四碳醇的发酵生产的制作方法

专利名称：：四碳醇的发酵生产的制作方法
技术领域：
：本发明涉及工业微生物学和醇类生产的领域。更具体地，通过重组微生物的工业发酵来产生异丁醇。
背景技术：
：丁醇是重要的工业化学物质，用作燃料添加剂，塑料工业中的原料化学物质以及食品和香料工业中的食品级萃取剂。每年通过石油化学方法产生100至120亿磅的丁醇，并且对这种曰用化学物质的需求很可能增加。异丁醇化学合成的方法是已知的，如氧化合成，一氧化碳的催化氬化((7//膨ww:sEwqyc/o/e(iza。/iWw血a/C/ze/mW^,第6版，2003,Wiley-VCHVerlagGmbHandCo.,Weinheim，Germany,Vol.5,pp.716-719)以及甲醇和n-丙醇的Guerbet缩合(Carlini等，丄A/o/.Cafa/.A-215-220(2004))。这些方法使用源自石油化学，并且通常是昂贵的，环境不友好的原料。从植物产生的原料生产异丁醇将最小化温室气体释放并将表示本领域中的进展。异丁醇是作为酵母发酵的副产物通过生物产生的。它是作为通过该组真菌不完全代谢氨基酸的结果形成的"杂醇油"的组分。从L-缬氨酸的分解代谢特异性地产生异丁醇。作为氮源收集L-缬氨酸的胺基后，通过所谓的Ehrlich途径将所得到的a-酮酸脱羧基并还原成异丁醇(Dickinson等，丄肠/.CZew.273(40):25752-25756(1998))。在饮料发酵过程中获得的杂醇油和/或其组分的产量通常是低的。例如，报道了啤酒发酵中产生的异丁醇浓度低于百万分之16(Garda等，尸race^B/ocAe/mWAy29:303-309(1994))。将外源L-纈氨酸添加至发酵中提高了异丁醇的产量，如Dickinson等所迷的，上文，其中报道了通过在发酵中提供20g/L浓度的L-缬氨酸获得了3g/L异丁醇的产量。然而，将缬氨酸用作原料对于工业规模的异丁醇生产成本过高。直接从糖生物合成异丁醇在经济上是可行的，并将表示本领域中的进展。没有设计重组微生物来生产异丁醇的报道。因此，存在对环境负责的，成本有效的作为单一产物的异丁醇生产方法的需求。本发明通过提供表达异丁醇生物合成途径的重组微生物生产宿主解决了这种需求。发明概述本发明提供了具有工程化异丁醇生物合成途径的重组微生物。该工程化的微生物用于异丁醇的商业性生产。因此，在一个实施方案中，本发明提供了重组微生物宿主细胞，其包括至少一个编码多肽的DNA分子，该多肽催化选自以下的底物至产物的转化i)丙酮酸至乙酰乳酸(途径步骤a)ii)乙酰乳酸至2，3-二羟基异戊酸(途径步骤b)iii)2,3-二羟基异戊酸至a-酮基异戊酸(途径步骤c)iv)a-酮基异戊酸至异丁醛(途径步骤d)，和v)异丁醛至异丁醇(途径步骤e)其中至少一个DNA分子对于所迷微生物宿主细胞是异源的，并且其中所迷微生物宿主细胞产生异丁醇。在另一个实施方案中，本发明提供了重组微生物宿主细胞，其包括至少一个编码多肽的DNA分子，该多肽催化选自以下的底物至产物的转化i)丙酮酸至乙酰乳酸(途径步骤a)ii)乙酰乳酸至2，3-二羟基异戊酸(途径步骤b)iii)2，3-二羟基异戊酸至a-酮基异戊酸(途径步骤c)iv)a-酮基异戊酸至异丁酰-CoA(途径步骤f)v)异丁酰-CoA至异丁醛(途径步骤g)，和vi)异丁醛至异丁醇(途径步骤e)其中至少一个DNA分子对于所述微生物宿主细胞是异源的，并且其中所迷微生物宿主细胞产生异丁醇。在另一实施方案中，本发明提供了重组微生物宿主细胞，其包括至少一个编码多肽的DNA分子，该多肽催化选自以下的底物至产物的转化i)丙酮酸至乙酰乳酸(途径步骤a)ii)乙酰乳酸至2，3-二轻基异戊酸(途径步骤b)iii)2,3-二羟基异戊酸至a-酮基异戊酸(途径步骤c)iv)a-酮基异戊酸至纈氨酸(途径步骤h)v)缬氨酸至异丁胺(途径步骤i),vi)异丁胺至异丁醛(途径步骤j)，和vii)异丁醛至异丁醇(途径步骤e)其中至少一个DNA分子对于所述微生物宿主细胞是异源的，并且其中所述微生物宿主细胞产生异丁醇。在另一实施方案中，本发明提供了生产异丁醇的方法，其包括1)提供重组微生物宿主细胞，其包括至少一个编码多肽的DNA分子，该多肽催化选自以下的底物至产物的转化1)丙酮酸至乙酰乳酸(途径步骤a)ii)乙酰乳酸至2，3-二羟基异戊酸(途径步骤b)iii)2,3-二羟基异戊酸至a-酮基异戊酸(途径步骤c)iv)a-酮基异戊酸至异丁醛(途径步骤d)，和v)异丁醛至异丁醇(途径步骤e)其中至少一个DNA分子对所述微生物宿主细胞是异源的；和2)在由此产生异丁醇的条件下将(i)中的宿主细胞接触发酵培养基中的可发酵碳底物。在另一实施方案中，本发明提供了生产异丁醇的方法，其包括1)提供重组微生物宿主细胞，其包括至少一个编码多肽的DNA分子，该多肽催化选自以下的底物至产物的转化i)丙酮酸至乙酰乳酸(途径步骤a)ii)乙酰乳酸至2，3-二羟基异戊酸(途径步骤b)iii)2，3-二羟基异戊酸至a-酮基异戊酸(途径步骤c)iv)a-酮基异戊酸至异丁酰-CoA(途径步骤f)v)异丁酰-CoA至异丁醛(途径步骤g)，和vi)异丁搭至异丁醇(途径步骤e)其中至少一个DNA分子对于所迷微生物宿主细胞是异源的；和2)在由此产生异丁醇的条件下将(i)中的宿主细胞接触发酵培养基中的可发酵碳底物。在另一实施方案中，本发明提供了生产异丁醇的方法，其包括1)提供重组微生物宿主细胞，其包括至少一个编码多肽的DNA分子，该多肽催化选自以下的底物至产物的转化1)丙酮酸至乙酰乳酸(途径步骤a)ii)乙酰乳酸至2，3-二羟基异戊酸(途径步骤b)iii)2,3-二羟基异戊酸至a-辆基异戊酸(途径步骤c)iv)a-酮基异戊酸至缬氨酸(途径步骤h)v)缬氨酸至异丁胺(途径步骤i)，vi)异丁胺至异丁醛(途径步骤j),和vii)异丁醛至异丁醇(途径步骤e)其中至少一个DNA分子对于所述微生物宿主细胞是异源的；和2)在由此产生异丁醇的条件下将(i)中的宿主细胞接触发酵培养基中的可发酵碳底物。在可替换的实施方案中，本发明提供了通过本发明的方法产生的含有异丁醇的发酵培养基。附图和序列表简述从以下形成本申请一部分的详述，附图和附带的序列描迷可以更全面地了解本发明。图1显示了四个不同的异丁醇生物合成途径。标记为"a","b","c，，，"d"，"e，，，"f，，"g"，"h"，"i，，，"j，，和"k，，的步骤表示以下所述的底物至产物的转化。以下的序列符合37C.F.R.1.821-1.825("含有核苷酸序列和/或氨基酸序列公开内容的专利申请的要求-序列规定")并符合世界知识产权组织(WIPO)标准ST.25(1998)以及EPO和PCT的序列表要求(细则5.2和49.5(a-bis),和行政指令的208条和附录C)。用于核苷酸和M酸序列数椐的符号和格式遵照37C.F.R.§1.822中列出的规定。表1基因和蛋白质SEOID编号的概括<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>SEQIDNO:11-38，40-69,72-75,85-138,144,145，147-157,159-176是本文所述实施例中使用的寡核苷酸克隆，筛选或测序引物的核苷酸序列。SEQIDNO:39是实施例16中所述的c^S^4基因簇的核苷酸序列。SEQIDNO:70是实施例13中所述的葡萄糖异构酶启动子1.6GI的核苷酸序列。SEQIDNO:71是实施例13中所述的1.5GI启动子的核苷酸序列。SEQIDNO:76是实施例17中所述的GPD启动子的核苷酸序列。SEQIDNO:77是实施例17中所述的CYC1终止子的核苷酸序列。SEQIDNO:79是实施例17中所述的FBA启动子的核苷酸序列。SEQIDNO:81是实施例17中所述的ADH1启动子的核苷酸序列SEQIDNO:82是实施例17中所述的ADH1终止子的核苷酸序列。SEQIDNO:84是实施例17中所述的GMP启动子的核苷酸序列。SEQIDNO:139是蔗糖水解酶(CscA)的氨基酸序列。SEQIDNO:140是D-果糖激酶(CscK)的氨基酸序列。SEQIDNO:141是蔗糖透性酶(CscB)的氨基酸序列。SEQIDNO:142是实施例20中所述的质粒pPF988DssPspac的核苷酸序列。SEQIDNO:143是实施例20中所述的质粒pPF988DssPgroE的核苷酸序列。SEQIDNO:146是实施例20中所述的pPF988Dss载体片段的核苷酸序列。SEQIDNO:177是实施例21中所迷的质粒pPF988整合栽体的核苷酸序列。SEQIDNO:267是实施例21中所述的质粒pC194的核香酸序列。发明详述本发明涉及使用重组微生物生产异丁醇的方法。本发明满足各种商业和工业需求。丁醇是具有多种应用的重要工业日用化学品，其中其作为燃料或燃料添加剂的潜能是特别重要的。尽管只是四碳醇，丁醇具有与汽油相似的能含量并可以与任何矿物燃料混合。喜欢将丁醇作为燃料或燃料添加剂，因为它在标准内燃机中燃烧时只产生C02并且几乎没有SOx或NOx。此外，丁醇比迄今为止最优选的燃料添加剂乙醇的腐蚀性小。除了作为生物燃料或燃料添加剂的用途，丁醇具有影响新兴燃料电池工业中氢分配问题的潜能。目前燃料电池受到与氢运输和分配相关的安全问题的困扰。对于氢含量可以将丁酵容易地重组，并可以通过现有的加油站分配，以燃料电池或车辆需要的純度。最后，本发明从源自植物的碳源生产异丁醇，避免了与丁醉生产的标准石化方法相关的负面环境影响。以下的定义和缩写用于权利要求和说明书的解释。如在此所用的术语"发明"和"本发明"是非限制性的术语，不是用来指特定发明的任何单个实施方案，而是包括如说明书和权利要求中所述的所有可能的实施方案。术语"异丁醇生物合成途径"指的是产生异丁醇的酶途径。在此可交替使用的术语"乙酰乳酸合酶，，和"乙酰乳酸合成酶"指的是催化丙酮酸转化成乙醜乳酸和C02的酶。优选的乙醜乳酸合酶已知为EC编号2.2丄69(E"2ymeA^we"c/^wre(酶命名)/992,AcademicPress,SanDiego)。这些酶可从各种来源获得，包括但不限于，枯草芽孢杆菌(GenBankNo:CAB15618(SEQIDNO:178)，Z99122(SEQIDNO:78)，各自为NCBI(国立生物技术信息中心)氨基酸序列，NCBI核苷酸序列),肺炎克雷伯氏菌(GenBankNo:AAA25079(SEQIDNO:2)，M73842(SEQIDNO:l)),和乳酸乳球菌(GenBankNo:AAA25161(SEQIDNO:180),LI6975(SEQIDNO:179))。在此可交替使用的术语"乙酰醇酸异构还原酶"和"乙酰醇酸还原异构酶"指的是使用NADPH(还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸酯)作为电子供体催化乙酰乳酸转化成2,3-二羟基异戊酸的酶。优选的乙酰醇酸异构还原酶已知为EC编号1丄1.86,并且可从大量的微生物阵列中获得序列，这些微生物包括但不限于，大肠杆菌(GenBankNo:NP一418222(SEQIDNO:4)，NC—000913(SEQIDNO:3))，酿酒酵母(GenBankNo:NP—013459(SEQIDNO:181),NC—001144(SEQIDNO:80))，海藻甲烷球菌(GenBankNo:CAF30210(SEQIDNO:183),BX957220(SEQIDNO:182)),和枯草芽孢杆菌(GenBankNo:CAB14798(SEQIDNO:158),Z99118(SEQIDNO:184))。术语"乙酰醇酸脱水酶"指的是催化2,3-二羟基异戊酸转化成a-酮基异戊酸的酶。优选的乙酰醇酸脱水酶已知为EC编号4.2.1.9。这些酶可从大量的微生物阵列中获得序列，这些微生物包括但不限于，大肠杆菌(GenBankNo:YP一026248(SEQIDNO:6)，NC—000913(SEQIDNO:5))，酿酒酵母(GenBankNo:NP一012550(SEQIDNO:186)，NC—001142(SEQIDNO:83))，海藻甲烷球菌(GenBankNo:CAF29874(SEQIDNO:188)，BX957219(SEQIDNO:187)),和枯草芽孢杆菌(GenBankNo:CAB14105(SEQIDNO:190)，Z99115(SEQIDNO:189))。术语"支链a-酮酸脱羧酶"指的是催化a-酮基异戊酸转化成异丁醛和C02的酶。优选的支链a-酮酸脱羧酶已知为EC编号4.1.1.72并可从各种来源获得，包括但不限于，乳酸乳球菌(GenBankNo:AAS49166(SEQIDNO:193),AY548760(SEQIDNO:192);CAG34226(SEQIDNO:8),AJ746364(SEQIDNO:191)，鼠伤寒沙门氏菌(GenBankNo:NP—461346(SEQIDNO:195)，NC—003197(SEQIDNO:194))，和丙醇丁酮梭菌(GenBankNo:NP—149189(SEQIDNO:197)，NC—001988(SEQIDNO:196))。术语"支链醇脱氢酶"指的是催化异丁醛转化成异丁醇的酶。优选的支链醇脱氢酶已知为EC编号1.1.1.265，但也可以归类于其他醇脱氢酶(特别是，EC1.1.1.1或l丄l.2)。