一种双活性木聚糖降解酶工程菌及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及应用微生物技术领域，具体涉及一种双活性木聚糖降解酶工程菌，以 及该困在制备低聚木糖中的应用。 技术背景
[0002] 低聚木糖又称木寡糖，由2?7个木糖以β-1，4-糖苷键连接而成，以木二糖，木 三糖为主。各项研究表明，低聚木糖，尤其是木二糖，具有显著的双歧杆菌增殖能力，不被消 化性，无龋齿性以及促进人体对钙的吸收等特性，因此，低聚木糖作为一种新型功能性低聚 糖成为食品工业研究开发的热点之一。
[0003] 目前低聚木糖生产方法包括：酸水解法、热水抽提、霉菌深层发酵和酶法等，木聚 糖酶水解法是低聚木糖生产的主要方法，即将玉米芯用氢氧化钠溶液浸提，然后用酸中和、 过滤，滤液经过处理后直接添加木聚糖酶来制备低聚糖。但是，在玉米芯，甘蔗渣和秸杆 等农林废弃物中约94%的半纤维素是阿拉伯糖葡萄糖醛酸木聚糖，这类木聚糖是一条以 β -1，4糖苷键相联的木聚糖主链，上面带有1，3-阿拉伯糖或1，2-4-0-甲基葡萄糖醛酸构 成的侧枝，尤其是4-0-甲基葡萄糖醛酸侧枝，无论是草类，软木还是硬木来源的木聚糖，其 均中含有，这些侧链的存在妨碍了木聚糖酶对木聚糖底物糖苷键的水解[9-10]，研究表明， 木聚糖酶和α -葡萄糖醛酸酶具有协同水解作用，不仅能加速低聚糖的产生，而且能使酶 解产物中带有葡萄糖醛酸侧枝的大片段得到有效水解，提高低聚木糖的产量和纯度。但是2 种酶的大量制备势必带来能耗和成本的增加，因此，构建一种双活性木聚糖降解酶工程菌， 使其既产α -葡萄糖醛酸酶又产木聚糖酶，不仅提高酶水解活性，而且简化酶制备和水解 操作步骤，成为获得更高效降解秸杆木聚糖和价格低廉的生物催化剂的途径。目前尚未见 报道。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种双活性木聚糖降解酶工程菌，以及该菌在制备低聚木糖 中的应用。
[0005] 本发明的一种双活性木聚糖降解酶工程菌，是将木聚糖酶和α-葡萄糖醛酸酶 基因分别置于不同表达盒下，通过优化翻译起始区使其高效表达而构建得到共表达载体 pET-28a-xynB-aguA，并转化大肠杆菌宿主细胞后获得的重组菌。
[0006] 其中所述的共表达载体pET-28a-xynB_aguA是将木聚糖酶基因及其表达元件和 翻译起始区序列SEQ : ID NO. 1或3和α-葡萄糖醛酸酶基因及其表达元件和翻译起始区序 列 SEQ :ID NO. 2 或 4,分别在 Xba I /Xho I，Stul/Xhol 位点插入 pET-28a 而获得。
[0007] 本发明还公开了所述的双活性木聚糖降解酶工程菌在用木聚糖制备低聚木糖中 的应用。
[0008] 上述应用，具体是利用所述的双活性木聚糖降解酶工程菌产生的双活性木聚糖降 解酶的粗酶液水解木聚糖底物制备低聚木糖。
[0009] 所述的木聚糖底物，是从农林废弃物、食品加工的下脚料中提取的木聚糖中任何 一种，或农林废弃物汽瀑液。
[0010] 双活性木聚糖降解酶水解木聚糖底物的反应条件：温度65-90°C，pH5-8。
