专利名称：一种检测与女性抑郁症相关的snp的pcr试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种甘丙肽基因单核苷多态性位点rs694066的多态性与女性的相关抑郁症的相关性，本发明还涉该多态位点的PCR检测试剂盒，以及该多态性位点在预防、辅助诊断与治疗女性抑郁症方面的用途。该发明属于生物技术领域。
背景技术：
抑郁症是发病率、致残性高，社会危害严重的精神障碍。大量研究认为抑郁症的病因复杂，涉及遗传、生化、心理和社会环境等多种因素。研究显示，单相抑郁的终生患病率在10%以上，且女性是男性的2倍左右。单核苷酸多态性(SNP)是指基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。SNP可以出现在基因调控区和编码区，出现在编码区的SNP可能改变基因的编码使蛋白中某个氨基酸发生改变而影响其功能；而出现在基因调控区的SNP则主要影响基因的表达。SNP作为一种稳定遗传的早期突变，与疾病有着密切的相关性。当一种SNP的频率在患者明显超过非患者时，即表明该SNP与疾病关联，通过比较分析两者的单倍型和研究连锁不平衡性，可将基因组中任何未知的致病基因定位。SNP在疾病基因定位中所发挥的作用主要包括:一是在疾病定位区域中寻找致病SNP，这种SNP的出现可能直接导致了基因转录水平上和翻译水平上的变化，即改变了基因表达量或者基因产物蛋白质的组成结构，从而导致某种疾病发生或使得个体对某种特殊的环境易感；二是SNP作为一个遗传标记，与疾病或表型紧密连锁。
甘丙肽是一个由定位于11号染色体上的甘丙肽基因编码的，30个氨基酸组成的多肽，广泛分布于中枢神经系统，通过与不同的受体结合表现出多种生理效应。多项文献显示，甘丙肽与单胺类递质和应激通路关系密切，具有调节中枢5-HT能和去甲肾上腺素能神经兀的活性和表达的作用[Mann JJ.The medical management of depression.N Engl JMed2005，353:1819-1834 ；Fomaro M， Prestia D， Colicchio S， Perugi G.A systematic,updated review on the antidepressant agomelatine focusing on its melatonergicmodulation.Curr Neuropharmaco1.2010,8(3):287-304]。同时，通过给予大鼠脑室内注射甘丙肽或其不同的受体激动剂或拮抗剂后能能影响大鼠的抑郁样行为[Bing 0，Moller C， Engel J.A， et al.Anxiolytic-like action of centrally administeredgalanin.Neurosci Lett.1993，164(1-2):17-20 ；Bartfai T，Lu X，Badie-Mahdavi H，etal.Galmic,a nonpeptide galanin receptor agonist，affects behaviors in seizure,pain，and forced-swim tests.Proc.Natl.Acad.Sc1.USA.2004,101(28): 10470-10475]。而且，甘丙肽受体拮抗剂M40可以阻断药氟西汀的抗抑郁效果[Lu XiBarr AMiKinney JW,et al.A role for galanin in antidepressant actions with a focus on the dorsalraphe nucleus.Proc Natl Acad Sci USA.2005，102 (3):874-879.]。因此，甘丙肽基因可能是抑郁症的一个易感基因。