这些酶使用NADH(还原型烟酰胺腺噤呤二核苷酸)和/或NADPH作为电子供体，并从各种来源可获得，包括但不限于，酿酒酵母(GenBankNo:NP_010656(SEQIDNO:199),NC—001136(SEQIDNO:198);NP—014051(SEQIDNO:201)，NC—001145(SEQIDNO:200))，大肠杆菌(GenBankNo:NP_417484(SEQIDNO:10),NC—000913(SEQIDNO:9))，和丙醇丁酮梭菌(GenBankNo:NP—349892(SEQIDNO:203),NC_003030(SEQIDNO:202);NP一349891(SEQIDNO:204)，NC—003030(SEQIDNO:158))。术语"支链酮酸脱氬酶"指的是催化a-酮基异戊酸转化成异丁酰-CoA(异丁酰-辅酶A)的酶，使用NAD+(烟酰胺腺噪呤二核苷酸)作为电子受体。优选的支链酮酸脱氢酶已知为EC编号1.2.4.4。这些支链酮酸脱氢酶由四个亚基构成，并且所有亚基的序列可从大量微生物阵列中获得，这些维生物包括但不限于，枯草芽孢杆菌(GenBankNo:CAB14336(SEQIDNO:206),Z99116(SEQIDNO:205);CAB14335(SEQIDNO:208)，Z99116(SEQIDNO:207);CAB14334(SEQIDNO:210)，Z99U6(SEQIDNO:209);和CAB14337(SEQIDNO:212)，Z99U6(SEQIDNO:2U))和恶臭假单胞菌(GenBankNo:AAA65614(SEQIDNO:214)，M57613(SEQIDNO:213);AAA65615(SEQIDNO:216)。M57613(SEQIDNO:215);AAA65617(SEQIDNO:218)，M57613(SEQIDNO:217);和AAA65618(SEQIDNO:220),M57613(SEQIDNO:219))。术语"酰化醛脱氢酶"指的是催化异丁酰-CoA转化成异丁醛的酶，使用NADH或NADPH作为电子供体。优选的酰化^脱氢酶已知为EC编号1.2.1.10和1.2.1.57。这些酶可从多个来源获得，包括但不限于，拜氏梭菌(GenBankNo:AAD31841(SEQIDNO:222)，AF157306(SEQIDNO:221))，丙醇丁酮梭菌(GenBankNo:NP_149325(SEQIDNO:224),NC—001988(SEQIDNO:223);NP—149199(SEQIDNO:226),NC_001988(SEQIDNO:225)),恶臭假单胞菌(GenBankNo:AAA89106(SEQIDNO:228),U13232(SEQIDNO:227))，和嗜热栖热菌(GenBankNo:YP—145486(SEQIDNO:230)，NC—006461(SEQIDNO:229))。术语"转氨酶"指的是催化a-酮基异戊酸转化成L-缬氨酸的酶，使用丙氨酸或谷氨酸作为胺供体。优选的转氨酶已知为EC编号2.6.1.42和2.6.1.66。这些酶可从多种来源获得。丙氨酸依赖性酶的来源实例包括，但不限于，大肠杆菌(GenBankNo:YP—026231(SEQIDNO:232)，NC—000913(SEQIDNO:231))和地衣芽孢杆菌(GenBankNo:YP—093743(SEQIDNO:234),NC—006322(SEQIDNO:233))。谷氨酸依赖性酶的来源实例包括，但不限于，大肠杆菌(GenBankNo:YP—026247(SEQIDNO:236)，NC—000913(SEQIDNO:235)),酿酒酵母(GenBankNo:NP—012682(SEQIDNO:238),NC_00U42(SEQIDNO:237))和嗜热碱甲烷杆菌(GenBankNo:NP—276546(SEQIDNO:240)，NC—000916(SEQIDNO:239))。术语"缬氨酸脱氢酶"指的是催化a-酮基异戊酸转化成L-绳氨酸的酶，使用NAD(P)H作为电子供体和氨作为胺供体。优选的缬氨酸脱氬酶已知为EC编号1.4.1.8和1.4.1.9,并可从各种来源获得，包括但不限于，天蓝色链霉菌(GenBankNo:NP—628270(SEQIDNO:242),NC—003888(SEQIDNO:241))和枯草芽孢杆菌(GenBankNo:CAB14339(SEQIDNO:244)，Z99116(SEQIDNO:243))。术语"缬氨酸脱羧酶"指的是催化L-缃氨酸转化成异丁胺和C02的酶。优选的翔氨酸脱羧酶已知为EC编号4丄1."。这些酶可在链霉菌中找到，如例如，生绿链霉菌(GenBankNo:AAN10242(SEQIDNO:246)，AY116644(SEQIDNO:245))。术语"w转氨酶"指的是催化异丁胺转化成异丁搭的酶，使用合适的氨基酸作为胺供体。优选的co转氨酶已知为EC编号2.6丄18并可从各种来源获得，包括但不限于，反硝化产碱菌(AAP92672(SEQIDNO:248)，AY330220(SEQIDNO:247)),真养雷氏菌(GenBankNo:YP—294474)(SEQIDNO:250),NC—007247(SEQIDNO:249))，S/iewa"e〃aorte/c^"ws(GenBankNo:NP—71卯46(SEQIDNO:252)，NC—004347(SEQIDNO:251))，和悉臭脅i羊胞菌(GenBankNo:AAN66223(SEQIDNO:254)，AE016776(SEQIDNO:253))。术语"异丁酰-CoA突变酶"指的是催化丁酰-CoA转化成异丁酰-CoA的酶。这种酶使用辅酶Bi2作为辅因子。优选的异丁酰-CoA突变酶已知为EC编号5.4.99.13。在各种链霉菌中找到这种酶，包括但不限于，肉桂地链霉菌(GenBankNo:AAC08713(SEQIDNO:256)，U67612(SEQIDNO:255);CAB59633(SEQIDNO:258),AJ246005(SEQIDNO:257))，天蓝色链霉菌(GenBankNo:CAB70645(SEQIDNO:260)，AL939123(SEQIDNO:269);CAB92663(SEQIDNO:262);AL93912KSEQIDNO:261));和除虫链霉菌(GenBankNo:NP—824008(SEQIDNO:264)，NC—003155(SEQIDNO:263);NP—824637(SEQIDNO:266),NC—003155(SEQIDNO:265))。术语"兼性厌氧菌，，指的是在好氧和厌氧环境中都可以生长的微生物。术语"碳底物"或"可发酵碳底物"指的是能够被本发明的宿主微生物代谢的碳源，并且是选自单糖，寡糖，多糖和单碳底物或其混合物的碳源。术语"基因"指的是能够表达为特定蛋白质的核酸片段，任选包括编码序列之前(5，非-编码序列)和之后(3，非-编码序列)的调控序列。"天然基因"指的是与其自身调控序列在自然状态发现的基因。"嵌合基因"指的是不是天然基因的任何基因，包括不是在自然状态一起发现的调控序列和编码序列。因此，嵌合基因可以包括来自不同来源的调控序列和编码序列，或调控序列和编码序列源自相同的来源，但以不同于自然状态发现的方式排列。"内源基因"指的是处于其在生物体基因组中的天然位置的天然基因。"外源基因"或"异源基因"指的是通常不是在宿主生物体中发现的而是通过基因转移引入宿主生物体中的基因。外源基因可以包括插入非天然生物体中的天然基因，或嵌合基因。"转基因"是已经通过转化程序引入基因组中的基因。如在此所用的，术语"编码序列"指的是编码特定氨基酸序列的DNA序列。"合适的调控序列"指的是位于编码序列上游(5'非-编码序列)，之内或下游(3'非-编码序列)的核苷酸序列，并且其影响相连编码序列的转录，RNA加工或稳定性，或翻译。调控序列可以包括启动于，翻译前导序列，内含于，多腺苷酸化识别序列，RNA加工位点，效应子结合位点和茎-环结构。术语"启动子"指的是能够控制编码序列或功能性RNA表达的DNA序列。通常，编码序列位于启动子序列的3，端。启动子可以完全源自天然基因，或由源自自然状态发现的不同启动子的不同序列构成，或甚至包括合成的DNA片段。本领域技术人员应当理解不同的启动子可以指导不同组织或细胞类型中的，或在不同的发育阶段的，或应答不同的环境或生物条件的基因表达。使基因在大部分时间在大部分细胞类型中得到表达的启动子通常称为"组成型启动子"。进一步认识到因为在大部分情况中，调控序列的确切分界线还没有得到完全限定，因此不同长度的DNA片段可能具有相同的启动子活性。术语"可操纵地连接"指的是单个核酸片段上的核酸序列连接，使得一个的功能受到另一个的影响。例如，在其能够影响编码序列的表达时，启动子可操纵地连接编码序列(即，编码序列处于启动子的转录控制下)。可以将编码序列以正义或反义方向可操纵地连接调控序列。如在此所用的术语"表达"指的是源自本发明核酸片段的正义(mRNA)或反义RNA的转录和稳定累积。表达还可以指mRNA翻译成多肽。如在此所用的术语"转化"指的是核酸片段转移至宿主生物体中，导致遗传上稳定的遗传。将含有转化的核酸片段的宿主生物体称为"转基因"或"重组"或"转化的"生物体。术语"质粒"，"栽体"和"盒"指的是额外的染色体序列，其通常携带不是细胞重要代谢的一部分的基因，且通常是环状双链DNA片段的形式。这样的序列可以是源自任何来源的单链或双链DNA或RNA的自主复制序列，基因组整合序列，噬菌体或核苷酸序列，线性或环状的，其中各种核苷酸序列已经连接或重组成独特的构建体，其能够序列引入细胞^。、"转化盒"指的是含有外源基因并具有除了促进特定宿主细胞转化的外源基因以外的序列的特定载体。"表达盒，，指的是含有外源基因并具有除了允许该基因在外源宿主中提高的表达的外源基因以外的序列的特定栽体。如在此所用的术语"密码子简并性"指的是遗传密码中允许核苷酸序列改变而没有影响所编码多肽的氨基酸序列的性质。本领域技术人员公知核苦酸密码子使用中由特定宿主细胞呈现的"密码子偏好"确定了给定的氨基酸。因此，合成用于在宿主细胞中提高表达的基因时，理想的是设计基因使得密码子使用的频率接近宿主细胞的优选密码子使用的频率。术语"密码子最佳化"，当涉及用于各种宿主转化的基因和核酸分子的编码片段时，指的是基因或核酸分子编码片段中的密码子改变，的多肽。在此使用的标准重组DNA和分子克隆技术是本领域公知的，并描述于Sambrook，J.，Fritsch,E.F.和Maniatis,T.,她/ecw/orC7ow/wg..」La6orafo^Ma"wa/(分子克隆实验室手册)，第二版，ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY(1989)(众匕后^^为"Maniatis");和SUhavy，T.丄，Bennan，M.L.和Enquist，L.M.，￡lx/7er//wew"w"/zGeweFt/wows(4吏用基因融合的表达),ColdSpringHarborLaboratoryPress.ColdSpringHarbor,NY(1984);和Ausubel,F.M.等，CwAreW尸r^oco/jz"Mo/ecw/w(分子生物学中的通用实验方案),GreenePublishingAssoc.andWiley-Interscience出版(1987)。异丁醇生物合成途径利用碳水化合物的微生物使用Embden-Meyerhof-Parnas(EMP)途径，Entner-Doudoroff途径和戊糖磷酸酯循环作为主要的代谢途径来提供用于生长和维持的能量和细胞前体。这些途径具有共同的中间产物甘油醛-3-磷酸，并且最终直接或结合EMP途径形成丙酮酸。随后，丙酮酸通过各种方式转化成乙酰-辅酶A(乙酰-CoA)。乙酰-CoA用作关键的中间产物，例如，在产生脂肪酸，氨基酸和次级代谢产物中。糖转化成丙酮酸的组合反应产生了能量(例如，腺苷-5，-三磷酸，ATP)和还原等价物(例如，还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，NADH，和还原型烟酰胺腺噪呤二核苷酸磷酸酯，NADPH)。NADH和NADPH必须再循环成其氧化形式(各自为NAD+和NAPD+)。在无机电子受体(例如，02，N03—和SO-)的存在下，还原等价物可以用来扩大能量池；或者，可以形成还原碳副产物。本发明能够通过提供四个完整的反应途径使用重组微生物从碳水化合物来源产生异丁醇，如图1中所示的。其中三个途径包括丙酮酸通过一系列的酶步骤转化成异丁醇。优选的异丁醇步骤(图l,步骤a至e)，包括以下的底物至产物的转化a)丙酮酸至乙酰乳酸，例如由乙酰乳酸合酶催化的，b)乙酰乳酸至2,3-二羟基异戊酸，例如由乙酰醇酸异构还原酶催化的，c)2，3-二羟基异戊酸至a-酮基异戊酸，例如由乙酰醇酸脱水酶催化的，d)a-酮基异戊酸至异丁醛，例如由支链鲷酸脱羧酶催化的，e)异丁眵至异丁醇，例如由支链醇脱氩酶催化的。该途径结合了已知在公认的缬氨酸生物合成(丙酮酸至a-酮基异戊酸)和缬氨酸分解代谢(a-酮基异戊酸至异丁醇)途径中涉及的酶。因为许多缬氨酸生物合成酶还在异亮氨酸生物合成途径中催化类似的反应，因此底物特异性在选择基因来源中是一个主要的考虑因素。为此，对于乙酰乳酸合酶的主要目标基因是来自芽孢杆菌(a/aS)和克雷伯氏菌(6wdfi)的那些。