专利名称：一种测定重组人胶质细胞源性神经营养因子活性的细胞学方法
技术领域：
本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及一种测定重组人胶质细胞源性神经营养因子活性的细胞学方法。
背景技术：
帕金森病，由Parkinson(1817)首先描述，是一种常见的中老年人神经系统变性疾病，帕金森病是老年人中第四位最常见的神经变性疾病，在> 65岁的人群中，1%患有此病，在> 40岁的人群中则为0.4%，本病也可在儿童期或青春期发病。白种人发病率最高，其次是黄种人。H)是一终身性疾病，迄今为止尚无根治的方法一旦患病则需要终身治疗，由于手术治疗价格昂贵而且有严格的手术指征，而基因治疗和干细胞治疗尚处于研究阶段，因而药物治疗仍是目前治疗H)的主要方法。
胶质细胞源性神经营养因子(glialcell line-derived neurotrophic factor,GDNF)的神经营养作用主要是通过其两类受体亚基介导，即胶质细胞源性神经营养因子受体alpha (GFRots)亚基和受体酪氨酸激酶Ret亚基。GFRots亚基靠其C端的磷酯酰肌醇键(GPI)锚定在细胞膜的外表面，属膜外蛋白，不能直接转导信号。GDNF首先与GFRa I受体结合形成⑶NF-GFRotl复合物，此复合物再与Ret结合形成三聚体复合物，引起Ret的二聚化，并引起酪氨酸残基自磷酸化，从而引起下游的信号转导，发挥GDNF的生理作用。
体内外的许多实验研究均证明⑶NF可以促进中脑黑质多巴胺能神经元，颅神经和脊髓运动神经元，脑干的去甲肾上腺素能神经元，基底前脑胆碱能神经元，背根神经节，交感神经元的存活。⑶NF在这些不同环境中的表达对于其在神经变性性疾病研究及治疗有着重要的意义。直接将GDNF注入脑内到H)动物模型的黑质纹状体系统内，可改善这些模型动物的行为学症状及其黑质纹状体系统多巴胺能神经元的存活率。所以，GDNF以H)为适应症，潜在的治疗对象还包括坐骨性神经痛、周围神经损伤后造成的慢性神经痛、其它神经退行性疾病以及男性生殖干细胞疾病，因此具有广泛的社会效益和巨大的经济效益。
但是目前并没有一种能够有效的对重组人胶质细胞源性神经营养因子(rh⑶NF)活性进行检测的细胞学方法。发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种测定重组人胶质细胞源性神经营养因子活性的细胞学方法，从而消除上述背景技术中缺陷。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案是:
一种测定重组人胶质细胞源性神经营养因子活性的细胞学方法，包括如下步骤:
S1、构建表达质粒pcDNA3.1-hGFRa 1，然后用转染法制备稳定表达hGFR a I的HEK293 细胞；
S2、构建表达质粒pcD NA3.Ι-hRET，然后以步骤SI中制备的稳定表达hGFR a I的HEK293细胞为基础，用转染法制备能够同时稳定表达hGFRa I和hRET以及荧光素酶报告系统的HEK293细胞；
S3、将待测rh⑶NF加入到步骤S2得到的同时稳定表达hGFRa I和hRET以及荧光素酶报告系统的HEK293细胞中，培养后测定荧光强度Fl ;同时设置没有加入所述待测rh⑶NF的空白对照组，培养后测定荧光强度F2 ；
S4、将F1、F2进行比较，若Fl > F2，则说明待测的rh⑶NF具有活性；若Fl ( F2，则说明待测的rhGDNF不具有活性。
作为一种改进，步骤SI中，以pcDNA3.1_为表达载体，利用限制内切酶XhoI和Not I将载体线性化，再用T4DNA连接酶将hGFR a IcDNA连接至pcDNA3.1中，构建表达质粒pcDNA3.1-hGFRa I。