通过神经发育实验大鼠、绵羊的研究显示，甘丙肽的表达可能受到雌激素的调节，且甘丙肽在机体的含量具有性别两极性分布，即雌性动物体内含量显著高于雄性[Mitchell V,Bouret S,Prevot V,et al.Evidence for expression of galanin receptorGal-RlmRNA in certain gonadotropin releasing hormone neurones of the rostralpreoptic area.Journal of neuroendocrinology.1999,11:805-812]。Paul GU 等人通过对欧洲抑郁症患者和焦虑症患者研究也发现，甘丙肽基因多态性与女性患者的症状严重性密切相关，在男性患者未发现这种关联[43，44]。这一结果提示，甘丙肽可能是抑郁症患者尤其是女性患者的易感基因或女性抑郁症患者的保护性因素。但这一结果有待于进一步的证实。本研究通过对来自北京和河南两地的700例抑郁症患者和673例健康对照者进行甘丙肽基因10个SNPs位点基因分型检测，结果发现，整体样本中多态性位点rs694066位点与抑郁症高度关联；性别分层后，仅在女性样本中表现出高度关联，而男性患者无显著性关联。这一结果充分提示，甘丙肽基因可能是女性抑郁症的易感基因。经对现有国内外文献和专利检索，至今未见有任何甘丙肽基因多态性位点rs694066与女性抑郁症易感性相关的报道。
发明内容
本发明的目的就在 于揭示甘丙肽基因多态性位点与抑郁症的相关性，及其在检测抑郁症方面的用途。本发明的目的在于揭示甘丙肽基因的单核苷酸多态位点与女性抑郁症的易感性，以及该多态性位点在筛选女性抑郁症易感人群方面的用途。本发明通过对700例抑郁症患者(男性324例，女性376例)和673例健康对照者(男性313例，女性360例)的甘丙肽基因10个单核苷酸多态性位点的研究发现:甘丙肽基因SNP位点rs694066与抑郁症具有显著关联。抑郁症患者组甘丙肽基因的rs694066多态性位点基因型GG频率显著减少，AG型增多；抑郁症患者组rs694066等位基因G频率降低，A等位基因频率则升高。经过性别分层后，376例女性抑郁症患者和360例女性健康对照者纳入分析。结果显示，女性抑郁症患者组甘丙肽基因的rs694066多态性位点基因型GG频率显著减少，AG型增多；抑郁症患者组rs694066等位基因G频率降低，A等位基因频率则升高。对324例男性抑郁症患者与313例男性健康对照者分析结果显示，甘丙肽基因的多态性位点与疾病无显著性。本发明首先提供一种检测甘丙肽基因的单核苷酸多态性的方法，包括以下步骤:(a)确定甘丙肽基因片段的SEQ ID NO:1所示序列的第91位SNP的核苷酸；(b)检测在所述位置是否存在单核苷酸多态，即在第91位存在A/G(在序列表中标注为r)，在其DNA互补链上为T/C等位位点。本发明的第二方面是提供一种分离核酸，具有SEQ ID NO:1所示的序列，且第91位为A/G。本发明的第三个方面提供了一对特异性的核酸引物，具有SEQ ID NO:2或SEQ IDNO:3所示序列，且特异性地扩增出含甘丙肽基因部分序列的SEQ ID NO:1所示序列中第91位单核苷酸多态的扩增产物。优选的核甘酸引物的序列如SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3所示，长度各为22bp，能特异性的扩增出SEQ ID NO:1所示的序列，该序列包含rs694066单核苷酸多态位点。本发明的第四个方面还提供了一种抑郁症易感人群进行遗传筛查PCR试剂盒。该试剂盒基于等位基因特异性PCR(allele specific PCR，AS_PCR)检测甘丙肽基因rs694066位点多态性。该试剂盒是由分离包装的引物、无MgCl2的缓冲液、高保真DNA聚合酶、MgCl2、dNTP料和水组成，其中引物的序列为:上游引物:5'-TCATGTCAAATATAGCCGACTT-3' (SEQIDN0:2)；下游引物:5'·-AGAACCGTACACAGATCAAG-3' (SEQID NO:3)；rs694066_AF:5/ -GTTCTAAGTCCTCTGCCATGCCA-3' (SEQ ID NO:4);rs694066_AR:5/ -GGTCCAGCCTCGTTTTTCCT-3' (SEQ ID NO:5);rs694066_GF:5/ -GTTCTAAGTCCTCTGCCATGCCG-3' (SEQ ID NO:6)；rs694066_GR:5/ -ACGGGCAATGAGGTCAAGAG-3' (SEQ ID NO:7)。