专利名称：：重金属污染甘蔗汁酵母发酵生产乙醇的方法
技术领域：
：本发明属于生物能源
技术领域：
，具体公开了一种重金属污染甘蔗汁酵母发酵生产乙醇的方法。
背景技术：
：酒精的生产方法可分为化学合成法和微生物发酵法两种。化学合成法是指利用石油或则天然气的裂解气、工矿企业的废气以及电石等原料，经过化学反应生成酒精的方法，包括乙烯水合法和乙醛加氢法等方法；微生物发酵法是指利用淀粉质、糖质或者纤维质原料，通过微生物发酵作用生成酒精的方法，简称发酵法，普遍采用酵母菌作为发酵菌。微生物发酵法根据其原料的不同，生成的发酵酒精可分为淀粉质原料酒精、糖质原料酒精、纤维质原料酒精、亚硫酸盐纸浆废液酒精等。糖质原料酒精主要是利用糖蜜生产，糖蜜是甘蔗或甜菜糖厂制糖过程中的一种副产物，可分为甘蔗糖蜜和甜菜糖蜜。我国南方各省如广东、广西、福建、四川和台湾等省都是利用甘蔗糖蜜生产酒精。利用甘蔗糖蜜直接生产酒精，其技术已经是相当的成熟。但直接利用甘蔗汁生产酒精的技术报道很少，直接利用甘蔗汁生产酒精对菌种耐受酒精的要求很高，乙醇酵母的筛选有相当技术难度。同时，目前利用边缘化土壤种植非良作物甘蔗并生产燃料乙醇，具有很高的现实意义和应用前景，通过在矿区栽培甘蔗用于生产能源酒精是解决"能源与人争粮"和"能源与人争地"的好办法。这种"能源甘蔗"受重金属(包括铜、锌、镉、铅等)污染，不能用来制糖，也就没有产生糖蜜副产物这一过程，要求利用甘蔗汁直接生产乙醇。如前所述，在甘蔗汁尤其是受重金属污染的甘蔗汁中直接生产乙醇，对菌种的耐受重金属方面要求更加严格，所以，通过筛选获得适于重金属土壤能源甘蔗蔗汁发酵制备燃料乙醇的酵母菌种，是实现利用"能源甘蔗"汁直接发酵生产乙醇产生能源、提高产率关键。目前用甘蔗压榨生产的蔗汁直接发酵制备燃料乙醇，已见相关报道；但在重金属污染土壤种植的能源甘蔗有其特殊性——含有重金属离子，利用这种甘蔗榨汁生产乙醇遇到了非常多的技术难题。直接影响了重金属污染土地种植能源甘蔗的推广应用。
发明内容本发明的目的是克服现有利用甘蔗汁发酵生产乙醇技术的不足，筛选得到适合于甘蔗汁发酵生产乙醇的酵母，并提供所述酵母在手重金属污染甘蔗(能源甘蔗)汁发酵生产乙醇方面的应用。本发明的另一个目的是提供一种重金属污染甘蔗汁酵母发酵生产乙醇的方法。本发明的目的通过以下技术方案予以实现提供酵母菌S.serevisiae1384或S.serevisiae1347在利用受重金属污染的能源甘蔗汁生产乙醇方面的应用。所述的应用更为优选的是酵母菌为S.serevisiae1347。本发明同时提供了一种重金属污染甘蔗汁酵母发酵生产乙醇的方法，应用酵母S.serevisiae1384或S.serevisiae1347进行重金属污染甘蔗汁发酵生产乙醇，所述发酵方法包括以下步骤(1)菌种的活化及扩大培养；(2)取无重金属污染的甘蔗汁，往甘蔗汁中加入氮源，调节pH值至3.84.2得到种子液培养基，将步骤(1)活化的菌种接种于种子液培养基，摇床培养制备得到种子液；(3)向受重金属污染的甘蔗汁(能源甘蔗汁)中加入氮源，调节pH值，灭菌处理得到发酵液；(4)将培养于种子液的菌种接入发酵液中；接种后的发酵液用保鲜膜封口，静置发酵至成熟。上述步骤(1)菌种的活化是在超净工作台内按1:20的比例将酵母S.serevisiae1347或S.serevisiae1384加到装有无菌水的三角瓶中，然后在恒温水浴锅中35°C38t:复水活化30min60min，活化完成，待活化好的酵母液冷却至3(TC左右，将其接入麦芽汁常规斜面培养基，在3(TC条件下扩大培养12天得到菌种；步骤(2)所述氮源优选尿素，按照无重金属污染的甘蔗汁的重量的0.08%0.10%加入尿素，用甘蔗汁重量的0.30.5X的磷酸将pH值调节至3.84.2得到种子液培养基。将活化后的菌种一环接种于种子液培养基，于283(TC摇床培养3648小时得种子液。步骤(3)所述氮源优选尿素，按照受重金属污染的甘蔗汁原液重量的O.1%0.5X加入尿素，用磷酸将pH值调至3.33.6，9(TC灭菌1小时得到发酵液；按照接种量为10%将培养于种子液的菌种接入发酵液中；接种后的发酵液用保鲜膜封口，于3032t:静置发酵40小时以上，摇动没有C02产生即成熟。