已知这些特定的乙酰乳酸合酶参与这些生物体中的丁二醇发酵，并显示出对丙酮酸的亲和性高于酮丁酸(Gollop等，J.Bacteriol.172(6):3444-3449(1990);Holtzclaw等，Sa"e"o/.121(3):917-922(1975))。第二个和笫三个途径步骤各自是由乙酰醇酸还原异构酶和脱水酶催化的。已经从各种来源表征了这些酶，如例如，大肠杆菌(Chunduru等，胁cAem/考28(2):486-493(1989);Flint等，S/o/.CAe附.268(29):14732-14742(1993))。已知优选的异丁醇途径的最后两个步骤在酵母中发生，酵母可以使用缬氨酸作为氮源，并且在过程中分泌异丁醇。a-酮基异戊酸可以通过各种酮酸脱羧酶转化成异丁醛，如例如丙酮酸脱羧酶。为了防止丙酮酸远离异丁醇产生的方向错误，对丙酮酸的亲和性降低的脱羧酶是理想的。迄今为止，本领域中已知存在两种这样的酶(Smit等，々7//.五"v/w".M化ra6/o/.71(l):303-311(2005);delaPlaza等，A^cto6/o/.238(2):367-374(2004))。两种酶都来自乳酸乳球菌的菌株并对酮异戊酸的偏好超过丙酮酸50-200倍。最后，在酵母中已经鉴定了多种眵还原酶，许多具有重叠的底物特异性。已知偏好支链底物胜于乙搭的那些包括但不限于，醇脱氬酶VI(ADH6)和Yprlp(Larroy等，S/oc/iewJ.361(Ptl):163-172(2002);Ford等，r慮19(12):1087-1096(2002)),两者都使用了NADPH作为电子供体。最近已经在大肠杆菌中鉴定了用支链底物激活的NADPH-依赖性还原酶，YqhD(Sulzenbacher等，《/.Mo/.嵐342(2):489-502(2004))。丙酮酸转化成异丁醇的另一个途径包括以下的底物至产物的转化(图1,步骤a，b,c,f,g,e):a)丙酮酸至乙酰乳酸，例如由乙酰乳酸合酶催化的，b)乙酰乳酸至2,3-二羟基异戊酸，例如由乙酰醇酸异构还原酶催化的，c)2,3-二羟基异戊酸至a-酮基异戊酸，例如由乙酰醇酸脱水酶催化的，f)a-酮基异戊酸至异丁酰-CoA，例如由支链酮酸脱氢酶催化的，g)异丁酰-CoA至异丁醛，例如由酰化醛脱氬酶催化的，e)异丁醛至异丁醇，例如由支链醇脱氢酶催化的。该途径中的头三个步骤(a，b，c)和上述的那些相同。通过支链酮酸脱氪酶的作用将a-酮基异戊酸转化成异丁酰-CoA。虽然酵母只使用缬氨酸作为氮源，但许多其他生物体(真核生物和原核生物)可以也可以使用缬氨酸作为碳源。这些生物体具有支链酮酸脱氩酶(Sokatch等，./.Sa"en'o/.148(2):647-652(1981))，其产生异丁酰-CoA。异丁酰-CoA通过酰化醛脱氢酶可以转化成异丁眵。已经描迷了明串珠菌(丄ewco麵foc)和丙酸杆菌(尸，'o"/Z^"mw7w)中用支链底物激活的脱氢酶，但还没有克隆(Kazahaya等，v4///.M,'cro6/。/.18:43-55(1972);Hosol等,Fe匿wf.7fec/2"o/.57:418-427(1979))。然而，还可能的是已知作用于直链酰基-CoA(即，丁酰-CoA)的酰化醛脱氢酶也作用于异丁酰-CoA。然后异丁搭通过支链醇脱氢酶转化成异丁醇，如以上对于第一个途径中所迷的。丙酮酸转化成异丁醇的另一个途径包括以下的底物至产物的转化(图1，步骤a,b,c,h,i，j,e):a)丙酮酸至乙酰乳酸，例如由乙酰乳酸合酶催化的，b)乙酰乳酸至2，3-二幾基异戊酸，例如由乙酰醉酸异构还原酶催化的，c)2,3-二羟基异戊酸至a-酮基异戊酸，例如由乙酰醇酸脱水酶催化的，h)a-酮基异戊酸至缬氨酸，例如由缬氨酸脱氩酶或转氨酶催化的，i)缬氨酸至异丁胺，例如由缬氨酸脱羧酶催化的，j)异丁胺至异丁眵，例如由co转氨酶催化的，和e)异丁醛至异丁醇，例如由支链醇脱氩酶催化的。该途径中的头三个步骤(a,b,c)和上述的那些相同。该途径需要加入缬氨酸脱氢酶或合适的转氨酶。缬氨酸(和或亮氨酸)脱氩酶催化还原性胺化并使用氨；氨的Km值在毫摩尔范围中(Priestly等，Aoc/zew261(3):853-861(1989);Vancura等，Ge".Mtcra^o/.134(12):3213-3219(1988)，Zink等，Ac/z.^oc/ie肌S/o;/^.99:72-77(1962);Sekimoto等，说oc/zew(日本)116(1):176-182(1994))。转氨酶通常使用谷氨酸或丙氨酸作为氨基供体，并已经从各种生物体得到了表征(Lee-Peng等,丄脇m'o/.139(2):399-345(1979);Berg等，丄&"mo/.155(3):1009-1014(1983))。丙氨酸-特异性酶是理想的，因为除去胺基时，该步骤的丙酮酸产生可以结合途径中后来的丙酮酸消耗(参见以下的)。下一个步骤是缬氨酸的脱羧作用，这是在链霉菌中的valanimycin生物合成中发生的反应(Gang等，A/o/.M/cra&o/.46(2):505-517(2002))。所得到的异丁胺可以在吡,醛5，-磷酸-依赖性反应中转化成异丁搭，例如通过(0-转氨酶家族的酶。已经证明来自河流弧菌(r,力n'o//wWa/^)这样的酶具有异丁胺活性(Shm等，j5/ofec/mo/.Aowg.65(2):206-211(1999))。已经克隆了另一种来自反硝化产碱菌的co-转氨酶并且具有一定的丁胺活性(Yun等M//7/.￡"v/ra".A//cra6/o/.70(4):2529-2534(2004))。在这种方向中，这些酶使用丙酮酸作为氨基受体，产生丙氨酸。如上所迷，在途径的早期使用产生丙酮酸的转氨酶可以抵消对丙酮酸池的不利影响。然后异丁醛通过支链醇脱氩酶转化成异丁醇，如以上对于第一个途径所述的。第四个异丁醇生物合成途径包括图1中步骤k,g,e所示的底物至产物的转化。已知各种生物体通过丁酰-CoA中间产物产生丁酸和/或丁醇(Diirre等，F￡MSMcra&o/.Aev.17(3)251-262(1995);Abbad-Andaloussi等,緣油o/ogy142(5):1149-1158(1996))。通过加入能够转化丁酰-CoA至异丁酰-CoA的突变酶在这些生物体中工程化异丁醇产生(图l,步骤k)。已经从链霉菌克隆了异丁酰-CoA突变酶(辅酶Bu-依赖性酶)的两个亚基的基因(Ratnatilleke等，丄Ao/.C/^/w.274(44):31679-31685(1999))。异丁酰-CoA转化成异丁醛(图l中的步骤g)，其转化成异丁醇(图1中的步骤e)。因此，在提供丙酮酸至异丁醇的多个重组途径中，存在各种选择来满足单个转化步骤，并且本领域技术人员将能够利用公众可获得的序列来构建相关的途径。以下的表2中列出了本领域已知的且异丁醇生物合成途径的构建中有用的代表性基因的列表。表2异丁酵生物合成途径基因的来源基因GenBank引用乙酰乳酸合蘇<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table>用于异丁醇生产的微生物宿主用于异丁醇生产的微生物宿主可以选自细菌，蓝细菌，丝状真菌和酵母。用于异丁醇生产的微生物宿主优选耐异丁醇，使得产量不受到丁醇毒性的限制。在高异丁醇滴定水平具有代谢活性的微生物不是本领域公知的。尽管已经从产溶剂(solventogenic)梭菌分离了耐丁醇的突变体，但是关于其他潜在有用菌株的丁醇耐受性的信息获得得很少。对于细菌醇耐受性比较的大部分研究表明丁醇比乙醇更毒(deCavalho等，M/cmsc.^s.7fec/.64:215-22(2004)和Kabelitz等，/^MS"M/cto6/o/.厶e〃.220:223-227(2003))。Tomas等(丄Sacfeno/.186:2006-2018(2004))报道了丙醇丁酮梭菌发酵过程中的1-丁醇产量受到了l-丁醇毒性的限制。l-丁醇对丙醇丁酮梭菌的主要影响是膜功能的破坏(Hermann等，五"W應.M/'c油o/.50:1238-1243(1985))。选择用于异丁醇生产的微生物宿主优选耐异丁醇，并应当能够将碳水化合物转化成异丁醇。选择合适微生物宿主的标准包括以下的内在的异丁醇耐受性，高葡萄糖利用率，用于基因操纵的遗传工具的可用性和产生稳定的染色体改变的能力。可以通过基于菌林内在耐受性的筛选来鉴定具有异丁醇耐受性的合适宿主菌株。可以通过测定在最小培养基中生长时引起50%生长速率抑制UC50)的异丁醇浓度来测量微生物对异丁醇的内在耐受性。可以使用本领域已知的方法来测定IC50值。例如，可以将目标微生物在各种含量的异丁醇存在下生长并通过测量600纳米处的光密度来监控生长速率。从生长曲线的对数部分计算倍增时间并用作生长速率的测量。可以从生长的百分比抑制对异丁醇浓度的图中测定出产生50%生长抑制的异丁醇浓度。优选，宿主菌抹对于异丁醇应当具有高于约0.5%的IC50。用于异丁醇生产的微生物宿主还应当以高速率来利用葡萄糖。大部分微生物能够利用碳水化合物。然而，特定的环境微生物不能高效地利用碳水化合物，并因此不是合适的宿主。在遗传上修饰宿主的能力对于任何重组微生物的产生是必须的。基因转移技术的方式可以通过电穿孔，缀合，转导或天然转化。各种宿主可缀合质粒和抗药性标记是可获得的。基于在该宿主中抗生素抗性标记的性质，对宿主生物体定制克隆载体。微生物宿主还必须得到操纵，以便通过删除各种基因使碳流的竟争途径失活。这需要利用指导失活的转座子或染色体整合栽体。此外，生产宿主应当顺从化学诱变，使得可以获得提高内在异丁醇耐受性的突变。基于上述的标准，用于异丁醇生产的合适微生物宿主包括，但不限于，梭菌属，发酵单胞菌属(Zywomomw)，埃希氏菌属(^yc/jeWc/n'a),沙门氏菌属，红球菌属(尺/iodococa^)，假单胞菌属，芽孢杆菌属，乳#干菌属(Z/a"o6ac〃/^s)，肠J求菌属(￡>^erococcz^)，产石成杆菌属(爿/ca/zge"es),克雷伯氏菌属，类芽孢杆菌属(尸aemAac〃/w)，节杆菌属(勿/ro6a"er),棒状杆菌属(Cor"e6a"www),短杆菌属(5訓力a"mww)，毕赤氏酵母属(尸/c/j/a)，假丝酵母属(CW/afa)，汉森酵母属(//awseww/a)和酵母属(Sacc/iaromycej)的成员。优选的宿主包括大肠杆菌(EscAe〃'c/n'aco/O,真养产碱杆菌(爿/ca/z'gew^ew/rop/iuy),地衣芽孢杆菌，浸麻类芽孢杆菌(尸aemAac〃/uswmcenms)，红串红球菌(//moTococcz^er声/^o/o/^)，恶臭々i单胞菌，才直物乳杆菌(Z^"o6ac/〃w//fl"^rw/n)，屎肠球菌(^^eracocc附/aec/ww)，鹁鸡肠球菌(五w"rococcwsga〃/"an'ww),粪肠球菌(^V^erococcwjy^eca/z'j)，枯草芽孢杆菌和酿酒酵母。生产宿主的构建可以使用本领域公知的技术来构建含有必需基因的重组生物体，该基因编码可发酵碳底物转化成异丁醇的酶途径。在本发明中，可以从各种来源分离编码本发明异丁醇生物合成途径之一的酶，例如，乙酰乳酸合酶，乙酰醇酸异构还原酶，乙酰醇酸脱水酶，支链a-酮酸脱羧酶，如上所迷。从细菌基因组获得所需基因的方法是分子生物学领域中常见的和公知的。例如，如果基因的序列是已知的，可以通过限制性核酸内切酶分泌合适的基因组文库，并可以使用与所需基因序列互补的探针来筛选。一旦序列得到分离，使用标准引物定向扩增方法如聚合酶链式反应(U.S.4，683，202)扩增DNA来获得适于使用合适载体转化的适量DNA。用于在异源宿主中表达的密码子最佳化的工具是容易获得的。基于宿主生物体的GC含量可以使用一些用于密码子最佳化的工具。表3中给出了一些实例微生物宿主的GC含量。41微生物宿主的GC含量菌抹%GC地衣芽孢杆菌46枯草芽孢杆菌42丙醇丁酮梭菌37大肠杆菌50恶臭假单胞菌61真养产碱杆菌61浸麻类芽孢杆菌51红串红球菌62短杆菌50多粘类芽孢杆菌(尸aem力acz'〃ws50/o/，y;ca)一旦鉴定并分离出相关的途径基因，可以通过本领域公知的方式将它们转化值合适的表达栽体中。用于转化各种宿主细胞的载体或盒是常见的并从如下的公司可购得，EPICENTRE(Madison，WI)，InvitrogenCorp.(Carlsbad,CA),Stratagene(LaJolla,CA)和NewEnglandBiolabs,Inc.(Beverly,MA)。通常，栽体和盒含有指导相关基因的盒翻译的序列，选择标记和允许自主复制或染色体整合的序列。合适的栽体包括带有转录启动控制的基因5，端和控制转录终止的DNA片段的3，端。两个控制片段可以源自与转化的宿主细胞同源的基因，种的天然基因。用于驱动所需宿主细胞中相关途径编码片段的表达的启动控制片段或启动子是为数众多的并是本领域技术人员熟知的。实际上，能够驱动这些遗传序列的任何启动子都适用于本发明，包括但不限于，CTC7，///S3，(L4ZJ0，尸G《，尸//05，04尸D仏」ZX:/,77P/，^7/^3,ZJn￡M9，7TV,Ct/尸/,G尸D和G尸A/(用于在酵母中的表达)；」OA7(用于在毕赤氏酵母中的表达)；和/ac,ara，&/，&/7，/尸￡，/尸/，77，Mc和加(用于大肠杆菌，产碱杆菌和假单胞菌中的表达)；am》a/r,"严启动子和各种噬菌体启动子，用于枯草芽孢杆菌，地衣芽孢杆菌和浸麻类芽孢杆菌中的表达；WW(用于革兰氏阳性细菌中的表达，Eichenbaum等，^//.