作为一种进一步的改进，步骤SI中，转染法的详细步骤为:
A、把2μ g pcDNA3.1-hGFR a I加入到110μ I Opt1-MEM培养基中，轻轻混匀后放置室温备用；
B、加 15μ I 的 Lipofectamine (DNA 转染试剂)M 150 μ I Opt1-MEM 培养基中，轻轻混匀后放置室温备用；
C、将步骤A和·步骤B的液体混合,得到DNA-Lipofectamine混合物；
D、将步骤C得到的DNA-Lipofectamine在室温(25°C )放置30分钟；
E、然后加320 μ I Opt1-MEM培养基到步骤D的DNA-Lipofectamine混合物中，轻轻混匀备用；
F、用2ml Opt1-MEM培养基洗HEK293细胞一次，然后取500 μ I步骤E的DNA-Lipofectamine混合物，加入到ΗΕΚ293细胞中；
G、在37°C、5% 二氧化碳的细胞培养箱中培养5小时，然后去掉上清液，留下贴壁生长的HEK293细胞，换上新鲜配置的3ml DMEM培养液，且所述DMEM培养液中含体积百分比为10%的胎牛血清、以及总重为lwt%的青霉素、链霉素、谷氨酸、非必需氨基酸,在37°C、5% 二氧化碳的细胞培养箱中培养24小时；
H、当细胞在培养皿底部的覆盖率达到80%后，用生理盐水清洗细胞，并加入新鲜配制的含G418的选择性DMEM培养基对已转染的细胞基因组中插入了 hGFRa I基因的阳性细胞进行筛选，所述选择性DMEM培养基中含体积百分比为10%的胎牛血清、总重为lwt%的青霉素、链霉素、谷氨酸和非必需氨基酸，以及500 μ g/ml的G418 ;两周后,得到稳定表达hGFRa I 的 HEK293 细胞。
作为一种改进，步骤S2中，以pcDNA3.1_为表达载体，利用限制内切酶XhoI和NotI将载体线性化，再用T4DNA连接酶将hRET cDNA连接至pcDNA3.1-载体中，构建表达质粒为 pcDNA3.1-hRETο
作为一种进一步的改进，步骤S2中，转染法的详细步骤为:
A、把 2 μ g pcDNA3.1-hRET 加入到 110 μ I 含有 0.75 μ g pFR-Luc (荧光素酶报告基因载体)、0.25yg pFA2-Elkl (信号通路报告载体)的Opt1-MEM培养基中，轻轻混匀后放置室温备用；
B、加 15μ I 的 Lipofectamine (DNA 转染试剂)M 150 μ I Opt1-ΜΕΜ 培养基中，轻轻混匀后放置室温备用；
C、将步骤 A 和步骤 B 的 DNA-Lipofactamine 液体混合，得到 DNA-Lipofectamine混合物；
D、将步骤C得到的DNA-Lipofectamine混合物在室温(25°C )下放置30分钟；
E、然后加320 μ I Opt1-MEM培养基到步骤D的DNA-Lipofectamine混合物中，轻轻混匀；
F、用2ml Opt1-MEM培养基洗步骤SI得到的具有pcDNA3.1-hGFR α I的ΗΕΚ293稳定细胞株一次，然后取500 μ I步骤E的DNA-Lipofectamine混合物，加入到ΗΕΚ293细胞中；
G、在37°C 5% 二氧化碳的细胞培养箱中培养5小时，然后去掉上清液，换上新鲜配制的3ml DMEM培养液，且所述DMEM培养液中含体积百分比为10%的胎牛血清、以及总重为lwt%的青霉素、链霉素、谷氨酸、非必需氨基酸，在温度为37°C、5% 二氧化碳的培养箱中培养24小时；
H、当细胞在培养皿底部的覆盖率达到80%后，用3ml磷酸盐缓冲液清洗细胞，然后加入Iml胰蛋白酶将细胞悬浮，收集并离心后，去掉上清液，并加入适量体积的Opt1-MHM培养基，且所述Opt1-MEM培养基中含有体积百分比为0.5%的胎牛血清、以及总重为lwt%的青霉素、链霉素、谷氨酸、非必需氨基酸，使细胞浓度为2xl05个/ml，在37°C、5%二氧化碳的细胞培养箱中培养16个小时。