能源甘蔗总氮含量较低，发酵前添加氮源，不需要添加玉米浆。添加氮源后充分搅拌使其溶解，可以选择柠檬酸铵、硫酸铵等作为氮源，本发明优选的氮源是尿素。本发明通过大量的实验总结得到，采用本发明方法的适当酸度环境。适当的酸度环境可抑制其它杂菌的生长，有利于本发明选用酵母的生长繁殖，因此，在加入适量的氮源后，利用磷酸调节甘蔗汁的pH值至适宜数值。发酵指标测定方法(1)发酵液残糖的测定过滤发酵液，加入HC1溶液水解，调节pH至中性。以DNS法测定残糖量。(2)发酵液乙醇含量测定将少量发酵液12000rpm、4t:冷冻离心5分钟，吸取上清液，以气相色谱测量酒精成分。通过残糖含量和乙醇含量来计算菌种的糖转化率和发酵率。(3)菌体重金属含量测定将发酵后的发酵液经初步过滤后离心，将离心后得到的菌体用浓硝酸和高氯酸酸解后于原子吸收光谱测定重金属含量。本发明具有以下有益效果(1)本发明通过筛选合适的酵母、甘蔗汁的预处理方法及发酵工艺中pH值、发酵时间、温度等条件的精确、严格确定，得到完整的技术方案，筛选得到耐受重金属的、高乙醇发酵性能的酵母菌实现受重金属污染的甘蔗汁发酵生产乙醇，从而使得通过在矿区栽培甘蔗用于生产能源酒精更为实际可行。(2)本发明技术稳定周密，简单易行；(3)本发明提供了酵母S.serevisiae1384或S.serevisiae1347在以重金属污染甘蔗汁为原料生产乙醇方面的新应用，经过实验发现上述酵母耐受性好，乙醇产率高。图1利用本发明技术生产乙醇路线示意图具体实施例方式下面结合具体实施例来进一步详细说明本发明。实施例1酵母菌的筛选及发酵实验(1)选择常规的S.cerevisiae1827、S.cerevisiae1693、S.cerevisiae1425、S.cerevisiae1347、S.cerevisiae1384进行活化培养在超净工作台内按l:20的比例将上述酵母分别加到装有无菌水的三角瓶中，然后在恒温水浴锅中35t:复水活化60min，活化完成，待活化好的酵母液冷却至3(TC左右，将其接入麦芽汁斜面培养基，在3(TC条件下培养2天得到菌种；(2)以无污染的甘蔗汁按甘蔗汁重量的0.08%加入尿素，按甘蔗汁重量的0.3%加入磷酸，调节PH值至3.8左右，得到种子液培养基，将活化后的菌种接种一环于种子液培养基，于28t:摇床培养48小时得种子液。(3)以含锌、铜、镉、铅等重金属含量较高的韶关大宝山为试点，取矿山污染区种植的粤糖94-128甘蔗榨汁，在甘蔗汁中加入0.1%的尿素，用磷酸把pH值调至3.6，9(TC灭菌l小时。将培养于种子液的所有菌种接入发酵液中，接种量为10%。将接种后的发酵液用保鲜膜封口，3032t:静置发酵40小时以上，摇动没有C02产生即成熟。(4)发酵结果测定方法1发酵液残糖的测定过滤发酵液，加入HC1溶液水解，调节pH至中性。以DNS法测定残糖量。2发酵液乙醇含量测定将少量发酵液12000rpm、4t:冷冻离心5分钟，吸取上清液，以气相色谱测量酒精成分。通过残糖含量和乙醇含量来计算菌种的糖转化率和发酵率。菌体重金属含量测定将发酵后的发酵液经初步过滤后离心，将离心后得到的菌体用浓硝酸和高氯酸酸解后于原子吸收光谱测定重金属含量。采用上述方法测量各菌种发酵后的发酵液糖转化率，菌体重金属的含量，结果见表l:表1各菌种发酵后的发酵液糖转化率和菌体重金属的含量<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>通过比较分析得到，S.cerevisiae1384和S.cerevisiae1347具有很好的乙醇发酵效率，更为优良的的是S.cerevisiae1347。实施例3应用S.cerevisiae1384生产乙醇的试点实验如附图1所示，酵母菌经活化扩大培养后接种于能源甘蔗汁中进行发酵得到含酒精的发酵液，发酵液检验合格后经过常规的蒸馏脱水(常规技术，图中未标出)可得到燃料酒精成品。能源甘蔗汁的压榨、过滤和澄清采用常规技术。具体操作步骤如下(1)菌种S.cerevisiae1384的活化方法同时实施例1或2;(2)取无重金属污染的甘蔗汁，按照甘蔗汁重量的0.09X加入尿素，调节pH值至4，得到种子液培养基，将步骤(1)活化的菌种接种于一环于种子液培养基，于283(TC摇床培养38小时得种子液；(3)取含锌、铜、镉、铅等重金属含量较高矿山污染区种植的粤糖94-128甘蔗榨汁，其中含锌5.24mg/L、铜1.08mg/L、镉0.21mg/L、铅2.05mg/L。