专利名称：两种耐Ag+和SDS木聚糖酶的制作方法
技术领域：
:本发明涉及两种耐Ag+和SDS木聚糖酶，属于生物技术领域。
背景技术：
:木聚糖是植物半纤维素的重要组成之一，大约占植物总糖的1/3，是自然界中仅次于纤维素的第二大最丰富的可再生物质资源。广义的木聚糖酶是指能够降解半纤维素木聚糖一组酶的总称，包括内切β_1，4-木聚糖酶、外切β-1，4_木聚糖酶、木聚糖酶，还包括a-L-阿拉伯呋喃糖苷酶、α-葡萄糖苷酶、乙酰木聚糖脂酶、苯酚酸脂酶，其中以β-1,4-木聚糖酶和木聚糖酶最为重要。β-1,4-木聚糖酶是降解半纤维素最主要的酶，该酶以内切方式作用于木聚糖主链内部的β_ 1，4-木糖苷键，使木聚糖降解为短链的低聚木糖，并有少量木糖生成；β_木聚糖酶则作用于短链的低聚木糖，通过催化低聚木糖的末端来释放木糖残基，二者共同作用能将木聚糖降解成单糖。木聚糖酶能够从微生物、植物和动物中获得，其中微生物是木聚糖酶的主要来源。目前，已报道的分泌木聚糖酶的微生物有丝状真菌、芽孢杆菌属、曲霉属、木霉属、链霉菌属、放线菌和其他一些微生物，如放线菌主要有Streptomyces lividans、Thermobifidafusca 等；细菌主要有 Bacillus subtilis、Pseudomonas fluorescents 等；真菌主要有Aspergillus niger、Aspergillus nidulans、Cryptococcus sp.S_2、Trichoderma reese1、Penicillium sp.40。目前国内外对木聚糖酶的研究已比较深入,包括菌种的筛选、产酶的诱导、酶的分离纯化及易源表达、酶学性质研究等。由于极端微生物在某些苛刻条件下(如高温、偏酸、偏碱、高盐等)生长稳定性好，并且在工业生产中与来自普通环境微生物相比不易被污染。因此近些年来，来自极端环境如嗜热、嗜酸、嗜碱等特殊生境微生物引起越来越多的关注，而且研究的也已经较多。但是对嗜盐这一特殊生境的微生物的研究相对还比较少，目前已经报道的仅有Halorhabdusutahensis (Wain0 and Ingvorsen 2003)、halophilic strain CL8 (ffejse et al.2003)、Nesterenkonia sp.(Govender et al 2009)、 Glaciecola mesophila KMM 241 (Guo etal 2009) Bacillus sp.NTU-06 (Wang et al.2010) > Chromohalobacter sp.TPSV 101(Prakasha et al.2012) >Bacillus halodurans PPKS-2 (Prakash et al.2012)。对嗜盐微生物的研究，不仅在学术上能够解释酶耐受盐的机制原理也为在分子水平上克隆新酶提供了理论和材料，而且由于嗜盐微生物产生的木聚糖酶具有耐受高盐、不易污染、能耐受较广的PH(6.0-10.0)范围，并且在温度高于60°C仍保持较高的酶活力，因此在含盐量高的工业生产及污水处理方面有着广泛的潜在应用价值。不同来源微生物的木聚糖酶在分子量、等电点、pH耐受、温度耐受等方面差异各不相同。一般而言，分子量在8KDa 145KDa、等电点为3 10之间均有分布。细菌和真菌来源的木聚糖酶，其最适作用温度一般在40°C 60°C，多数细菌和放线菌所产木聚糖酶的最适反应温度在50°C 60°C。不同微生物来源的木聚糖酶有比较广泛的pH值范围，pH值为