作为一种改进，步骤S3中，将待测的rh⑶NF配成浓度为1.0 83.3ng/ μ I的待测溶液，并将所述待测溶液加入到步骤S2得到的同时表达hGFRa I和hRET以及荧光素酶报告系统的HEK293细胞中，在37°C 5% 二氧化碳的细胞培养箱中培养16小时后，然后室温放置20分钟，将在室温平衡后的萤光素酶 检测试剂底物100 μ I (Promaga货号Ε1483)加入到ΗΕΚ293细胞中，混匀后立即用荧光读板仪(Wallacl420Work Station Victor PlateReader)测定荧光强度Fl ;同时设置没有加入所述待测溶液的空白对照组，相同条件培养后测定荧光强度F2。
由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是:
本发明能够有效测定重组人胶质细胞源性神经营养因子(rh⑶NF)活性，测定结果准确可靠。
图1是本发明的rh⑶NF剂量-反应关系曲线图。
具体实施方式
为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。
实施例1
一种测定重组人胶质细胞源性神经营养因子活性的细胞学方法，包括如下步骤:
S1、以pcDNA3.1_为表达载体，利用限制内切酶XhoI和Not I将载体线性化，再用T4DNA连接酶将hGFRa IcDNA连接至pcDNA3.1中，构建表达质粒pcDNA3.1-hGFR a 1，然后用转染法制备表达hGFRa I的HEK293细胞，详细步骤为:
A、把2μ g pcDNA3.1-hGFRa I加入到110μ I Opt1-MEM培养基中，轻轻混匀后放置室温备用；
B、加 15μ I 的 Lipofectamine (DNA 转染试剂)M 150 μ I Opt1-MEM 培养基中，轻轻混匀后放置室温备用；
C、将步骤 A 和步骤 2Β 的 DNA-Lipofactamine 液体混合，得到 DNA-Lipofectamine混合物；
D、将步骤C得到的DNA-Lipofectamine在室温(25°C )放置30分钟；
E、然后加320 μ I Opt1-MEM培养基到步骤D的DNA-Lipofectamine混合物中，轻轻混匀备用；
F、用2ml Opt1-MEM培养基洗HEK293细胞一次，然后取500 μ I步骤E的DNA-Lipofectamine混合物，加入到ΗΕΚ293细胞中；
G、在37°C、5% 二氧化碳的细胞培养箱中培养5小时，然后去掉上清液，留下贴壁生长的HEK293细胞，换上新鲜配置的3ml DMEM培养液，且所述DMEM培养液中含体积百分比为10%的胎牛血清、以及总重为“1:%的青霉素、链霉素、谷氨酸、非必需氨基酸,在37°C、5% 二氧化碳的细胞培养箱中培养24小时；
H、当细胞在培养皿底部的覆盖率达到80%后，用生理盐水清洗细胞，并加入新鲜配制的选择性DMEM培养基对已转染的细胞基因组中插入了 hGFRa I基因的阳性细胞进行筛选，所述选择性DMEM培养基中含体积百分比为10%的胎牛血清、总重为lwt%的青霉素、链霉素、谷氨酸和非必需氨基酸，以及500 μ g/ml的G418 ;两周后，得到稳定表达hGFR a I的HEK293细胞。
S2、以pcDNA3.1_为表达 载体，利用限制内切酶XhoI和Not I将载体线性化，再用T4DNA连接酶将hRET连接至pcDNA3.1-载体中，构建表达质粒为pcDNA3.1-hRET,然后以步骤SI中制备的表达hGFRa I的HEK293细胞为基础，用转染法制备能够同时表达hGFR a I和hRET以及荧光素酶报告系统的HEK293细胞，详细步骤为:
A、把 2 μ g pcDNA3.1-hRET 加入到 110 μ I 含有 0.75 μ g pFR-Luc (荧光素酶报告基因载体)、0.25yg pFA2-Elkl (信号通路报告载体)的Opt1-MEM培养基中，轻轻混匀后放置室温备用；
B、加 15μ I 的 Lipofectamine (DNA 转染试剂)M 150 μ I Opt1-MEM 培养基中，轻轻混匀后放置室温备用；
C、将步骤 A 和步骤 B 的 DNA-Lipofactamine 液体混合，得到 DNA-Lipofectamine混合物；
D、将步骤C得到的DNA-Lipofectamine混合物在室温(25°C )下放置30分钟；
E、然后加320 μ I Opt1-MEM培养基到步骤D的DNA-Lipofectamine混合物中，轻轻混匀；
F、用2ml Opt1-MEM培养基洗步骤SI得到的具有pcDNA3.1-hGFR α I的ΗΕΚ293稳定细胞株一次，然后取500 μ I步骤E的DNA-Lipofectamine混合物，加入到ΗΕΚ293细胞中；
G、在37°C 5% 二氧化碳的细胞培养箱中培养5小时，然后去掉上清液，换上新鲜配制的3ml DMEM培养液，且所述DMEM培养液中含体积百分比为10%的胎牛血清、以及总重为lwt%的青霉素、链霉素、谷氨酸、非必需氨基酸，在温度为37°C、5% 二氧化碳的培养箱中培养24小时；
H、当细胞在培养皿底部的覆盖率达到80%后，用3ml磷酸盐缓冲液清洗细胞，然后加入Iml胰蛋白酶将细胞悬浮，收集并离心后，去掉上清，并加入适量体积的Opt1-MHM培养基，且所述Opt1-MEM培养基中含有体积百分比为0.5%的胎牛血清、以及总重为lwt%的青霉素、链霉素、谷氨酸、非必需氨基酸，使细胞浓度为2xl05个/ml，在37°C 5% 二氧化碳的细胞培养箱中培养16个小时。
S3、将待测的rh⑶NF配成浓度为42.2ng/ μ I的待测溶液，并将所述待测溶液加入到步骤S2得到的同时表达hGFRa I和hRET以及荧光素酶报告系统的HEK293细胞中，在370C 5% 二氧化碳的细胞培养箱中培养16小时后，然后室温放置20分钟，将在室温平衡后的萤光素酶检测试剂底物100 μ I (Promaga货号E1483)加入到HEK293细胞中，混匀后立即用荧光读板仪(Wallacl420Work Station Victor Plate Reader)测定荧光强度Fl ;同时设置没有加入所述待测溶液的空白对照组，相同条件培养后测定荧光强度F2。
S4、将F1、F2进行比较，发现Fl > F2，则说明待测的rh⑶NF具有活性。
实施例2
其他步骤与实施例1相同，不同的是，步骤S3中将待测的rhGDNF配成浓度为1.0ng/μ I的待测溶液。
结果:将F1、F2进行比较，发现Fl与F2基本相等，则说明待测的rh⑶NF不具有活性。
实施例3
其他步骤与实施例1、2相同，不同的是，步骤S3中将待测的rhGDNF配成浓度为83.3ng/ μ I的待测溶液。
结果:将F1、F2进行比较，发现Fl < F2，则说明待测的rh⑶NF不具有活性。
对比实施例
其他步骤与实施例1、2、3相同，不同的是，步骤S3中将有活性的rh⑶NF (储备液浓度为250 μ g/μ I)进行100倍稀释。然后对稀释后rh⑶NF的再进行1:3倍比稀释。测定rh⑶NF的终浓度范围为0-250ng/y I共8个浓度，依次为250,83.3,27.8,9.3,3.1、1.0,0.3,Ong/ μ I。将上述各浓度的rh⑶NF加入到上述细胞中，并设置空白对照(未加入rh⑶NF)以及阴性对照组(细胞未转染pcDNA3.Ι-hRET)。在37°C 5% 二氧化碳的细胞培养箱中培养16小时后，从37°C 5% 二氧化碳的细胞培养箱中取出，室温放置20分钟。将在室温平衡后的萤光素酶检测试剂底物100 μ I (Promaga货号E1483)加入到细胞中，混匀后立即用 96 孔突光读板仪(Wallacl420Work Station Victor Plate Reader)测定突光强度，并绘制rhGDNF剂量-反应关系曲线图，如图1所示。