五"viro".M/cro6/o/.64(8):2763-2769(1998));和合成的Pll启动子(用于植物乳杆菌中的表达，Rud等，M/cro&o/ogy152:1011-1019(2006))。终止控制片段也可以源自优选宿主的各种天然基因。任选地，终止位点不是必需的，然而，如果包括，是最优选的。特定的载体能够在大范围的宿主细菌中复制并可以通过缀合来转移。pRK4的完整和注释序列以及三个相关的栽体-pRK437,pRK442和pRK442(H)是可获得的。已经证明这些衍生物对于革兰氏阴性细菌中的遗传操纵是有价值的工具(Scott等，尸/ww^50(l):74-79(2003))。宽宿主范围的IncP4质粒RSF1010的几个质粒衍生物也是可获得的，具有可以在各种革兰氏阴性细菌中起作用的启动子。质粒pAYC36和pAYC37,具有活性启动子和多个克隆位点，以允许异源基因在革兰氏阴性细菌中的表达。还广泛使用了染色体基因替代工具。例如，已经修改宽宿主范围复制子pWV101的热敏感性变体来构建质粒pVE6002,其可以用于在各种革兰氏阳性细菌中实现基因替代(Maguin等，丄Sac/en'o/.174(17):5633-5638(1992))。此外，可利用体外transposome来形成来自商业来源如EPICENTRE⑧的各种基因组中的随机突变。以下更详细地描述了各种优选微生物宿主中异丁醇生物合成途径的表达。大肠杆菌中异丁醇生物合成途径的表达用于大肠杆菌转化的栽体或盒是常见的并从以上所列的公司可购得。例如，可以从各种来源分离异丁醇生物合成途径的基因，克隆至修饰的pUC9栽体中并转化至大肠杆菌NM522中，如实施例6和7中所迷的。红串红球菌中异丁醇生物合成途径的表达可以将一系列大肠杆菌-红球菌穿梭栽体用于红串红球菌中的表达，包括但不限于，pRhBR17和pDA71(Kostichka等，J///.M!cra6/o/.5zo^c/i"o/.62:61-68(2003))。此外，可以将一系列启动子用于红串红球菌中的异源基因表达(参见例如Nakashima等，々y/.￡"v,>ow.M,cro&o/.70:5557-5568(2004)，和Tao等，M/oo^o/.B/o^c/wo/.2005，DOI10.1007/s00253-005-0064)。可以使用Tao等，上文和Brans等E"v,腦.Mcro6/o/.66:2029-2036(2000))所述的方法形成红串红球菌中染色体基因的靶向基因破坏。如上所述，最初可以在pDA71或pRhBR71中克隆异丁醇生产需要的异源基因并转化至大肠杆菌中。然后通过电穿孔将栽体转化至红串红球菌中，如Kostichka等所迷的。可以将重组体生长于含有葡萄糖的培养基中并使用本领域已知的方法进行异丁醇的生产。枯草芽孢杆菌中异丁醇生物合成途径的表达用于枯草芽孢杆菌中的基因表达和突变形成的方法也是本领域公知的。例如，可以从各种来源分离异丁醇生物合成途径的基因，克隆至修饰的pUC19栽体中并转化至枯草芽孢杆菌BE1010中，如实施例8中所述的。此外，可以将异丁醇生物合成途径的五个基因分成两个用于表达的操纵子，如实施例20中所述的。将途径的三个基因(6w6仏//vD和hvD)整合至枯草芽孢杆菌BE1010的染色体中(Payne和Jackson,J.Bacteriol.173:2278-2282(1991))。将剩余的两个基因('7vZ)和6Wfi)克隆至表达栽体中并转化至带有整合的异丁醇基因的芽孢杆菌菌林中。地衣芽孢杆菌中异丁酵生物合成途径的表达在枯草芽孢杆菌中复制的大部分质粒和穿梭栽体可以用于转化地衣芽孢杆菌，通过原生质体转化或电穿孔。在质粒pBE20或pBE60衍生物中克隆异丁醇生产需要的基因(Nagarajan等，Ge"e114:121-126(1992))。转化地衣芽孢杆菌的方法是本领域已知的(例如，参见，Fleming等，^;/.￡"v/ro".A^cro6'o/.61(11):3775-3780(1995))。可以将为了在枯草芽孢杆菌中表达而构建的质粒转化至地衣芽孢杆菌中来产生生产异丁醇的重组微生物宿主。浸麻类芽孢杆菌中异丁酵生物合成途径的表达可以如以上对枯草芽孢杆菌中的表达所迷的来构建质粒并用于转化浸麻类芽孢杆菌，通过原生质体转化，以产生生产异丁醇的重组微生物宿主。真养产碱杆菌(雷氏菌)中异丁酵生物合成途径的表达用于真养产碱杆菌中的基因表达和突变形成的方法是本领域已知的(参见，例如，Taghavi等，柳/.肠/匿緣油o/.，60(10):3585-3591(1994))。可以在上迷的任一种宽宿主范围栽体中克隆用于异丁醇生物合成途径的基因，并电穿孔来产生生产异丁醇的重组体。已经详细描述了产碱杆菌中的多(羟基丁酸)途径，各种修饰真养产碱杆菌的遗传技术是已知的，并且那些工具可以应用于工程化异丁醇生物合成途径。恶臭假单胞菌中异丁醇生物合成途径的表达用于恶臭假单胞菌中的基因表达的方法是本领域已知的(参见，例如，Ben-Bassat等,U.S.专利No.6，586，229，在此将其引入作为参考)。可以将丁醇途径基因插入pPUC18中并将该连接的DNA电穿孔至电感受态恶臭假单胞菌D0T-T1C5aARl细胞中来产生生产异丁醇的重组体。酿酒酵母中异丁酵生物合成途径的表达用于酿酒酵母中的基因表达的方法是本领于已知的(参见，例如，她^2oc^￡>iz>7wo/ogy(酶学方法)，194巻,GwzdefoMo/ecw/arCe〃S/o/ogy(酵母遗传学以及分子和细胞生物学指南)(A部分,2004,ChristineGuthrieandGeraldR.Fink(编辑)，ElsevierAcademicPress,SanDiego,CA)。酵母中基因的表达通常需要启动子，接着为目标基因，以及转录终止子。在构建用于编码异丁醇生物合成途径的基因的表达盒中可以使用各种酵母启动子，包括但不限于组成型启动子FBA,GPD,ADH1和GPM，和诱导型启动子GALl,GAL10和CUP1。合适的转录终止子包括但不限于FBAt,GPDt,GMPt,ERG10t,GALlt，CYC1和ADH1。例如，可以将异丁醇生物合成途径的合适启动子，转录终止子和基因克隆至大肠杆菌-酵母穿梭栽体中，如实施例17中所述的。植物乳杆菌中异丁醇生物合成途径的表达乳杆菌属属于乳杆菌目(Lacfo6ac/〃a/es)家族并且在枯草芽孢杆菌和链球菌的转化中所用的许多质粒和栽体可以用于乳杆菌。合适载体的非限制性实例包括pAM"l及其衍生物(Renault等，183:175-182(1996);和O，Sullivan等，G缠137:227-231(1993));pMBBl和pHW800,pMBBl的衍生物(Wyckoff等，智/.肠/隱緣油o/.62:1481-1486(1996));pMGl,一种可缀合质粒(Tanimoto等，/i5a"m'o/.184:5800-5804(2002));pNZ9520(Kleerebezem等，^p//.A/zcro6/o/.63:4581-4584(1997));pAM401(Fujimoto等，^//.￡"v/ro".Mc油W.67:1262-1267(2001));和pAT392(Arthur等，J"〃w/cro6,CAewoAe广38:1899-1903(1994))。已经报道了几个来自植物乳杆菌的质粒(例如，vanKranenburgR，GolkN,BongersR，LeerRJ，deVbsWM,SiezenRJ，KJeerebezemM，J///.￡""v/row.iW/croWo/.2005年3月；71(3):1223-1230)。例如，实施例21中描迷了植物乳杆菌中异丁醇生物合成途径的表达。屎肠球菌，鹁鸡肠球菌和粪肠球菌中异丁酵生物合成途径的表达肠球菌属属于乳杆菌目家族并且在乳杆菌，枯草芽孢杆菌和链球菌的转化中所用的许多质粒和栽体可以用于肠球菌。合适载体的非限制性实例包括pAM々1及其衍生物(Renault等，Ge"e183:175-182(1996);和O，Sullivan等,137:227-231(1993));pMBBl和pHW800，pMBBl的衍生物(Wyckoff等，J///.￡>m>o".AZ/cro6/o/.62:1481-1486(1996));pMGl，一种可缀合质粒(Tanimoto等，丄S論r/o厶184:5800-5804(2002));pNZ9520(Kleerebezem等，J///.M/cra&o/.63:4581-4584(1997));pAM401(Fujimoto等，/^//.E"v&o".Mcro&o/.67:1262-1267(2001));和pAT392(Arthur等，颠/m/⑧6.爿ge""C/e/m^er38:1899-1903(1994))。使用来自乳球菌的m"基因的用于粪肠球菌的表达栽体也可使用(Eichenbaum等，y4///.￡"v/row.M/cro6/o/.64:2763-2769(1998)。此外，可以4吏用用于屎肠球菌染色体中基因替代的栽体(Nallaapareddy等，^p/.五"v/ra".A^cra6/o/.72:334-345(2006))。例如，实施例22中描述了粪肠球菌中的异丁醇生物合成途径的表达。发酵培养基本发明中的发酵培养基必须含有合适的碳底物。合适的物质包括，但不限于，单糖，如葡萄糖和果糖，寡糖，如乳糖或蔗糖，多糖，如淀粉或纤维素或其混合物，以及来自可再生原料的未纯化混合物，如千酪乳清渗透物，玉米浆，甜菜糖蜜和麦芽。此外，碳底物还可以是单碳底物，如二氧化碳，或甲醇，对此已经证明了代谢转化成关键的生化中间产物。除了单碳和二碳底物，还知道甲醇(methylotrophic)生物体利用各种其他含碳化合物，如甲胺，葡糖胺和各种氨基酸，用于代谢活性。例如，已知甲醇酵母利用来自甲胺的碳来形成海藻糖或甘油(Bellion等,Mc威G層AC/Co—.，[IntSymp]，7th(1993),415-32,编辑Murrell,J.Collin;Kelly,DonP.，出版商Intercept,Andover，UK)。相似地，假丝酵母的各种物种将代谢丙氨酸或油酸(Sulter等，Ac/j.Mc油W.153:485-489(1990))。因此，考虑了本发明中所用的碳源可以包括各种含碳底物并且只受生物体选择的限制。但优选的碳底物是葡萄糖，果糖和蔗糖。除了合适的碳源，发酵培养基必须含有合适的矿物质，盐，辅因子，緩沖剂和其他成分，这些是本领域技术人员已知的，适于培养物的生长和促进异丁醇生产需要的酶途径。培养条件通常，细胞生长于合适培养基中约25'C至约40。C范围的温度。本发明中的合适生长培养基是通常的商业制备培养基，如LuriaBertani(LB)培养液，SabouraudDextrose(SD)培养液或酵母培养基(YM)培养液。还可以使用其他限定的或合成的生长培养基，并且用于特定微生物生长的合适培养基将是微生物学或发酵科学领域中技术人员已知的。还可以将已知直接或间接调节代谢产物抑制的试剂，例如，环腺苷2，:3，-单磷酸，掺入发酵培养基中。用于发酵的合适pH范围为pH5.0至pH9.0,其中优选pH6.0至pH8.0作为起始条件。可以在好氣或厌氧条件下进行发酵，其中优选厌氧或微好氧条件。可以使用本领域已知的各种方法来测定发酵培养基中产生的异丁醇含量，例如，高性能液相色谦(hplc)或气相色谦(gc)。工业分批发酵和连续发酵本发明使用分批发酵方法。传统的分批发酵是封闭的系统，其中在发酵开始时设定培养基的组成并且在发酵过程中没有接受人工改变。因此，在发酵开始时，用所需的微生物接种培养基，并且允许发酵发生而没有给系统添加任何东西。通常，然而，"分批，，发酵对于碳源的添加是分批的，并且通常努力控制一些因素如pH和氧浓度。在分批系统中，系统的代谢产物和生物量组成恒定地改变直至停止发酵的时间。在分批培养内，细胞从静态的停滞阶段调节至高生长对数期，最后到达静止期，其中生长速率减小或停止。如果未处理，静止期中的细胞最终将死亡。对数期的细胞通常负责终产物或中间产物的大量产生。对标准分批系统的改进是给料-分批系统。给料-分批发酵方法也适用于本发明并包括典型的分批系统，除了随着发酵进展增量添加底物。当代谢产物抑制倾向于抑制细胞代谢并且希望在培养基中含有有限量的底物时，给料-分批系统是有用的。给料-分批系统中实际底物浓度的测量是困难的，并因此基于测量因素的改变来估算，这些测量因素如pH,溶解氧和废气如C02的分压。分批和给料-分批发酵是本领域常见的和y^知的，并且可以在以下找到实例ThomasD.Brock，在S/ofec/mo/ogy,'jre;cf6ooA。/7"(iwWo/A//cro6/.o/ogy(生物技术工业微生物学的教科书)，第二版(1989)SinauerAssociates,Inc.,Sunderland,MA,，或Deshpande，MukundV.,i5/o&c/wo/.,36:227，(1992),在此引入作为参考。尽管以分批模式进行本发明，但考虑了该方法也将适于连续发酵方法。连续发酵是开放的系统，其中将限定的发酵培养基连续加入生物反应器中，并且同时取出等量的调节过的培养基用于处理。连续发酵通常将培养物维持于恒定的高密度，其中细胞主要处于对数期生长。连续发酵允许调节影响细胞生长或终产物浓度的一种因素或任何数量的因素。例如，一种方法以固定的速率维持限制的营养素如碳源或氮水平，并允许所有其他参数来调节。在其他系统中，可以连续改变影响生长的多种因素，而通过培养基浊度测量的细胞浓度保持恒定。