.3.0 10.0时基本都是稳定的，其最适作用pH值为4.0 7.0。一般来说，真菌来源的木聚糖酶属于酸性木聚糖酶，最适pH值为4.0 6.0，细菌和放线菌木聚糖酶属中性或碱性木聚糖酶，其最适pH值为6.0 8.0。工业上，木聚糖酶作为生物试剂在食品饮料、饲料、造纸、医药、能源、生物转化等工业中具有重要作用。如专利号为CN102732496A公开了一种木聚糖酶，在面包烘烤中有很明显的应用效果；CN102640858A公开了一种含有木聚糖酶的多功效复合酶制剂，能提高饲料的消化率和转化率，减低霉素和毒素的有害作用，提高动物抗病能力。木聚糖酶已经广泛的应用于造纸业，其重要性主要在于能部分取代有毒的化学物质(例如氯及含氯化合物)的使用，减轻对环境的污染，也能够缩短纸浆的处理时间，改善漂白效果。但由于目前大多数微生物产生的木聚糖酶存在着稳定性差、产量低、工业应用成本高等缺陷，限制了它的工业化应用，因而，对木聚糖酶的开发与研究就显得十分必要了
发明内容
:本发明的目的在于提供两种耐Ag+和SDS木聚糖酶。本发明米用的链单抱菌属 Μ 90494CStreptomonospora sp.YIM 90494),于 2012年12月28日保存于中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址:中国武汉武汉大学，邮编430072，保藏号:CCTCC N0.M 2012556。本发明的两种耐Ag+和SDS木聚糖酶用保藏号为:CCTCC N0.M 2012556的链单孢菌属 Μ 90494 (Streptomonospora sp.YIM 90494)经大量发酵、70% 硫酸铵沉淀、Hiprep26/60层析柱> Hiprep QXL 26/60层析柱、Hipr印FF 26/60层析柱四步纯化步骤得到，其分子量分别为18KDa、50KDa ;酶活反应最适温度均为55°C，最适反应pH值均为7.5，在PH4.0-11.0范围内酶活稳定，且Ag+和SDS对两种酶具有激活作用。本发明的两种耐Ag+和SDS的木聚糖酶经如下分离纯化方法得到:
1.粗酶液的制备:将Streptomonospora sp.YIM 90494接入液体 Μ 38#培养基中，在37°C的条件下振荡培养4-5天作为种子液，以10%菌液转接于液体发酵培养基中，在37°C培养15天，将发酵液离心，取上清，滤纸过滤，得粗酶液；2.在粗酶液中加硫酸铵至70%饱和度，4°C放置过夜；1200rpm/min离心30min取沉淀，溶解在pH8.0、50mM Tris-HCl缓冲液中；3.将酶液1200rpm/min离心IOmin,收集上清，上样于已平衡好的Hiprep 26/60层析柱、强阴离子柱Hiprep QXL 26/60层析柱、弱阴离子柱Hiprep FF 26/60层析柱,收集有木聚糖活性的透过峰部分；4.将两种有活性的酶液于pH8.0、50mM Tris-HCl缓冲液中透析过夜并离心取上清，分别上样于用pH8.0、50mM Tris-HCl缓冲液平衡好的Hipr印QXL 26/60层析柱，用pH8.0,0.5M硫酸铵的50mM Tris-HCl缓冲液洗脱，收集木聚糖有活性的透过部分；5.将两种有活性的酶液于pH9.0、50mM Tris-HCl缓冲液中透析过夜并离心取上清，分别上样于用pH9.0、50mM Tris-HCl缓冲液平衡好的Hipr印FF 26/60层析柱，用pH9.0,0.5M硫酸铵的50mM Tris-HCl缓冲液洗脱，收集木聚糖有活性的透过部分，即为纯酶液；在步骤I)中的所说的发酵培养基的组成:NaCl100g
Yeast extract4g
Malt extract 5g
Avicel 1g加水定容至1L，调节pH至7.2 ; 121°C灭菌30 min。本发明的两种耐Ag+和SDS木聚糖酶聚糖酶酶学性质如下:(一)、18KDa木聚糖酶酶学性质:1.链单孢放线菌 Μ 90494产木聚糖酶最适酶活温度为55°C。2.链单孢放线菌YM 90494产木聚糖酶在60°C保温I小时，还能保持70%以上的酶活力；当温度超过70°C时，酶活力下降很快，在70°C保温40min酶活力下降近80%，在80°C保温60min，酶基本失活。3.链单孢放线菌属YM 90494产木聚糖酶最适反应pH为7.5，在ρΗ4.0-10.0范围酶活力仍保持在60%以上，说明了该酶具有较广的pH适应性。