在甘蔗汁中加入0.1%的尿素，用磷酸调节PH值至3.6，9(TC灭菌1小时得发酵液；(4)将培养于种子液的菌种S.cerevisiae1384接入发酵液中，接种量为种子液占发酵液的10%。将接种后的发酵液用保鲜膜封口，3032t:静置发酵40小时以上，摇动没有C02产生即成熟。发酵完毕后，测得发酵液中乙醇体积分数为8.9%。实施例4应用S.cerevisiae1347生产乙醇的试点实验(1)菌种S.cerevisiae1347的活化方法同时实施例1或2;(2)取无重金属污染的甘蔗汁，按照甘蔗汁重量的0.08X加入尿素，调节pH值至3.8左右，得到种子液培养基，将步骤(1)活化的菌种接种于一环于种子液培养基，于283(TC摇床培养40小时得种子液；(3)取含锌、铜、镉、铅等重金属含量较高矿山污染区种植的粤糖94-128甘蔗榨汁，其中含锌65.72mg/L、铜0.25mg/L、镉0.12mg/L、铅2.05mg/L，按照甘蔗汁重量的中0.2%往甘蔗汁中加入尿素，用磷酸把pH值调至3.6，9(TC灭菌1小时得发酵液；(4)将培养于种子液的菌种S.cerevisiae1347接入发酵液中，接种量为种子液占发酵液的10%。将接种后的发酵液用保鲜膜封口，3032t:静置发酵40小时以上，摇动没有C02产生即成熟。发酵完毕后，测得发酵液中乙醇体积分数为10.5%。权利要求酵母S.serevisiae1384或S.serevisiae1347在重金属污染甘蔗汁酵母发酵生产乙醇方面的应用。2.酵母S.serevisiae1347在重金属污染甘蔗汁酵母发酵生产乙醇方面的应用。3.—种重金属污染甘蔗汁酵母发酵生产乙醇的方法，其特征在于包括以下步骤(1)酵母S.serevisiae1384或S.serevisiae1347菌种的活化及扩大培养；(2)取无重金属污染的甘蔗汁，往甘蔗汁中加入氮源，调节pH值至3.84.2得到种子液培养基，将步骤(1)活化的菌种接种于种子液培养基，摇床培养制备得到种子液；(3)向受重金属污染的甘蔗汁中加入氮源，调节pH值，灭菌处理得到发酵液；(4)将培养于种子液的菌种接入发酵液中；接种后的发酵液用保鲜膜封口，静置发酵至成熟。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于步骤(2)所述氮源为尿素，按照无重金属污染的甘蔗汁的重量的0.08%0.10%加入；用甘蔗汁重量的0.30.5%的磷酸将pH值调节至3.84.2。5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于步骤(2)所述摇床培养是于283(TC培养3648小时。6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于步骤(3)所述氮源为尿素，按照受重金属污染的甘蔗汁原液重量的0.1%0.5%加入。7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于步骤(3)所述pH值调至3.33.6;所述灭菌处理是在9(TC灭菌1小时。8.根据权利要求3所述的方法，其特征在于步骤(4)所述接种量为10%。9.根据权利要求3所述的方法，其特征在于步骤(4)静置发酵是于3032t:静置发酵40小时以上。全文摘要本发明公开了重金属污染甘蔗汁酵母发酵生产乙醇的方法。本发明具体提供了酵母S.serevisiae1384或S.serevisiae1347在利用受重金属污染的甘蔗汁发酵制备乙醇方面的应用，并提供了利用受重金属污染的甘蔗汁生产乙醇的方法。本发明实现了利用能源甘蔗汁直接发酵生产乙醇，从而使得通过在矿区栽培甘蔗用于生产能源酒精更为实际可行。文档编号C12P7/08GK101698857SQ20091019369公开日2010年4月28日申请日期2009年11月6日优先权日2009年11月6日发明者冯蕾,徐宁,徐晓立,朱睿,罗思施,谢君,陈国涛,陈晓阳申请人:华南农业大学