连续系统为维持稳态生长条件而努力，因此由于抽取培养基引起的细胞损耗必须相对于发酵中的细胞生长率而平衡。调节连续发酵过程的营养素和生长因子的方法以及用于最大化产品发酵速率的技术是工业微生物领域中公知的，并且Brock,上文中详细描述了各种方法。考虑了可以使用分批，给料-分批或连续过程来实践本发明，并且任何已知的发酵模式将是合适的。此外，考虑了可以将细胞固定于作为完整细胞催化剂的物质上并接受用于异丁醇生产的发酵条件。从发酵培养基分离异丁醇的方法可以使用本领域已知的方法从发酵培养基分离生物产生的异丁醇。例如，可以通过离心，过滤，滗析等从发酵培养基去除固体。然后，可以从如上所述已经处理过除去固体的发酵培养基分离异丁醇，使用如蒸馏，液-液提取或基于膜的分离的方法。因为异丁醇与水形成低沸点的共沸混合物，蒸馏只可以将混合物分离成共沸组合物。可以结合另一种分离方法使用蒸馏来获得绕过共沐组成分离。可以结合蒸馏使用来分离和纯化异丁醇的方法包括，但不限于，滗析，液-液提取，吸附和基于膜的技术。此外，可以使用共沸蒸馏来分离异丁醇，使用夹带剂(参见，例如，Doherty和Malone，Cowce/fwa/o/Z)/W〃/a"ow一ew，McGraw柳，NewYork,2001)。异丁醇-水混合物形成异质的共沸混合物，使得可以结合滗析使用蒸馏来分离和純化异丁醇。在该方法中，将含有异丁醇的发酵培养液蒸馏至接近共沸组成。然后，冷凝共沸混合物，并通过滗析从发酵培养基分离异丁醇。可以将滗析过的水相随着回流返回至第一个蒸馏柱。可以通过在笫二个蒸馏柱中蒸馏来进一步純化富含异丁醇的滗析过的有机相。还可以使用液-液提取结合蒸馏从发酵培养基中分离异丁醇。在该方法中，使用合适的溶剂使用液-液提取从发酵培养液中提取异丁醇。然后蒸馏含有异丁醇的有机相以从溶剂分离异丁醇。还可以使用蒸馏结合吸附以从发酵培养液中分离异丁醇。在该方法中，将含有异丁醇的发酵培养液蒸馏至接近非沸组成，然后使用吸附剂如分子筛除去剩余的水(Aden等，L/g"oce〃w/owc5/owa^fo涵awo/尸race^Dej/gwEcowowcsCo-CWrewfD//w&爿"c//Ve/zydro()Ay^awe/￡>72>7wa"c/(yfi^o()As/s/o/*ComSfoveer，ReportNREL/TP-510-32438，NationalRenwableEnergyLaboratory,2002年6月)。此外，可以使用蒸馏结合全蒸发过程从发酵培养基分离和純化异丁醇。在该方法中，将含有异丁醇的发酵培养液蒸馏至接近共沸组成，然后借由通过亲水性膜的全蒸发过程来除去剩余的水(Guo等，丄她^er245，199-210(2004))。实施例在以下的实施例中进一步限定了本发明。应当理解这些实施例只是通过说明的方式给出，尽管表示了本发明的优选实施方案。从以上的讨论和这些实施例，本领域技术人员可以确定本发明的必要特征，而没有脱离其精神和范围，可以进行本发明的各种改变和改进以使其适于各种用途和条件。总的方法实施例中所用的标准重组DNA和分子克隆技术上本领域公知的并描述于Sambrook,J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.Mo/ecw/orC7om"g.'爿Z^6oraM^Ma"wa/(分子克隆实验室手册)；ColdSpringHarborLaboratoryPress:ColdSpringHarbor,NY(1989)(Maniatis)和T.J.Silhavy，M.L.Bennan,和L.W.Enquist，j&cpw'膨""v^'//iGeweF腦'o;w(使用基因融合的实验)，ColdSpringHarborLaboratoryPress:ColdSpringHarbor,N.Y.(1984)和Ausubel,F.M.等，Owe/^/Woco/sMo/ecw/wAo/ogy(分子生物学中的通用实马t方案)，由GreenePublishingAssoc.和Wiley-Interscience(1987)出版。适用于细菌培养物的维持和生长的材料和方法是本领域公知的。适用于以下实施例的技术可以在以下所列的找到，A/awwa/o/Me"oA/orGewera/5a"e〃'o/ogy(—般细菌学的方法手册)(PhillippGerhardt，R.G.E.Murray,RalphN.Costilow,EugeneW.Nester，WillisA.Wood,NoelR.Krieg和G.BriggsPhillips编辑)，AmericanSocietyforMicrobiology,Washington,DC.(1994))或ThomasD.Brock,在爿7kx/^ooA0//wdw5YnWM'cra6/o/ogy(生物技术工业微生物学的教科书),笫二版，SinauerAssociates,Inc.,Sunderland,MA(1989)。用于细菌细胞生长和维持的所有试剂，限制酶和材料从AldrichChemicals(Milwaukee,WI)，BDDiagnosticSystems(Sparks,MD),LifeTechnologies(Rockville,MD),或SigmaChemicalCompany(St.Louis,MO)获得，除非另外指出。从美国典型培养物中心(ATCC)，Manassas,VA获得微生物菌抹，除非另外指出。表4中给出了以下实施例中使用的寡核苷酸引物。通过Sigma-Genosys(Woodlands,TX)合成所有寡核普酸引物。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage43</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage44</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage45</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage46</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage47</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage48</column></row><table>测定培养基中异T醇浓度的方法可以通过本领域已知的各种方法来测定培养基中的异丁醇浓度。例如，特异性高性能液相色谦(HPLC)方法使用了ShodexSH-1011柱和ShodexSH-G保护柱，两者都购自WatersCorporation(Milford,MA),具有折射率(RI)检测。使用0.01MH2S04作为移动相获得色谱分离，使用0.5mL/分钟的流速和50'C的柱温。异丁醇在所用的条件下具有46.6分钟的停留时间。或者，可以用气相色讲(GC)方法。例如，特定的GC方法使用HP-INNOWax柱(30mx0.53mm,同前，lpm膜厚，AgilentTechnologies,Wilmington,DE)，使用火焰电离检测仪(FID)。栽气是4.5mL/分钟流速的氦，在150'C测量，使用恒定的排除压力；注射器分裂是200'C1:25;烘箱温度是45'C1分钟，以10"C/分钟45升至220°C,和220'C5分钟；并在240'C使用FID检测，使用26mL/分钟氦补充气体。异丁醇的停留时间是4.5分钟。缩写的意思如下"s"表示秒，"min"表示分钟，"h，，表示小时，"psi"表示每平方英寸的磅数，"nm"表示纳米，"d"表示天，'VL"表示微升，"mL"表示毫升，"L"表示升，"mm"表示微米，"nm"表示納米，"mM"表示毫摩尔，VM"表示微摩尔，"M"表示摩尔，"mmol"表示毫摩尔，"jimol"表示微摩尔，"g"表示克，、g，，表示微克和"ng"表示纳克，"PCR"表示聚合酶链式反应，"OD"表示光密度，"OD6oo"表示在600nm波长测量的光密度，"kDa"表示千道尔顿，"g"表示重力常数，"bp"表示碱基对，"kbp"表示千碱基对，"%w/v，，表示重量/体积百分比，"％v/v"表示体积/体积百分比，"IPTG，，表示异丙基-P-D-硫代半乳糖吡喃糖苷，"RBS"表示核糖体结合位点，"HPLC"表示高性能液相色谱，和"GC，，表示气相色讲。术语"摩尔选择性"是每摩尔消耗的糖底物产生的产物摩尔数，并记录为百分比。实施例1乙酰乳酸合酶的克隆和表达该实施例的目的是从肺炎克雷伯氏菌克隆6t^^基因并在大肠杆菌BL21-AI中表达。使用PCR从肺炎克雷伯氏菌菌林ATCC25955基因组DNA扩增6w必基因，获得1.8kbp产物。寸吏用GentraPuregene试剂盒(GentraSystems,Inc.,Minneapolis,MN;目录编号D-5000A)制备基因组DNA。通过PCR从肺炎克雷伯氏菌基因组DNA扩增6w必基因，使用引物N80和N81(参见表2),各自如SEQIDNO:11和12给出。在制造商的试剂盒中提供了其他PCR扩增试剂，例如，FinnzymesPhusionHigh-FidelityPCRMasterMix(NewEnglandBiolabsInc.,Beverly,MA;目录no.F-531)并才艮椐制造商的实验方案来使用。在DNAThermocyclerGeneAmp9700(PEAppliedBiosystems，Fostercity，CA)中进行扩增。为了表达研究，使用Gateway克隆技术(InvitrogenCorp.，Carlsbad,CA)。入门栽体pENTRSDD-TOPO允许定向的克隆并提供了目标基因的Shine-Dalgarno序列。目标栽体pDEST14使用了T7启动子，用于没有标记物的基因的表达。正向引物就在转录起始密码子邻近引入四个碱基(CACC),以允许定向克隆至pENTRSDD-TOPO(Invitrogen)中来产生质粒pENTRSDD-TOPObudB。根据制造商的推荐将pENTR构建体转化至大肠杆菌ToplO(Invitrogen)细胞中并涂布。将转化体生长过夜并根椐制造商的推荐使用QIAprepSpinMiniprep试刑盒(Qiagen，Valencia,CA;目录no.27106)制备质粒DNA。将克隆测序来证实以正确方向插入了基因并证实序列。SEQIDNO:1和SEQIDNO:2各自给出了用于该基因的开放阅读框(ORF)的核苷酸序列和预测的酶氨基酸序列。为了形成表达克隆，通过重组将Zn^S基因转移至pDEST14栽体中来产生pDEST14budB。将pDEST14budB栽体转化至大肠杆菌BL21-AI细胞中(Invitrogen)。将转化体接种至补充50pg/mL氨千青霉素的LuriaBertani(LB)培养基中并生长过夜。并将等份的过夜培养物用来接种50mL补充50/^g/mL氨节青霉素的LB。将培养物在37'C振荡培养直至OD6oo达到0.6-0.8。将培养物分成两个25-mL培养物，并将阿拉伯糖加入一个烧瓶中至0.2%w/v的终浓度。阴性对照烧瓶没有用阿拉伯糖来诱导。将烧瓶在37'C振荡培养4h。通过离心收集细胞并将细胞沉淀物重悬浮于50mMMOPS中，pH7.0緩沖液。通过超声波或通过FrenchPressureCell破坏细胞。将全细胞裂解产物离心，产生无细胞提取物的上清液或不溶性部分。将等份的每个部分(全细胞裂解产物，无细胞提取物和不溶性部分)重悬浮于SDS(MES)装栽緩沖液中(Invitrogen),加热至85。C10分钟，并接受SDS-PAGE分析(NuPAGE4-12。/。Bis-Tris凝胶，目录no.NP0322Box，Invitrogen)。在诱导的培养物中存在预期约60kDa分子量的蛋白质，如从核酸序列推导的，但在未诱导的对照中不存在。使用Bauerle等(Aoc編.脚—.勿a92(1):142-149(1964))描述的方法来测量无细胞提取物中的乙酰乳酸合酶活性。实施例2(预测的)乙酰酵酸还原异构酶的克隆和表达该预测实施例的目的是描述怎样从大肠杆菌K12克隆//vC基因并在大肠杆菌BL21-AI中表达。使用PCR从大肠杆菌基因组DNA扩增WvC基因。以实施例1中所述的6w^9基因相同的方式克隆和表达,7vC基因。使用GentraPuregenei式剂盒(GentraSystems,Inc.,Minneapolis,MN;目录编号D-5000A)从大肠杆菌制备基因组DNA。通过PCR扩增//vC基因，使用引物N100和N101(参见表2)，各自如SEQIDNO:13和14给出，产生1.5kbp产物。正向引物就在转录起始密码子邻近引入四个碱基(CCAC)，以允许定向克隆至pENTR/SD/D-TOPO(Invitrogen)中来产生质粒pENTRSDD-TOPOUvC。将克隆测序来证实以正确方向插入了基因并证实序列。SEQIDNO:3和SEQIDNO:4各自给出了用于该基因的开放阅读框(ORF)的核苷酸序列和预测的酶氨基酸序列。为了形成表达克隆，通过重组将WvC基因转移至pDEST14(Invitrogen)栽体中来产生pDESTl術C。将pDEST14ilvC载体转化至大肠杆菌BL21-AI细胞中并通过加入阿拉伯糖诱导从T7启动子的表达。在诱导的培养物中存在预期约54kDa分子量的蛋白质，如从核酸序列推导的，但在未诱导的对照中不存在。