于EDTA抗凝管中，-80°C保存，之后集中提取DNA。 DNA提取采用德国Macherey-Nage I公司DNA提取试剂盒。按照试剂盒说明书进行DNA提取步骤如下:200 μ L的全血中，加入25 μ L的蛋白酶K，再加入200 μ L Β3溶液，震荡20-30s，70°C水浴10-15min ;再加入210 μ L的无水乙醇，混匀后，移入提取柱内，11000g/min 离心 l_2min ;再加入 500 μ L Bff 液，11000g/min 离心 Imin ;再加入 600 μ L B5液，11000g/min离心Imin ；自然干燥提取柱,加入70°C的TE液,室温下静置lmin, IlOOOg/min离心Imin，提取DNA于溶液TE中，_80°C保存。利用紫外线分光光度计检测DNA标本的OD260 和 OD280, IOD260 相当于 50ng/ μ L 双链 DNA0 DNA 纯度在 1.7 2.0。实施例二 SNP的获得
通过既往文献及美国国立生物信息情报中心检索dbSNP (Datebase of singleNuleotide Polymorphisms,dbSNP)数据库(http://www.ncb1.nlm.nih.gov/SNP/)，以及国际HapMap数据库(http://www.hapmap.0rg/),根据SNP位点之间的连锁不平衡程度，在甘丙肽基因选取10个SNP位点在病例组和对照组中的频率分布情况进行了检测。PCR反应在PERKIN ELMER Gene Amp PCR system9600PCR扩增仪上进行。SNP 检测在 ABI PRISM377DNA序列检测仪上进行。
PCR反应体系及程序如下:
每份样品进行一个总体积为20 μ L体系的扩增反应，体系中包含制备的基因组DNA 稀释液 50ng，10 X Taq Buffer2 μ L, 20mM dNTP2 μ L, IOOmM MgCl2 0.6μ L,5U/y L TaqDNA聚合酶0.2 μ L，扩增引物各5pmol，最后加入ddH20将总体积配为20 μ L。PCR反应条件:95°C变性15min，35个循环，每个循环有3个温度，94°C 30s, 59°C lmin，72°C lmin，最后在72°C延伸7min。
扩增引物如下表所示:
表I各基因多态性位点引物序列及其长度 弓丨物序列(5’-3，)长度
权利要求
1.SEQ ID NO:1所示的部分甘丙肽基因的核苷酸序列中第53位核苷酸的A/G多态性序列在制备用于诊断女性抑郁症的试剂盒中的引物和/或探针的用途，所述多态性在NCBISNP Database 中的登记号为 rs694066。
2.一种女性抑郁症易感性遗传筛查试剂盒，其特征在于所述试剂盒由包括:PCR扩增试剂和连接酶反应试剂； 其中所述的PCR扩增试剂是由分离包装的上下游引物、无MgCl2的缓冲液、DNA聚合酶、MgCl2, dNTP和水组成，所述的上下游引物的序列为: 上游引物:5' -TTTCGCGAGCTATCCAAAAG-3' (SEQ ID NO:2) 下游引物:5' -GTCCAGCCTCGTTTTTCCTT-3' (SEQ ID NO:3) 其中连接酶反应试剂是由分离包装的探针、连接缓冲液、连接酶和去离子水组成，其中探针序列为:rs694066_modify:5'- P-GGCATGGCAGAGGACTTAGAACAATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-FAM-3'；rs694066_A:5'-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGAATGGGTGCACCCAGGCTTTCCT_3,;rs694066_G:5/ -TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGAATGGGTGCACCCAGGCTTTCCC_3,。
3.根据权利要求2所述的女性抑郁症易感性遗传筛查试剂盒，其特征在于，所述的探针rs694066_modify, 51端磷酸化,31端标记有5 (6)-羧基突光素(FAM)。
4.一种检测rs694066SNP位点的方法，具体步骤如下: 1)样品基因组DNA的提取:按照常规的DNA提取方法进行DNA提取； 2)目的基因片段的PCR扩增:扩增所用的上游引物的核苷酸序列为SEQID N0:2，下游引物的核苷酸序列为SEQ ID NO:3 ;目的基因PCR扩增条件:94°C预变性15min，94°C变性30s，62。。退火 lmin，72°C延伸 lmin，扩增 35 个循环，72°C延伸 IOmin ； 3)电泳检测扩增产物:利用普通1.5%琼脂糖电泳检测PCR产物的有无，扩增产物大小为 152bp ； 4)连接酶反应检测rs694066位点多态性: 4.1)对第3)步扩增出来的基因组片段进行连接酶检测反应检测rs694066位点多态性，配制连接反应体系:在PCR管中分别加入I μ L连接缓冲液(10X)，0.5yL连接酶，6.5 μ L去离子水，IuL探针混合物,所述探针混合物包括:rs694066_modify、rs694066_A、rs694066_G，其核苷酸序列分别为SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6 ;充分混匀后离心，最后再加入I μ L PCR反应产物； 4.2)连接酶反应在Perkin-Elmer Gene Amp PCR Systems9600PCR仪上进行，设置程序为:95°C变性2min，35个循环，每个循环有2个温度，94°C 30s, 60°C 2min。将PCR反应管放入PCR仪进行连接反应。
4.3)取I μ L步骤4.2)所得的连接产物与I μ L ABI GS-500R0X荧光标记分子量标准和I μ L去离子甲酰胺上样液混合，95°C加热变性2分钟，冰中骤冷，于5%聚丙烯酰胺和5mol/L尿素中3000V电泳2.5小时，应用GENESCAN 672软件进行数据收集、泳道线校正、迁移片段大小测量和校正内在分子量标准；应用Genemapper软件进行数据分析和基因分型。5)结果判定:当连接酶反应的产物有大小两种片段，那rs694066位点的基因型为AG ；当只有一种产物的情况下，如产物片段较小时，rs694066位点的基因型为AA，如产物片段较大时，rs694066位点的基因型为GG。
5.根据权利要求4所述的探针混合物,其特征在于,所述的探针为rs694066_modify、rs694066_么和 rs694066_G2间的摩尔比为 2:1:1。
全文摘要
本发明公开了一种甘丙肽基因的单核苷酸多态位点及其应用。本发明公开了一种与女性抑郁症相关的多肽位点，并根据该多态性位点设计了特异性的引物与探针。本发明还提供了一种利用设计的引物和探针检测该多态位点的方法。利用本发明提供的多态位点的核酸序列及其检测方法，可生产对女性抑郁症进行遗传学诊断的试剂盒，有助于抑郁症的预防、早期诊断和治疗。
文档编号C12N15/11GK103173542SQ20131005926
公开日2013年6月26日 申请日期2013年2月26日 优先权日2013年2月26日
发明者王永军, 王传跃, 徐志卿, 张志洋 申请人:首都医科大学附属北京安定医院