4.Ag+、Ca2+、Na+、Al3+、Ba2+对链单孢放线菌YM 90494所产木聚糖酶有激活作用，Li+、K+、Mg2+、Ni2+、Zn2+、Fe3+和对酶作用不明显，Cd3+、Co2+、Pb2+、Cu2+对酶有显著的抑制作用。5.变性剂SDS对链单孢放线菌YM 90494所产木聚糖酶有明显的促进作用，鳌合剂EDTA和丝氨酸蛋白酶专一抑制剂苯甲基磺酰氟化物(PMSF)对链单孢放线菌YM 90494所产木聚糖酶有明显的抑制作用，表明了木聚糖酶对金属离子有依赖性且其活性中心含有丝氨酸。DTT经常作为添加的保护剂使用，防止二硫键的形成，DTT对链单孢放线菌 Μ90494所产木聚糖酶有明显的抑制作用。(二)、50KDa木聚糖酶酶学性质:1.链单孢放线菌 Μ 90494产木聚糖酶最适酶活温度为55°C。2.链单孢放线菌YM 90494产木聚糖酶在60°C保温2个小时，还能保持43%以上的酶活力；当温度超过70°C时，酶活力下降很快，在70°C保温40min酶活力仅剩近32%，在80°C保温60min，酶活力下降了 95%。3.链单孢放线菌YM 90494产木聚糖酶最适反应pH为7.5，在pH小于4或大于11时酶活力较低，在ρΗ4.0-11.0范围酶活力仍保持在57%以上。 4.Ag+、Ca2+、Li+、Mg2+、Ni2+、K+、Na+、Ba2+ 对链单孢放线菌 YM 90494 所产木聚糖酶有激活作用，Mn2+、Cd3+、Co2+、Pb2+对酶有一定的抑制作用，Al3+、Zn2+、Cu2+、Fe3+对酶有明显的抑制作用。6.变性剂SDS对链单孢放线菌YIM 90494产木聚糖酶有微弱的促进作用，DTT对酶有明显的抑制作用，鳌合剂EDTA和丝氨酸蛋白酶专一抑制剂苯甲基磺酰氟化物(PMSF)对木聚糖酶有明显的抑制作用，表明了木聚糖酶对金属离子有依赖性且其活性中心含有丝氨酸。两种耐Ag+和SDS木聚糖酶的优点是:
1、链单孢放线菌 Μ 90494产生两种耐Ag+和SDS木聚糖酶最适温度均为55°C，在60°C仍具有较高的酶活力。2、链单孢放线菌 Μ 90494产两种耐Ag+和SDS木聚糖酶在较广的pH(4.0-11.0)范围内具有较高的酶活力，且大部分金属离子对两种酶没有明显的抑制作用。综合以上两点，嗜盐链单孢放线菌 Μ 90494产两种耐Ag+和SDS木聚糖酶在造纸、能源转化、污水处理等方面有很好的应用前景。
:图1、18KDa木聚糖酶:图Ι-a是链单孢放线菌YM 90494产木聚糖酶的反应温度和相对活性的关系曲线。图Ι-b是链单孢放线菌 Μ 90494产木聚糖酶的反应pH和相对活性的关系曲线。图Ι-c是链单孢放线菌 Μ 90494产木聚糖酶的热稳定性曲线。图Ι-d是链单 孢放线菌YIM 90494产木聚糖酶的pH稳定性曲线。图Ι-e是链单孢放线菌 Μ 90494产木聚糖酶的金属离子耐受性曲线。图Ι-f是链单孢放线菌 Μ 90494产木聚糖酶的有机试剂耐受性曲线。图2、5OKDa木聚糖酶:图2-a是链单孢放线菌YM 90494产木聚糖酶的反应温度和相对活性的关系曲线。图2-b是链单孢放线菌 Μ 90494产木聚糖酶的反应pH和相对活性的关系曲线。图2-c是链单孢放线菌YIM 90494产木聚糖酶的热稳定性曲线。图2-d是链单孢放线菌YIM 90494产木聚糖酶的pH稳定性曲线。图2-e是链单孢放线菌YM 90494产木聚糖酶的金属离子耐受性曲线。图2-f是链单孢放线菌YIM 90494产木聚糖酶的有机试剂耐受性曲线。
具体实施方式