试剂盒检测rs694066SNP位点的具体方法如下:1.样品基因组DNA的提取:按照常规的DNA提取方法进行DNA提取；2.目的基因片段(包含SEQ ID NO:1所示序列)的PCR扩增:以样品基因组DNA为模板，用上、下游引物扩增目的基因片段；3.rs694066位点多态性检测:以第2步PCR扩增所得的基因片段为模板，分别以rs694066_A+rs694066_AR和rs694066_G+rs694066_GR引物对扩增多态性位点基因片段；4.结果判定:1.5%琼脂糖凝胶电泳检测片段大小，当扩增片段长度为125bp时rS694066位点的基因型为A，在其互补链上等位位点为T ;当扩增片段长度为283bp时rs694066位点的基因型为G，在其互补链上等位位点为C。利用本发明所提供的与抑郁症相关的多态位点的核酸序列，可构建对抑郁症易感人群进行遗传学筛选的试剂盒。本发明所述试剂盒使用方便，只需对扩增产物做琼脂糖凝胶电泳检测即可，无需测序，对于仪器的要求较低无需测序仪，检测所需时间较少。
图1Genemapper对多态性位点rs694066的分型截图。
具体实施例方式通过参阅下述实施例可以更容易地了解本发明的内容，这些实施例只是为进一步说明本发明，并不意味着限定本发明的范围。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例一收集血液样本及提取基因组DNA所有研究对象来自于2008年11月至2010年7月首都医科大学附属北京安定医院、北京大学第六医院、北京回龙观医院、湖南中南大学湘雅第二医院、河南省精神病院门诊和或住院患者和各中心周围的健康个体。所有受试者均进行SCID-1筛查。入组对象年龄均在18 60岁之间、汉族，排除重大躯体疾病者。甘丙肽基因多态性与抑郁症关联研究共纳入抑郁症患者700例，男性324例，女性376例)。对照组所有对照者均来自各研究分中心周围的、同期健康、汉族个体，年龄在18 60岁之间，排除有重大躯体疾病及精神障碍，纳入673例健康对照者(男性313例，女性360例)。本研究经过首都医科大学附属北京安定医院伦理学委员会批准。研究对象的资料收集、血样标本的采集均经过研究对象的同意，并签署知情同意书。所有患者抽取外周肘静脉血5mL，置于EDTA抗凝管中，_80°C保存，之后集中提取DNA。DNA提取采用德国Macherey-Nage I公司DNA提取试剂盒。按照试剂盒说明书进行DNA提取步骤如下:200 μ L的全血中，加入25 μ L的蛋白酶K，再加入200 μ L Β3溶液，震荡20-30s，70°C水浴10-15min ;再加入210 μ L的无水乙醇，混匀后，移入提取柱内，11000g/min 离心 l_2min ;再加入 500 μ L Bff 液，11000g/min 离心 Imin ;再加入 600 μ L B5液，11000g/min离心Imin ；自然干燥提取柱,加入70°C的TE液,室温下静置lmin, IlOOOg/min离心Imin，提取DNA于溶液TE中，_80°C保存。利用紫外线分光光度计检测DNA标本的OD260 和 OD280, IOD260 相当于 50ng/ μ L 双链 DNA0 DNA 纯度在 1.7 2.0。实施例二 SNP的获得通过既往文献及美国国立生物信息情报中心检索dbSNP (Datebase of singleNuleotide Polymorphisms,dbSNP)数据库(http://www.ncb1.nlm.nih.gov/SNP/)，以及国际HapMap数据库(http://www.hapmap.0rg/),根据SNP位点之间的连锁不平衡程度，在甘丙肽基因选取10个SNP位点在病例组和对照组中的频率分布情况进行了检测。PCR反应在PERKIN ELMER Gene Amp PCR system9600PCR 扩增仪上进行。