使用Arfin和Umbarger(fi/o/.C/iem.244(5):1118-U27(1969))所迷的方法来测量无细胞提取物中的乙酰醇酸还原异构酶。实施例3(预测的)乙酰醇酸脱水酶的克隆和表达该预测实施例的目的是描述怎样从大肠杆菌K12克隆//vD基因并在大肠杆菌BL21-AI中表达。使用PCR从大肠杆菌基因组DNA扩增z7v/)基因。以实施例1中所述的6^/S基因相同的方式克隆和表达//vZ)基因。使用GentraPuregenei式剂盒(GentmSystems,Inc.,Minneapolis,MN;目录编号D-5000A)从大肠杆菌制备基因组DNA。通过PCR扩增//vZ)基因，使用引物N102和N103(参见表2)，各自如SEQIDNO:15和16给出，产生1.9kbp产物。正向引物就在转录起始密码子邻近引入四个碱基(CCAC),以允许定向克隆至pENTR/SD/D-TOPO(Invitrogen)中来产生质粒pENTRSDD-TOPOilvD。将克隆接受测序来证实以正确方向插入了基因并证实序列。SEQIDNO:5和SEQIDNO:6各自给出了用于该基因的幵放阅读框(ORF)的核苷酸序列和预测的酶氨基酸序列。为了形成表达克隆，通过重组将；7vD基因转移至pDEST14(Invitrogen)栽体中来产生pDEST14UvD。将pDEST14iWD栽体转化至大肠杆菌BL21-AI细胞中并通过加入阿拉伯糖诱导从T7启动子的表达。在诱导的培养物中存在预期约66kDa分子量的蛋白质，如从核酸序列推导的，但在未诱导的对照中不存在。使用Flint等(/.B/o/.CZem.268(20):14732-14742(1993))描迷的方法来测量无细胞提取物中的乙酰醇酸脱水酶活性。实施例4(预测的)支链酮酸脱羧酶的克隆和表达该预测实施例的目的是描述怎样从乳酸乳球菌克隆hVD基因并在大肠杆菌BL21-AI中表达。从GenScript(Piscataway，NJ)获得编码乳酸乳球菌的支链酮酸脱羧酶(hvD)的DNA序列。获得的序列对于在大肠杆菌和枯草芽孢杆菌中的表达是密码子最佳化的并克隆至pUC57中，来形成pUC57-kWD。SEQIDNO:7和SEQIDNO:8各自给出了用于该基因的开放阅读框(ORF)的密码子最佳化核苷酸序列和预测的酶氨基酸序列。为了形成表达克隆，使用AWe/和S^w///限制酶位点将来自pUC57-kivD的1.7kbpkivD片段克隆至栽体pET-3a中(Novagen，Madison,WI)。这形成了表达克隆pET-3a-kivD。将pET-3a-kivD栽体转化至大肠杆菌BL21-AI细胞中并通过加入阿拉伯糖诱导从T7启动子的表达。在诱导的培养物中存在预期约61kDa分子量的蛋白质，如从核酸序列推导的，但在未诱导的对照中不存在。使用Smit等(/.Mc油o/.5她c/mo/.64:396-402(2003))描述的方法来测量无细胞提取物中的支链鲷酸脱羧酶活性。实施例5(预测的)支链酵脱氢酶的克隆和表达该预测实施例的目的是描迷怎样从大肠杆菌K12克隆;^/^基因并在大肠杆菌BL21-AI中表达。使用PCR从大肠杆菌基因组DNA扩增y一D基因。以实施例1中所迷的6w必基因相同的方式克隆和表达月/zD基因。4吏用GentraPuregenei式剂盒(GentraSystems,Inc.,Minneapolis,MN;目录编号D-5000A)从大肠杆菌制备基因组DNA。通过PCR扩增^AZ)基因，使用引物N104和N105(参见表2)，各自如SEQIDNO:17和18给出，产生1.2kbp产物。正向引物就在转录起始密码子邻近引入四个石成基(CCAC)，以允许定向克隆至pENTR/SD/D-TOPO(Invitrogen)中来产生质粒pENTRSDD-TOPOyqhD。将克隆接受测序来证实以正确方向插入了基因并证实序列。SEQIDNO:9和SEQIDNO:10各自给出了用于该基因的幵放阅读框(ORF)的核苷酸序列和预测的酶氨基酸序列。为了形成表达克隆，通过重组将y功D基因转移至pDEST14(Invitrogen)载体中来产生pDEST14yqhD。将pDEST14yqhD载体转化至大肠杆菌BL21-AI细胞中并通过加入阿拉伯糖诱导从T7启动子的表达。在诱导的培养物中存在预期约42kDa分子量的蛋白质，如从核酸序列推导的，但在未诱导的对照中不存在。使用Sulzenbacher等(丄C/i亂342(2):489-502(2004))描迷的方法来测量无细胞提取物中的支链醇脱氩酶活性。实施例6(预测的)用于异丁酵生物合成途径中的基因的转化载体的构建该预测实施例的目的是描述怎样构建转化栽体，该栽体包括编码异丁醇生物合成途径中五个步骤的基因。将所有基因置于单个启动子控制下的单个操纵子中。通过PCR扩增单个基因，使用引入限制位点的引物，用于之后的克隆，并且正向引物含有最佳化的大肠杆菌核糖体结合位点(AAAGGAGG)。将PCR产物TOPO克隆至pCR4Blunt-TOPO栽体中并转化至大肠杆菌ToplO细胞中(Invitrogen)。从TOPO克隆制备质粒DNA并证实基因的序列。根据制造商的推荐使用限制酶和T4DNA连接酶(NewEnglandBiolabs,Beverly,MA)。为了克隆实验，使用QIAquick凝胶提取试剂盒(Qiagen)将限制片段凝胶纯化。证实序列后，将基因亚克隆至作为克隆平台的修饰pUC19载体中。通过HindlII/SapI消化来修饰pUC19载体，形成pUC19dHS。该消化除去了邻接MCS(多克隆位点)的lac启动子，防止操纵子在栽体中的转录。通过PCR从肺炎克雷伯氏菌ATCC25955基因组DNA扩增6w必基因，使用引物对N110和N111(参见表2)，各自如SEQIDNO:19和20给出，形成1.8kbp产物。正向引物引入SphI和AflII限制位点和核糖体结合位点(RBS)。反向引物引入PacI和NsiI限制位点。将PCR产物克隆至pCR4Blvmt-TOPO中，形成pCR4Blunt-TOPO-budB。从TOPO克隆制备质粒DNA并证实基因的序列。通过PCR从大肠杆菌K12基因组扩增//vC基因，使用引物对NU2和NU3(参见表2)，各自如SEQIDNO:21和22给出，形成1.5kbp产物。正向引物引入Sail和Nhel限制位点和RBS。反向引物引入Xbal限制位点。将PCR产物克隆至pCR4Blunt-TOPO中，形成pCR4Blunt-TOPO-ilvC。从TOPO克隆制备质粒DNA并证实基因的序列。，通过PCR从大肠杆菌K12基因组扩增！7vD基因，使用引物对N114和N115(参见表2)，各自如SEQIDNO:23和24给出，形成1.9kbp产物。正向引物引入Xbal限制位点和RBS。反向引物引入BamHI限制位点。将PCR产物克隆至pCR4Blunt-TOPO中，形成pCR4Blunt-TOPO-ilvD。从TOPO克隆制备质粒DNA并证实基因的序列。通过PCR从pUC57-kivD(实施例4中所迷的)扩增hvZ)基因，使用引物对NU6和NU7(参见表2)，各自如SEQIDNO:25和26给出，形成1.7bp产物。正向引物引入BamHI限制位点和RBS。反向引物引入SacI限制位点。将PCR产物克隆至pCR4Blunt-TOPO中，形成pCR4Blunt-TOPO-kivD。从TOPO克隆制备质粒DNA并证实基因的序列。通过PCR从大肠杆菌K12基因组DNA扩增>^/iZ)基因，使用引物对N118和N119(参见表2)，各自如SEQIDNO:27和28给出，形成1.2kbp产物。正向引物引入Sacl限制位点。反向引物引入SpeI和EcoRI限制位点。将PCR产物克隆至pCR4Blunt-TOPO中，形成pCR4Blunt-TOPO-yqhD。从TOPO克隆制备质粒DNA并证实基因的序列。为了构建异丁醇途径操纵子，用Seal和EcoRI从pCR4Blunt-TOPO-wAD切除yqhD基因，释放1.2kbp片段。将该片段连接之前已经用Sacl和EcoRI消化过的pUC19dHS。通过限制消化来证实所得到的克隆，pUC19dHS-yqhD。接着，用Sail和Xbal从pCR4Blunt-TOPO-ilvC切除i/vC基因，释放1.5kbp片段。将该片段连接之前已经用Sail和Xbal消化过的pUC19dHS-yqhD。通过限制消化来证实所得到的克隆，pUC19dHS-ilvC-yqhD。然后用Sphl和Nsil从pCR4Blunt-TOPO-6wc^切除6wc^5基因，释放1.8kbp片段。用Sphl和Pstl消化pUC19dHS-ilvC-yqhD并连接Sphl/Nsil片段(Nsil和Pstl产生相容性末端)，形成pUC19dHS-budB-ilvC-yqhD。用Xbal和BamHI从pCR4Blunt-TOPO-ilvD切除1.9kbp含有〃vD基因的片段，并连接用这些相同的酶消化过的pUC19dHS-budB-ilvC-yqhD，形成pUC19dHS-budB-UvC-ilvD-yqhD。最后，用BamHI和Sacl从pCR4Bhmt-TOPO-kivD切除hvD,释放1.7kbp片段。将该片段连接之前已经用BamHI和Sacl消化过的pUC19dHS-budB-ilvC-ilvD-yqhD,形成pUC19dHS-budB-UvC-ilvD-kivD-yqhD。用AflII和Spel消化pUC19dHS-budB-ilvC-ilvD-kivD-yqhD来释放克隆至pBenAS(大肠杆菌-枯草杆菌穿梭载体)中的8.2kbp操纵子片段。通过修饰pBE93栽体来形成质粒，Nagamjan描迷了这(W093/24631,实施例4)。为了制备pBenAS，用pBE93的Nco細ndIII消化除去解淀粉芽孢杆菌(j5ac/'〃wa/wy/o/^w^bc/e"j)中性蛋白酶启动子(NPR)，信号序列和；/io力基因。从pBE93PCR扩增NPR启动子，使用引物BenNF和BenASR，各自如SEQIDNO:29和30给出。引物BenASR在启动子下游引入AflH，Spel和HindIII位点。用Ncol和HindIII消化PCR产物，并将片段克隆至栽体中的相应位点中，形成pBenAS。将操纵子片段亚克隆至pBenAS中的AflII和Spel位点中，形成pBen-bu犯"lvC-ilvD-kivD-yqhD。实施例7(预测的)大肠杆菌中异丁酵生物合成途径的表达该预测实施例的目的是描述怎样在大肠杆菌中表达异丁醇生物合成途径。将按照实施例6中所述构造的质粒pBen-budB-ilvC-ilvD-kivD-yqhD转化至大肠杆菌NM522中(ATCCNo.47000)，来获得大肠杆菌株NM522/pBen-budB-ilvC-ilvD-kivD-yqhD,并通过SDS-PAGE,酶测试和蛋白质印迹分析来监控操纵子中的基因表达。对于蛋白质印迹，通过Sigma-Genosys(TheWoodlands,TX)引发对合成肽的抗体。将大肠杆菌抹NM522/pBen-budB-i〗vC-HvD-kivD-yqhD接种至含有50mL培养基的250mL摇瓶中并在250rpm和35'C振荡。培养基组成如下葡萄糖(5g/L)，MOPS(0.05M),硫酸铵(0.01M)，磷酸钾，单价碱(0.005M)，S10金属混合物(l%(v/v))，酵母提取物(0.1%(w/v))，酪蛋白氨基酸(0.1%(w/v)),疏胺素(0.1mg/L)，脯氨酸(0.05mg/L)，和生物素(0.002mg/L)，并用KOH滴定至pH7.0。S10金属混合物含有MgCl2(200mM)，CaCl2(70mM)，MnCl2(5mM)，FeCl3(O.lmM),ZnCl2(0.1mM)，盐酸硫胺素(0.2mM)，CuS04(172pM)，CoCl2(253nM)和Na2MoC04(242pM)。18h小时后，通过HPLC或GC分析来检测异丁醇，使用本领域公知的方法，例如，以上一般方法部分中所述的。实施例8(预测的)枯草芽孢杆菌中异丁酵生物合成途径的表达该预测实施例的目的是描述怎样在枯草芽孢杆菌中表达异丁醇生物合成途径。使用实施例7中所述的相同方法。使用按照实施例6中所迷构造的质粒pBen-budB-ilvC-ilvD-kivD-yqhD。将该质粒转化至枯草芽孢杆菌BE1010中U.Sa"e"o/.173:2278-2282(1991))来获得枯草芽孢杆菌株BE1010/pBen-budB-ilvC-iWD-kivD-yqhD，并按照实施例7中所迷的来监控每个操纵子中的基因表达。将枯草芽孢杆菌林BE1010/pBen-budB-ilvC-ilvD-kivD-yqhD接种至含有50mL培养基的250mL摇瓶中并在250rpm和35'C振荡18h。培养基组成如下葡萄糖(5g/L)，MOPS(0.05M),谷氨酸(0.02M)，硫酸铵(0.01M)，磷酸钾，单价碱緩沖剂(0.005M)，S10金属混合物(和实施例11中所述的一样，l%(v/v))，酵母提取物(0.1%(w/v))，酪蛋白氨基酸(0.1%(w/v))，色氨酸(50mg/L),甲硫氨酸(50mg/L)和赖氨酸(50mg/L)，并用KOH滴定至pH7.0。18h小时后，通过HPLC或GC分析来检测异丁醇，使用本领域公知的方法，例如，以上一般方法部分中所迷的。实施例9乙酰乳酸合酶的克隆和表达为了形成另一个乙酰乳酸合酶表达克隆，将6wi^基因克隆至栽体pTrc99A中。