从图中可以明显发现，当rh⑶NF的浓度为1.0 83.3ng/ μ I时，其相对荧光单位明显的大于空白对照组，当rh⑶NF的浓度超过83.3ng/yl时，两者的差值基本不再增加。
本发明不局限于上述具体实施方式
，一切基于本发明的技术构思，所作出的结构上的改进，均落入本发明的保护范围之中。
权利要求
1.一种测定重组人胶质细胞源性神经营养因子活性的细胞学方法，其特征在于:包括如下步骤: 51、构建表达质粒PCDNA3.1-hGFRa 1，然后用转染法制备稳定表达hGFRa I的HEK293细胞； 52、构建表达质粒pcDNA3.1-hRET，然后以步骤SI中制备的稳定表达hGFRa I的HEK293细胞为基础，用转染法制备能够同时稳定表达hGFR a I和hRET以及荧光素酶报告系统的HEK293细胞； 53、将待测rh⑶NF加入到步骤S2得到的同时稳定表达hGFRa I和hRET以及荧光素酶报告系统的J1EK293细胞中，培养后测定荧光强度Fl ;同时设置没有加入所述待测rhGDNF的空白对照组，培养后测定荧光强度F2 ； 54、将F1、F2进行比较，若Fl> F2，则说明待测的rh⑶NF具有活性；若Fl ≤F2，则说明待测的rh⑶NF不具有活性。
2.如权利要求1所述的一种测定重组人胶质细胞源性神经营养因子活性的细胞学方法，其特征在于:步骤SI中，以pcDNA3.1-为表达载体，利用限制内切酶Xho I和NotI将载体线性化，再用T4DNA连接酶将hGFRa IcDNA连接至pcDNA3.1中，构建表达质粒pcDNA3.1-hGFRa I。
3.如权利要求2所述的一种测定重组人胶质细胞源性神经营养因子活性的细胞学方法，其特征在于:步骤SI中，转染法的详细步骤为: A、把2μgpcDNA3.1-hGFRa I加入到110μl Opt1-MEM培养基中，轻轻混匀后放置室温备用; B、加15μl的Lipofectamine至150μl Opt1-MEM培养基中，轻轻混匀后放置室温备用； C、将步骤A和步骤B的液体混合,得到DNA-Lipofectamine混合物； D、将步骤C得到的DNA-Lipofectamine在室温放置30分钟； E、然后加320u l Opt1-MEM培养基到步骤D的DNA-Lipofectamine混合物中，轻轻混勾备用； F、用2mlOpt1-MEM培养基洗HEK293细胞一次，然后取500 μl步骤E的DNA-Lipofectamine混合物，加入到HEK293细胞中； G、在37°C、5%二氧化碳的细胞培养箱中培养5小时，然后去掉上清液，留下贴壁生长的HEK293细胞，换上新鲜配置的3ml DMEM培养液，且所述DMEM培养液中含体积百分比为10%的胎牛血清、以及总重为lwt%的青霉素、链霉素、谷氨酸、非必需氨基酸,在37°C、5% 二氧化碳的细胞培养箱中培养24小时； H、当细胞在培养皿底部的覆盖率达到80%后，用生理盐水清洗细胞，并加入新鲜配制的含G418的选择性DMEM培养基对已转染的细胞基因组中插入了 hGFRa I基因的阳性细胞进行筛选，所述选择性DMEM培养基中含体积百分比为10%的胎牛血清、总重为1被％的青霉素、链霉素、谷氨酸和非必需氨基酸，以及500 μ g/ml的G418 ;两周后，得到稳定表达hGFRa I 的 HEK293 细胞。