SNP 检测在 ABI PRISM377DNA序列检测仪上进行。PCR反应体系及程序如下:每份样品进行一个总体积为20 μ L体系的扩增反应，体系中包含制备的基因组DNA 稀释液 50ng，10 X Taq Buffer2 μ L，20mmol/L dNTP2 μ L, IOOmmoI/L MgCl2 0.6μ L,5U/μ L Taq DNA聚合酶0.2 μ L ，扩增引物各5pmol，最后加入ddH20将总体积配为20 μ L15PCR反应条件:95°C变性15min，35个循环，每个循环有3个温度，94°C 30s, 59°C lmin，72°C lmin,最后在72°C延伸7min。扩增引物如下表所示:表I各各基因多态性位点引物序列及其长度引 物序列(5’-3，)长度
rs3136540GAAGCACCCTCTGCACAAGTGGGCCTTTTACGTTTCCAGT186bp
rs2513297TTCTGGAGCTGAAGGAGGAGGAGCCTAGAAGTGCCTGTGG227bp
rs2187331TTTCGAGTGCAAGCTGAGAATCCTCCTTCAGCTCCAGAAC233bp
rs2097042GGGAGGGGTCTTAGGAACAGCAGACTCTCATGGCGACTCA235bprs !546309GGGTGCATCAGTGACATGAGGTGCAGGAAAGGAAATGGAA195bp rs4432027GACCTCCCTCCTGTTTCACTAATGGCTGGACCTGCTTAAA182bp rs948854GACAGTGAGTCGCCATGAGAGGGCATGAGAGGACATCATT120bp rs2510387TCTGGATCATGGTGGGTGTAAGACGACAGCTTTCCACGAG224bp rs 1042577TGCATAAATTGGCCGAAGATCCTGTAGCATGTGTCGTGGT235bp rs694066GTCCAGCCTCGTTTTTCCTTTTTCGCGAGCTATCCAAAAG152bp看图分析软件ABIPR1SM sDS2.1 (ABI PRISM377 检测仪自带)。实施例三甘丙肽基因单核苷酸多肽性与抑郁症的相关性分析所有数据均米用社会科学统计软件SPSS16.0 (Statistical Packages for SocialSciencesl6.0)进行数据管理和一般人口学资料的统计分析。采用卡方检验对所有SNP位点基因型的频率分布进行分析，并分别进行Hardy-Weinberg遗传平衡检验(HWE)。各个SNP位点的检验功力使用 genetic power calculator (http://statgen.1op.kcl.ac.uk/gpc)软件计算，相关参数设置如下:罕见等位基因频率为0.02，患病率为0.10，基因型相对危险Aa = 2，AA = 2，D’ = 1，α = 0.05，样本遗传统计效力约为81%。甘丙肽等位基因与抑郁症发病关联分析采用Plink统计软件。两个SNP位点间的连锁不平衡检验，若D’值>0.7，则认为两个位点间存在较强的连锁不平衡；采用Haploview软件计算出连锁不平衡模块(LD block)。多个SNP位点等位基因组成的单倍型构建，以及单倍型与疾病的关联分析，单个单倍型检验采用“双等位基因”模式，总体单倍型采用“多等位基因”模式。单个SNP位点关联研究统计结果的多重见证采用Bonferroni校正即:Bonferroni校正P值=a /SNP位点数。单倍型分析结果采用permutation (η = 10000)置换检验进行校正。所有检验均取双侧检验，显著性水平取α =0.05。基因多态性位点间的交互分析采用Plink软件中单位点交互分析。采用Hardy-Weinberg平衡检验，对10个SNPs位点进行等位基因和基因型检验，甘丙肽基因的所有SNPs位点的等位基因和基因型均符合Hardy-Weinberg平衡(P >0.05)，见表 2。表2甘丙肽基因汉族人群SNP位点信息及HWE检验
权利要求