首先从pENTRSDD-TOPObudB(实施例1中所述的)扩增budB基因，使用在5'端引入Sacl,印el和A^el位点和3'端引入J36va,4/7/1和^^//1位点的引物(NU0.2和N111.2，各自如SEQIDNO:31和32给出)。将所得到的1.75kbpPCR产物克隆至pCR4-BluntTOPO(Invitrogen)中，并证实了DNA序列(使用N130S叫测序引物Fl-F4和R1-R4,各自如SEQIDNO:40-47给出)。然后使用和从该栽体切除基因并克隆至pTrc99A中(Amann等，Gewe69(2):30卜315(1988)),产生pTrc99A::bu犯。将pTrc99A::budB栽体转化至大肠杆菌TOP10细胞中并将转化体接种至补充50//g/mL氨千青霉素的LB培养基中并生长过夜。将等份的过夜培养物用来接种50mL补充50pg/mL氨爷青霉素的LB。将培养物在37'C振荡培养直至OD600达到0.6-0.8。然后通过加入0.4mMIPTG来谏导从Trc启动子的^wfJ5表达。还制备了没有用IPTG诱导的阴性对照摇瓶。将摇瓶在37匸振荡培养4h。按照实施例1中所迷的制备无细胞培养物。按照实施例1中所述的测量无细胞提取物中的乙酰乳酸合酶活性。用IPTG诱导后三个小时，检测到8单位/mg的乙酰乳酸合酶活性。只携带pTrc99A质粒的对照菌株呈现出0.03单位/mg的乙酰乳酸合酶活性。实施例10乙酰酵酸还原异构酶的克隆和表达该实施例的目的是从大肠杆菌K12克隆z/vC基因并在大肠杆菌TOP10中表达。使用PCR从大肠杆菌菌抹FM5(ATCC53911)扩增z'/vC基因。以以上实施例2中对ilvC的克隆和表达所述的相同方式克隆和表达,7vC基因。使用PCR从大肠杆菌FM5基因组扩增//vC，使用引物Nl12.2和Nl13.2(各自为SEQIDNO:33和34)。引物在5，端形成Sacl和4/7/II位点以及最佳的RBS，在//vC的3，端形成A^I,A^el和^37w//1位点。根据制造商的实验方案(Invitrogen)将1.5kbpPCR产物克隆至pCR4BluntTOPO中，产生pCR4BluntTOPO::ilvC。使用测序引物(N131SeqFl-F3，和N131SeqR卜R3，各自如SEQIDNO:48-53给出)证实了PCR产物的序列。为了形成表达克隆，使用Sacl和万am/ZI从pCR4BluntTOPO::ilvC切除//vC基因并克隆至pTrc99A中。将pTrc99A::ilvC栽体转化至大肠杆菌TOP10细胞中并通过加入IPTG诱导从Trc启动子的表达，如实施例9中所迷的。按照实施例1中所迷的制备无细胞提取物。按照实施例2中所迷的测量无细胞提取物中的乙酰醇酸还原异构酶活性。用IPTG诱导三小时后，检测到0.026单位/mg的乙酰醇酸还原异构酶活性。只携带pTrc99A质粒的对照菌抹呈现出低于0.001单位/mg的乙酰醇酸还原异构酶活性。实施例11乙酰醇酸脱水酶的克隆和表达该实施例的目的是从大肠杆菌K12克隆！7vD基因并在大肠軒菌TOP10中表达。使用PCR从大肠杆菌菌抹FM5(ATCC53911)扩增《7vD基因。以实施例10中所述的//vC基因相同的方式克隆和表达Z/vD基因。使用PCR从大肠杆菌FM5基因组扩增//vZ),使用引物N114.2和NU5.2(各自为SEQIDNO:35和36)。引物在5'端形成^cl和WAel位点以及最佳的RBS,在的3，端形成尸acl和位点。根据制造商的实验方案(Invitrogen)将1.9kbpPCR产物克隆至pCR4BluntTOPO中，产生pCR4BluntTOPO::ilvD。证实了PCR产物的序列(测序引物N132SeqFl-F4，和N132SeqRl-R4，各自如SEQIDNO:54-61给出)。为了形成表达克隆，使用5""cl和i5"/w//1从质粒pCR4BluntTOPO::ilvD切除z/vD基因并克隆至pTrc99A中。将pTrc99A::ilvD载体转化至大肠杆菌TOP10细胞中并通过加入IPTG诱导从Trc启动子的表达，如实施例9中所述的。按照实施例1中所迷的制备无细胞提取物。按照实施例3中所述的测量无细胞提取物中的乙酰醇酸脱水酶活性。用IPTG诱导三小时后，测量到46单位/mg的乙酰醇酸脱水酶活性。只携带pTrc99A质粒的对照菌株没有呈现出乙酰酵酸脱水酶活性。实施例12支链酮酸脱羧酶的克隆和表达该实施例的目的是从乳酸乳球菌克隆yb'vD基因并在大肠杆菌TOP10中表达。以以上实施例10中对z7vC所迷的相同方式克隆和表达hvZ)基因。使用PCR从质粒pUC57-kivD(参见以上的实施例4)扩增ibvZ)，使用引物N116.2和NU7,2(各自为SEQIDNO:37和38)。引物在5，端形成SacI和尸acI位点以及最佳的RBS，在hvZ)的3，端形成爿w11，Sg/II和位点。根据制造商的实验方案(Invitrogen)将1.7kbpPCR产物克隆至pCR4BluntTOPO中，产生pCR4BluntTOPO::kivD。使用引物N133SeqFl-F4，和N133SeqRl-R4(各自如SEQIDNO:62-69给出)证实了PCR产物的序列。为了形成表达克隆，使用和Saw//I从质粒pCR4BluntTOPO::kivD切除//vD基因并克隆至pTrc99A中。将pTrc99A::kivD栽体转化至大肠杆菌TOP10细胞中并通过加入IPTG诱导从Trc启动子的表达，如实施例9中所述的。按照实施例1中所迷的制备无细胞提取物。按照实施例4中所迷的测量无细胞提取物中的支链酮酸脱羧酶活性，除了使用P，ld喊剂(Aldrich，目录No,162892)来检测和定量眵反应产物。用IPTG诱导三小时后，检测到高于3.7单位/mg的支链酮酸脱羧酶活性。只携带pTrc99A质粒的对照菌林没有呈现出支链酮酸脱羧酶活性。实施例13支链酵脱氪酶的表达大肠杆菌含有鉴定为1,3-丙二醇脱氢酶的天然基因(:^/zZ))(U.S.专利No.6,5M,733)。YqhD蛋白与来自梭菌的AdhB(由adhB编码)具有40%同一性，AdhB是推定的NADH-依赖性丁醇脱氯酶。使用人Red技术(Datsenko和Wanner,尸rac.A^".爿cac/.Sc,'.".S,A97:6640(2000))将y一D基因置于大肠杆菌菌株MG16551.6yqhD::Cm(WO2004/033646)中的葡萄糖异构酶启动子1.6GI(SEQIDNO.70)变体的组成型表达之下。MG16551.6yqhD::Cm含有FRT-CmR-FRT盒，使得可以除去抗生素标记。相似地，由1.5GI启动子(W2003/089621)(SEQIDN0.71)替代天然启动子，形成菌抹MG16551.5GI-yqhD::Cm,因此，用1.5GI启动子替代了MG16551.6yqhD::Cm的1.6GI启动子。将菌林MG16551.5GI-yqhD::Cm在LB培养基中生长至中-对数期并按照实施例I中所述的制备无细胞提取物。测定细胞提取物时，按照在pH7.5和35。C在340nm的吸收值降低，发现该菌株具有NAPDH-依赖性异丁眵还原酶活性。为了产生第二个含有1.5GIyqhD::Cm的表达菌抹，从MG16551.5GIyqhD::Cm制备Pl裂解物，并通过转导将盒转移至BL21(DE3)(Invitrogen),形成BL21(DE3)1.5GIyqhD::Cm。实施例14用于异丁醇生物合成途径中头四个基因的转化栽体的构建该实施例的目的是构建包括异丁醇生物合成途径中头四个基因(即，6wc^，z/vC，//vD和hvD)的转化栽体。为了构建转化栽体，首先，通过用和Sa;w//1消化从pTrc99A::ilvC(实施例10中所述的)获得/7vC基因并克隆至pTrc99A::budB中(实施例9中所述的)，将其用和imw//1消化来产生质粒pTrc99A::budB-ilvC。接着，各自通过用廳I和尸acl(UvD)以及尸acl和J5a/M//1(kivD)从pTrc99A::ilvD(实施例11中所述的)和pTrc99A::kivD(实施例12中所述的)获得//vZ)和A:/vD基因。通过三路(three-way)连接将这些基因引入首先用A^el和消化的pTrc99A::budB-ilvC中。通过PCR筛选和限制消化证实了最后的质粒pTrc99A::budB-ilvC-ilvD-kivD中的所有四个基因。实施例15生长于葡萄糖之上的大肠杆菌中异丁酵生物合成途径的表达为了形成大肠杆菌异丁醇生产菌抹，将pTrc99A::budB-ilvC-ilvD-kWD(实施例14中所述的)转化至大肠杆菌MG16551.5GIyqhD::Cm和大肠杆菌BL21(DE3)1.5GIyqhD::Cm(实施例13中所述的)中。最初将转化体生长在含有5(Hig/mL卡那霉素和100ng/mL羧千青霉素的LB培养基中。将来自这些培养物的细胞用来接种摇瓶(大约175mL总体积)，摇瓶含有50或170mLTM3a/葡萄糖培养基，各自表示高和低氧条件。TM3a/葡萄糖培养基含有(每升)葡萄糖(10g)，KH2P04(13.6g),柠檬酸一水合物(2.0g)，(NH4)2S04(3.0g),MgS04.7H20(2.0g)，CaCl2'2H20(0.2g)，杆檬酸铁铵(0,33g),.HCl(l.Omg)，酵母提取物(0.50g),和10mL微量元素溶液。用NH4OH将pH调节至6.8。孩吏量元素溶液含有柠檬酸.H20(4.0g/L)，MnSO4.H2O(3.0g/L)，NaCl(l.Og),FeS04.7H20(0.10g/L)，CoCl2.6H2O(0,10g/L)，ZnS04.7H20(0.10g/L)，CuS04.5H20(0.010g/L)，H3B03(0.010g/L)，和Na2MoS04.2H20(0.010g/L)。在SO.Ol单位的起始OD6oo接种摇瓶并在34。C300rpm振荡培养。用0.2nm过滤器帽子密封含有50mL培养基的摇瓶；用密封的帽子封闭含有150mL培养基的摇瓶。当细胞达到OD60020.4单位时，加入IPTG至0.04mM的终浓度。大约培养18h后，通过HPLC(ShodexSugarSHlOll柱(ShowaDenkoAmerica,Inc.NY),4吏用折射率(RI)检测)和GC(VarianCP-WAX58(FFAP)CB,0.25mmx0.2nmx25m(Varian，Inc.,PaloAlto,CA，使用火焰电离检测(FID))分析等份培养基的异丁醇含量，如一般方法部分中所迷的。在只携带pTrc99A栽体的对照菌抹中没有检测到异丁醇(结果未显示)。表5中显示了通过携带pTrc99A::budB-ilvC-ilvD-kivD的菌株产生的异丁醇摩尔选择性和滴定度。在低氧条件下生长的培养物中获得显著较高的异丁醇滴定度。生长于葡萄糖之上的大肠杆菌菌林产生的异丁醇<table>tableseeoriginaldocumentpage61</column></row><table>承通过HPLC测定的实施例16生长于蔗糖之上的大肠杆菌中异丁酵生物合成途径的表达因为实施例15中所迷的菌株不能够生长于蔗糖之上，构建另外的质粒以允许利用蔗糖用于异丁醇生产。从源自ATCC菌抹13281的利用蔗糖的大肠杆菌菌林的基因组DNA分离蔗糖利用基因簇wcS^4，如SEDIDNO:39所给出的。蔗糖利用基因(cj"，"c尺和c"5)编码蔗糖水解酶(CscA),如SEQIDNO:139所给出的，D-果糖激酶(CscK)，如SEQIDNO:140所给出的，和蔗糖透性酶(CscB)，如SEQIDNO:141所给出的。没有包括蔗糖特异性阻遏基因c化凡使得三个基因c"S/C4在大肠杆菌中从它们的天然启动子组成型表达。用5flm/ZI和消化来自蔗糖利用大肠杆菌菌抹的基因组DNA。从琼脂糖凝胶分离具有约4kbp平均大小的片段并连接用^w^！和五co尺I消化的质粒pLitmus28(NewEnglandBiolabs)，并转化至超感受态大肠杆菌TOP10F，细胞中(Invitrogen)。将转化体在含有1%蔗糖和氨爷青霉素(100ng/mL)的MacConkey琼脂平板上划线并筛选紫色菌落的外观。从紫色转化体分离质粒DNA,并用M13正向和反向引物(Invitrogen)以及Scrl-4(各自如SEQIDNO:72-75中所给出的)测序。将含有"cS，c化AT和"c」(cjc^A:」)基因的质粒命名为pScrl。为了形成与异丁醇途径质粒(实施例14)相容的蔗糖利用质粒，将来自pScrl的操纵子亚克隆至pBHRl中(MoBiTec，Goettingen，Germany)。通过用ZAoI消化pScrl(接着用Klenow酶培养来产生钝末端)，然后用爿gel消化来分离c^^/^基因。将所得到的4.2kbp片段连接已经用A^ad和」gd消化的pBHRl中，形成9.3kbp质粒pBHRl::cscBKA。通过电穿孔将蔗糖质粒pBHRl::cscBKA转"化至大肠杆菌BL21(DE3)1.5yqhD/pTrc99A::bu犯-ilvC-ilvD-kivD和大肠杆菌MG16551.5yqhD/pTrc99A::budB-ilvC-ilvD-kivD中(实施例15中所述的)。首先在含有10(Hig/mL氨苄青霉素和50ng/mL卡那霉素的LB培养基上选择转化体，然后在MacConkey蔗糖(1%)平板上筛选来证实蔗糖操纵子的功能表达。