[0011] 本发明利用基因重组技术将极端嗜热袍菌属（Thermotiga)的木聚糖酶（XynB) 和α-葡萄糖醛酸酶（AguA)基因连接到大肠杆菌（E. coli)表达载体pET_28a ( + )上，且 分别置于不同表达盒下，并通过利用优化翻译起始区使木聚糖酶和α-葡萄糖醛酸酶高 效生产的引物，其序列如SEQ :ID NO. 5、ID NO. 6、ID NO. 7和ID NO. 8所示，构建得到表达 载体pET-28a-xynB-aguA，转化大肠杆菌E. coli JM109(DE3)后获得重组工程菌E. coli JM109(DE3)/pET-28a-xynB-aguA ;该菌在含有30-50μ g/mL卡那霉素抗性的LB培养基中 30°C温度培养至对数生长期，经异丙基硫代半乳糖苷（IPTG)或乳糖和37-42°C诱导培养可 获得高效表达的双活性木聚糖降解酶；进一步利用所得的双活性木聚糖降解酶对木聚糖的 降解表现出比单一木聚酶更高效率，且所得酶解液中木二糖的含量和纯度更高。
[0012] 本发明通过因重组技术将性能优良的极端嗜热袍菌属（Thermotiga)的木聚糖酶 (XynB)和α-葡萄糖醛酸酶（AguA)基因分别置于不同表达盒下并通过优化翻译起始区二 级结构进行独立共表达获得双活性木聚糖降解酶，不仅能提高酶水解木聚糖的活性，而且 可简化酶制备和水解操作步骤，降低生产成本低；所得到的双活性木聚糖降解酶对木聚糖 降解获得木二糖含量和纯度更高的低聚木糖，这不仅排除了供体菌共生的其他一系列酶系 的干扰，而且相对单一木聚糖酶，具有转化效率高，反应副产物少，产物分离和纯化容易等 优点。
【附图说明】
[0013] 图1重组工程菌Ε. coli JM109(DE3)/pET-28a-xynB-aguA在不同诱导时间和诱导 剂浓度下的粗酶液SDS-PAGE图谱
[0014] M :蛋白分子量标样；1:空载对照；2:优化前对照；3 :诱导培养6h的细胞上清液； 4 :诱导培养8h的细胞上清液；5 :诱导IOh的细胞上清液，6 :50mM IPTG下诱导的的细胞上 清液；7 :100mM IPTG下诱导的细胞上清液；8 :800mM IPTG下诱导的细胞上清液。
[0015] 图2重组工程菌E. coli JM109(DE3)/pET-28a-xynB-aguA在不同诱导温度下的粗 酶液SDS-PAGE图谱和XynB/AguA比例分析
[0016] M :蛋白分子量标样；1，7, 10 :空载对照；2, 3:在37°C诱导条件的全细胞液和细胞 上清液；4 :空载对照；5, 6 :在39°C诱导条件的全细胞液和细胞上清液；8, 9 :在41 °C诱导条 件的全细胞液和细胞上清液；11，12 :在42°C诱导条件的全细胞液和细胞上清液
[0017] 图3双活性木聚糖降解酶和单一木聚糖酶水解桦木木聚糖的还原糖释放量
[0018] 图4双活性木聚糖降解酶和单一木聚糖酶水解桦木木聚糖的TLC图谱1:木二糖 标样；2, 11:木糖标样；3-6:单一木聚糖酶水解桦木木聚糖水解桦木木聚糖1、2、4、8小时 的酶解液；7-10:双活性木聚糖降解酶水解桦木木聚糖1、2、4、8小时的酶解液。
【具体实施方式】
[0019] 以下是本该发明的具体实施例，但本发明的内容并不仅局限于此。
[0020] 实施例1:
[0021] 根据海栖热袍菌Thermotiga maritima的木聚糖酶B (XynB)基因（TM0070)序列 设计引物，其序列具体是：
[0022] 5' -TGCTCTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACAATGAGT
[0023] CAGAATGTAAGCTTGAGAGAACTCGCGGAAAAGCTGAACATCTATATTGG-3'（SEQ ID NO. 5)和 5, -CGGCTCGAG AGGCCTCAAAAAACCCCTCAAGA
[0024] CCCGTTTA