1.SEQ ID NO:1所示的部分甘丙肽基因的核苷酸序列中第91位核苷酸的A/G多态性序列在制备用于诊断女性抑郁症的试剂盒中的引物和/或探针的应用。
2.一种针对女性抑郁症易感人群进行遗传筛查PCR试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括:分离包装的引物、无MgCl2的缓冲液、高保真DNA聚合酶、MgCl2、dNTP料和水组成；其中分离包装的引物及其核苷酸序列如下: 上游引物:5' -TCATGTCAAATATAGCCGACTT-3' (SEQIDNO:2)； 下游引物:5' -AGAACCGTACACAGATCAAG-3' (SEQID NO:3)； rs694066_AF:5/ -GTTCTAAGTCCTCTGCCATGCCA-3' (SEQ ID NO:4)； rs694066_AR:5/ -GGTCCAGCCTCGTTTTTCCT-3' (SEQ ID NO:5)； rs694066_GF:5/ -GTTCTAAGTCCTCTGCCATGCCG-3' (SEQ ID NO:6)； rs694066_GR:5/ -ACGGGCAATGAGGTCAAGAG-3' (SEQ ID NO:7)。
3.权利要求2所述试剂盒在检测rs694066位点多态性的使用方法，包括以下步骤: 1)样品基因组DNA的提取:按照常规的DNA提取方法进行DNA提取； 2)目的基因片段的PCR扩增:以第I)步基因组DNA为模板，用上、下游引物扩增目的基因片段，所述上游引物的核苷酸序列为SEQ IDNO:2，所述下游引物的核苷酸序列为SEQIDNO:3 ;PCR扩增中各组分的用量为:浓度为50μπιΟ1上游引物和浓度为50μπιΟ1的下游弓丨物各0.5 μ mo I ;无的缓冲液2.5 μ L ；5U/ μ L的DNA聚合酶0.25 μ L ;浓度为2.5mmol的dNTP2y L ； IOOmmoI/L MgCl2 I μ L ;去离子水 17.75 μ L ;基因组 DNA 样本 L 5 μ L。目的基因PCR扩增条件:94°C预变性15min，94°C变性30s，55°C退火lmin，72°C延伸lmin，扩增35个循环，72°C延伸IOmin。
3)rs694066位点 多态性检测:以第2)步所得的基因片段为模板，分别以rs694066_A+rs694066_AR和rs694066_G+rs694066_GR引物对扩增多态性位点基因片段；PCR扩增中各组分的用量为:浓度为50μηιο1上游引物和浓度为50μηιο1的下游引物各0.5 μ L ;无Mg2+的缓冲液2.5 μ L ;尝试为5U/ μ L的DNA聚合酶0.25 μ L ;浓度为2.5mmol的dNTP2 μ L ；IOOmmoI/L MgCl2 I μ L 去离子水 17.75 μ L ;模板DNA2 μ L15PCR扩增条件:94°C 预变性 5min，94°C变性30s，62。。退火lmin，72°C延伸lmin，扩增35个循环，72°C延伸IOmin0 4)结果判定:1.5%琼脂糖凝胶电泳检测片段大小，当扩增片段长度为125bp时rs694066位点的基因型为A，在其互补链上等位位点为T ;当扩增片段长度为283bp时rs694066位点的基因型为G，在其互补链上等位位点为C。
全文摘要
本发明公开了一种检测与女性抑郁症相关的SNP的PCR试剂盒。本发明还提供了一种检测该多态位点及其与女性抑郁症易感性的方法。利用本发明提供的多态位点的核酸序列及其检测方法，分析人体的位于11q13.3区域甘丙肽基因上的常见型单核苷酸多态性位点rs694066的A等位位点，即在其DNA互补链上为T等位位点有无，来应用于抑郁症的辅助诊断和对个体是否具有抑郁症的易感性进行评判。从而有利于疾病的预防、早期诊断和治疗。
文档编号C12N15/11GK103146822SQ20131005926
公开日2013年6月12日 申请日期2013年2月26日 优先权日2013年2月26日
发明者王永军, 王立娜, 张勇辉, 葛洪敏, 王艳 申请人:天津市安定医院