:实施例1:木聚糖酶的最适反应温度I准确称取2g的桦木木聚糖，溶解于200mL的50mM pH8.0 Tris-HCl缓冲液中。2取上述底物溶液分装于28个Eppendorf管中，每管80 μ I。其中7管为测定管，另外21管为对照管，分别置于25、35、45、55、65、75和85°C等11个不同的温度下平衡30mino3加入20 μ I的稀释酶液，以灭活的酶液为对照。4反应30min。反应结束后，迅速加入DNS终止反应。5沸水浴反应5min。6在波长为540nm处测其吸光度。以活力最高的那个温度下所测得的酶活为参照，其余温度下所测得的酶活与其相对比，以相对酶活绘制酶催化温度曲线。实施例2:木聚糖酶的最适反应pHI准确称取0.50g的桦木木聚糖。溶解于50ml不同pH值的12种缓冲液中，所用到的缓冲液有:50mM的pH4.0,4.5,5.0,5.5,6.0,6.5,7.0,7.5的柠檬酸-磷酸二氢钠缓冲液，50mM 的 pH 7.5、8.0、8.5、9.0Tris-HCl 缓冲液、50mM 的 ρΗ9.0、9.5,10.0,10.5 的甘氨
酸-氢氧化钠缓冲液。2取上述底物溶液分装于64个Eppendorf管中(每种pH值4管),每管80 μ I。其中16管为测定管,另外48管为对照管,置于55°C水浴平衡20min。3加入20 μ I的稀释酶液，以灭活的酶液为对照。4反应30min。反应结束后，迅速加入DNS终止反应。5沸水浴反应5min。6在波长为540nm处测其吸光度。以活力最高的那个pH下所测得的酶活为参照，其余PH下所测得的酶活与其相对比，以相对酶活绘制酶催化PH曲线实施例3:金属离子及有机试剂对酶活力的影响I准确称取2g的桦木木聚糖，溶解于200mL的50mM pH8.0 Tris-HCl缓冲液中。2取上述底物溶液分装于80个Eppendorf管中，每管80 μ I。其中60管为测定管，另外20管为对照管，置于55°C温度下平衡30min。3 配置 50mM 的含有不同金属离子的溶液(Al3+、Zn2+、Cu2+、Fe3+、Mn2+、Cd3+、Co2+、Pb2+、Ag+、Ca2+、Li+、Mg2+、Ni2+、K+、Na+、Ba2+)及 10% 的 SDS、DTT、PMSF、EDTA04取70 μ I ρΗ8.0 Tris-HCl缓冲液装于若干个Eppendorf中，加入20 μ I的稀释酶液，最后加入10μ I含有不同金属离子和有机试剂的溶液(以等体积的缓冲液代替金属离子为对照)，使金属离子的终浓度为10mM，有机试剂终浓度为1%。5从每管中取20 μ I加入到在55°C温度下平衡30min的木聚糖溶液底物，反应30min。反应结束后，迅速加入DNS终止反应。6沸水浴反应5min。7在波长为540nm处测其吸光度。以未处理所测得的酶活力为参照，含有不同金属离子和有机试剂所测得的酶活力与其相对比， 以相对酶活力表示金属离子和有机试剂对酶活力的影响。
权利要求
1.两种耐Ag+和SDS木聚糖酶，其特征在于该两种耐Ag+和SDS木聚糖酶从保藏号为:CCTCC N0.M 2012556 的链单孢放线菌属菌株(Sti^ptomonospora sp.)YIM 90494 发酵液中产生，其分子量分别为18KDa、50KDa ;酶活反应最适温度均为55°C，最适反应pH值均为7.5，在pH4.0-11.0范围 内酶活稳定，且Ag+和SDS对两种酶具有激活作用。
全文摘要
本发明涉及两种耐Ag+和SDS木聚糖酶，属于生物技术领域。该两种耐Ag+和SDS木聚糖酶从保藏号为CCTCC NO. M 2012556的链单孢放线菌属菌株(Streptomonospora sp.)YIM 90494发酵液中产生，其分子量分别为18KDa、 50KDa；酶活反应最适温度均为55℃，最适反应pH值均为7.5，在pH4.0-11.0范围内酶活稳定，且Ag+ 和SDS对两种酶具有激活作用。本发明提供的两种耐Ag+和SDS木聚糖酶在造纸、洗涤剂、环保、食品、医药、能源转化、饲料工业中将具有广阔的应用前景。
文档编号C12N9/42GK103215240SQ20131005967
公开日2013年7月24日 申请日期2013年2月26日 优先权日2013年2月26日
发明者李文均, 任万增, 杨心意, 张峰, 唐蜀昆 申请人:云南大学