4.如权利要求1所述的一种测定重组人胶质细胞源性神经营养因子活性的细胞学方法，其特征在于:步骤S2中，以pcDNA3.1-为表达载体，利用限制内切酶XhoI和Not I将载体线性化，再用T4DNA连接酶将hRET cDNA连接至pcDNA3.1-载体中，构建表达质粒为pcDNA3.1-hRETο
5.如权利要求4所述的一种测定重组人胶质细胞源性神经营养因子活性的细胞学方法，其特征在于:步骤S2中，转染法的详细步骤为:A、把2 μ g pcDNA3.1-hRET 加入到 110 μ I 含有 0.75 μ g pFR_Luc、0.25 μ g pFA2_Elkl的Opt1-MEM培养基中，轻轻混匀后放置室温备用； B、加15μ I的Lipofectamine至150 μ I Opt1-MEM培养基中，轻轻混匀后放置室温备用； C、将步骤A和步骤B的液体混合,得到DNA-Lipofectamine混合物； D、将步骤C得到的DNA-Lipofectamine混合物在室温下放置30分钟； Ε、然后加320 μ I Opt1-MEM培养基到步骤D的DNA-Lipofectamine混合物中，轻轻混匀； F、用2mlOpt1-MEM培养基洗步骤SI得到的具有pcDNA3.1-hGFR α I的ΗΕΚ293稳定细胞株一次，然后取500 μ I步骤E的DNA-Lipofectamine混合物，加入到ΗΕΚ293细胞中； G、在37°C、5%二氧化碳的细胞培养箱中培养5小时，然后去掉上清液，换上新鲜配制的3ml DMEM培养液，且所述DMEM培养液中含体积百分比为10%的胎牛血清、以及总重为lwt%的青霉素、链霉素、谷氨酸、非必需氨基酸，在温度为37°C、5% 二氧化碳的培养箱中培养24小时； H、当细胞在培养皿底部的覆盖率达到80%后，用3ml磷酸盐缓冲液清洗细胞，然后加入Iml胰蛋白酶将细胞 悬浮，收集并离心后，去掉上清液，并加入Opt1-MEM培养基，且所述Opt1-MEM培养基中含有体积百分比为0.5%的胎牛血清、以及总重为lwt%的青霉素、链霉素、谷氨酸、非必需氨基酸，使细胞浓度为2xl05个/ml，在37°C、5% 二氧化碳的细胞培养箱中培养16个小时。
6.如权利要求1 5任一项所述的一种测定重组人胶质细胞源性神经营养因子活性的细胞学方法，其特征在于:步骤S3中，将待测的rh⑶NF配成浓度为1.0 83.3ng/ μ I的待测溶液，并将所述待测溶液加入到步骤S2得到的同时表达hGFRa I和hRET以及荧光素酶报告系统的HEK293细胞中，在37°C、5% 二氧化碳的细胞培养箱中培养16小时后，然后室温放置20分钟，将在室温平衡后的萤光素酶检测试剂底物100 μ I加入到ΗΕΚ293细胞中，混匀后立即用荧光读板仪测定荧光强度Fl ;同时设置没有加入所述待测溶液的空白对照组，相同条件培养后测定荧光强度F2。
全文摘要
一种测定重组人胶质细胞源性神经营养因子活性的细胞学方法,包括如下步骤构建表达质粒pcDNA3.1-hGFRα1，然后制备稳定表达hGFRα1的HEK293细胞；构建表达质粒pcDNA3.1-hRET，再制备能够同时表达hGFRα1和hRET以及荧光素酶报告系统的HEK293细胞；将待测rhGDNF加入到同时表达hGFRα1和hRET以及荧光素酶报告系统的HEK293细胞中，培养后测定荧光强度F1；同时设置没有加入待测rhGDNF的空白对照组，培养后测定荧光强度F2；将F1、F2进行比较。本发明能够有效测定重组人胶质细胞源性神经营养因子(rhGDNF)活性，测定结果准确可靠。
文档编号C12Q1/02GK103146798SQ201310059658
公开日2013年6月12日 申请日期2013年2月25日 优先权日2013年2月25日
发明者曹杰 申请人:潍坊易思特生物科技有限公司