为了异丁醇的生产，将菌抹生长于含有替代葡萄糖的1%蔗糖的TM3a最小限定培养基中(实施例15中所述的)，分析培养基中所产生的异丁醇含量，如实施例15中所迷的，除了在培养14h后取样。再者，在只携带pTrc99A载体的对照菌林中没有检测到异丁醇(结果未显示)。表6中显示了通过携带pTrc99A::budB-ilvC-ilvD-kivD的MG16551.5yqhD产生的异丁醇的摩尔选择性和滴定度。表6<table>tableseeoriginaldocumentpage63</column></row><table>"^通过HPLC测定的实施例17酿酒酵母中异丁酵途径基因的表达为了在酿酒酵母中表达异丁醇途径基因，构建多个大肠杆菌-酵母穿梭栽体。使用PCR方法(Yu等，Fw"ga/5zo/.41:973-981(2004))来融合具有酵母启动子和终止子的基因。特别地，将GPD启动子(SEQIDNO:76)和CYC1终止子(SEQIDNO:77)融合来自枯草芽孢杆菌的fl"S基因(SEQIDNO:78),将FBA启动子(SEQIDNO:79)和CYC1终止子融合来自酿酒酵母的ILV5基因(SEQIDNO:80),将ADHl启动子(SEQIDNO:81)和ADHl终止子(SEQIDNO:82)融合来自酿酒酵母的ILV3基因(SEQIDNO:83)，将GPM启动子(SEQIDNO:84)和ADHl终止子融合来自乳酸乳球菌的h'vD基因(SEQIDNO:7)。将表7中给出的引物设计来包括限制位点，用于将启动子/基因/终止子产物克隆至来自pRS400系列的大肠杆菌-酵母穿梭栽体中(Christianson等，110:119-122(1992))，并用于交换构建体之间的启动子。用于ILV5和ILV3的5'端的引物(各自为N138和N155,各自如SEQIDNO:95和107给出的)产生新的起始密码子来消除这些酶的线粒体靶向。首先通过TOPO克隆反应(Invitrogen)将所有融合的PCR产物克隆至pCR4-Blunt中，并证实了序列(使用M13正向和反向引物(Invitrogen)以及表7中提供的测序引物)。通过TOPO反应将另外两个启动子(CUP1和GAL1)克隆至pCR4-Bhmt中，并通过测序来证实；表7中显示了引物序列。表8中描迷了构建的质粒。将质粒转化至酿酒酵母BY4743(ATCC201390)或YJR148w(ATCC4036939)中，以使用实施例1-4和实施例9-12中所述的酶测试来测定酶特异性活性。为了测定酶活性，将培养物在缺少表达质粒选择需要的任何代谢物的合成完全培养基(M"AoA,";TeaWGe"e"cs，2005，ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY,pp.201-202)中生长至1.0的OD60Q,通过离心收集(在4'C2600xg8分钟)，用緩沖液洗涤，再次离心，并冷冻于-80'C。将细胞融化，重悬浮于20mMTris-HClpH8.0中至2mL的终体积，然后使用1.2g玻璃珠(0.5mm大小)使用珠子搅拌器来破坏。将每个样品在高速处理总的3分钟时间(每分钟搅打后在水上孵育)。通过离心将提取物清除细胞碎片(在4'C,20,000xg10分钟)。用于酿酒酵母表达栽体的克隆和测序的引物序列<table>tableseeoriginaldocumentpage64</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage65</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage66</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage67</column></row><table>表8携带异丁醇途径基因的大肠杆菌-酵母穿梭栽体<table>tableseeoriginaldocumentpage67</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage68</column></row><table>45mL培养基加入用有波紋的帽子密封的60mL血清瓶中来制备低氣培养物。按照需要，无菌注射器用来取样和加入诱导剂。接种后大约24h，将诱导剂CuS04加入至0.03M终浓度。还制备了每个菌株没有添加CuS04的对照培养物。通过GC和HPLC分析CuS04加入后18或19h和35h的培养物上清液的异丁醇含量，如以上实施例15中所述的。表9中呈现了生长于葡萄糖之上的S良酒酵母YJR148w/pSR423::CUPl-alsS+FBA-ILV3/pHR81::FBA-ILV5+GPM-kivD的结果。对于表9中给出的结果，在35h从好氧培养物取样，在19h从低氧培养物取样，并通过HPLC测量。表10中呈现了生长于蔗糖之上的酿酒酵母YJR148w/pSR423::CUPl-alsS+FBA-ILV3/pHR81::FBA-ILV5+GPM-kivD的结果。用18h取的样并通过HPLC测量来获得该表中的结果。41通过生长于葡萄糖之上的酿酒酵母YJR148w/DSR423::CUPl-alsS+FBA-ILV3/oHR81::FBA-ILV5+GPM-kivD的异丁酵生产<table>tableseeoriginaldocumentpage70</column></row><table>脑通过生长千蔗糖之上的酿酒酵母YJR148w/DSR423::CUPl-aisS+FBA-ILV3/pHR81::FBA-ILV5+GPM-kivD的异丁醇生产<table>tableseeoriginaldocumentpage71</column></row><table>菌株后缀"a，，,"b"和"c"表示分开的分离物。结果显示了，在好氧和低氧条件下在葡萄糖或蔗糖上生长，菌林YJR148w/pSR423::CUP1-alsS+FBA-ILV3/pHR81::FBA-ILV5+GPM-ldvD—致地生产出比对照菌株更高水平的异丁醇。实施例19通过重组酿酒酵母的异丁醇生产将质粒pRS425::CPUl-alsS+FBA-ILV3和pRS426::GALl-ILV5+GPM-kivD(实施例17中所迷的)转化至酿酒酵母YJR148w中来产生菌抹YJR148w/pRS425::CPU1-alsS+FBA-ILV3/pRS426::GAL1-ILV5+GPM-kivD。通过将栽体pSR425和pRS426(实施例17中所述的)转化至酿酒酵母YJR148w中制备对照菌抹(YJR148w/pSR425/pRS426)。将菌林维持于合成完全培养基上，如实施例18中所述的。为了异丁醇生产，将细胞转移至含有2%半乳糖和1%棉子糖而缺少尿嘧啶和亮氨酸的合成完全培养基中。按照实施例18中所迷的制备好氧和低氧培养物。接种后大约12h，将诱导剂CuS04加入高达至0.5mM的终浓度。还制备了每个菌林没有添加CuS04的对照培养物。在CuS04加入后23h将培养物上清液取样，如实施例18中所述的。表11中呈现了结果。由于观察到的最终光密度非常不同并与定量残留的碳源相关，表中提供了每OD600单位的异丁醇浓度(替代摩尔选择性)，以允许将含有异丁醇生物合成途径基因的菌株与对照相比较。ill通过生长于半乳糖和棉子糖之上的酿酒酵母YJR148w/dRS425::CPU1-alsS+FBA-ILV3/dRS426::GAL1曙ILV5+GPM-kivD的异丁__酵生产_<table>tableseeoriginaldocumentpage73</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage74</column></row><table>菌抹后缀"a"，"b"，"c"，"d"和"e"表示分开的分离物。结果表示总的说来，在好氧和低氧条件下，与对照菌抹相比较，YJR148w/pRS425::CPU1-alsS+FBA-ILV3/pRS426::GAL1-ILV5+GPM-kivD菌抹产生的每光密度单位的异丁醇水平更高。实施例20枯草芽孢杆菌中异丁醇生物合成途径的表达该实施例的目的是在枯草芽孢杆菌中表达异丁醇生物合成途径。将异丁醇途径的五个基因(图1中的途径步骤(a)至(e))分成两个用于表达的操纵子。将各自编码乙酰乳酸合酶，乙酰醇酸脱水酶和支链酮酸脱羧酶的三个基因6wfi仏//v￡>和A:/vZ)整合至枯草芽孢杆菌BE1010的染色体中(Payne和Jackson,Sa"e"o/.173:2278-2282(1991))。将各自编码乙酰醇酸异构还原酶和丁醇脱氢酶的两个基因杆菌菌抹中。、'、'i三个基因6z^仏//vD和A:/vD整合至枯草芽孢杆菌BE1010的染色体中。芽孢杆菌整合栽体pFP988DssPspac和pFP988DssPgroE用于三个基因6wa^(SEQIDNO:1)，//vD(SEQIDNO:5)和hvZ)(SEQIDNO:7)的染色体整合。两个质粒都含有来自pBR322的大肠杆菌复制子，用于在大肠杆菌中选择的氨节青霉素抗生素标记和两个与枯草芽孢杆菌染色体中的^cS基因同源的指导栽体整合的片段，以及通过同源重组的插入序列。在sacB同源片段之间是pFP988DssPspac上的spac启动子(PgroE)或pFP988DssPgroE上的groEL启动子(PgroE),和用于芽孢杆菌的选择标记，红霉素。启动子片段还含有/acO序列，用于调节/ac/阻遏蛋白的表达。pFP988DssPspac(6,341bp)和pFP988DssPgroE(6,221bp)的序列各自如SEQIDNO:142和SEQIDNO:143给出的。通过从质粒pTrc99abudB-ilvC-ilvD-kivD删除VvC基因来构建具有三个基因6w6S-z7vZ)-h'vZ)的盒。实施例14中描述了质粒pTrc99A::budB-ilvC-ilvD-kivD的构建。用AflII和Nhel消化质粒pTrc99A::budB-iWC-ilvD-kivD,用DNA聚合酶的Klenow片段处理来制备钝末端，并凝胶纯化含有pTrc99a栽体，6w^5,z'/vD和yb'vD的所得到的9.4kbp片段。将9.4kbp栽体片段自我连接来形成pTrc99A::budB-ilvD-kivD，并转化至DH5a感受态细胞(Invitrogen)中。通过限制性作图证实pTrc99a::budB-ilvD-kivD克隆的//vC基因删除。用Sacl消化所得到的质粒pTrc99A::budB"lvD-kivD并用DNA聚合酶的Klenow片段处理来制备钝末端。然后用BamHI消化质粒并将所得到的5,297bp6wc^-,7vZ)-/b'vD片段凝胶纯化。将5，297bp6t^^-z7vZ)-A:/vD片段连接整合栽体pFP988DssPspac的Smal和BamHI位点。将连接混合物转化至DH5a感受态细胞中。通过5.3kbp6w必"/v/)-hvD片段的PCR扩增来筛选转化体，使用引物T-budB(BamHI)(SEQIDNO:144)和B-kivD(BamHI)(SEQIDNO:145)。将正确的克隆称为pFP988DssPspac-bu犯-ilvD-kivD。从大肠杆菌转化体制备质粒pFP988DssPspac-budB-ilvD-kivD，并转化至按照Doyle等所迷制备的枯草芽孢杆菌BE1010感受态细胞中(J.Bacteriol.144:957(1980))。通过离心收集感受态细胞并将细胞沉淀物重悬浮于小体积的上清液中。将两体积的SPII-EGTA培养基加入一体积的感受态细胞中(A^e/Zzoo^/brGe"era/am/AYo/ecw/or5<2"w'o/ogy,P.Gerhardt等,编辑，AmericanSocietyforMicrobiology,Washington,DC(1994))。将等份(0.3mL)细胞分散于试管中，然后将2至3pg质粒pFP988DssPspac-budB-ilvD-kivD加入试管中。将试管在37。C振荡培养30分钟，此后将O.lmL10°/。酵母提取物加入每个试管中，然后进一步培养60分钟。将转化体生长于用于选择的含有红霉素(1.(Hig/mL)的LB平板上，使用双重琼脂覆盖方法(Mef/joA/orGenem/Mo/ecw/ar5a"eno/ogy,丄X)。通过PCR扩增筛选转化体，对于使用引物N130S叫F1(SEQIDNO:40)和N130S叫R1(SEQIDNO:44),对于hvZ)使用引物N133S叫Fl(SEQIDNO:62)和N133SeqRl(SEQIDNO:66)。阳性整合体显示出预期的1.7kbp6w必和1.7kbpA:/vDPCR产物。鉴定了两个阳性整合体并命名为枯草芽孢杆菌BEIOIO△sacB::Pspac-budB-ilvD-kivD#2-3-2和枯草芽孢杆菌BE1010厶sacB::Pspac-budB曙ilvD-kivD#6-12-7。整合体枯草芽孢杆菌BE1010AsacB::Pspac-budB-ilvD-kivD#2-3-2和枯草芽孢杆菌BE1010AsacB::Pspac-budB-iivD-kivD#6-12-7中的酶活性测定表明BudB，IlvD和KivD在spac启动子(Pspac)的控制下是低的。为了提高功能性酶的表达，由来自质粒pHTOl(MoBitec，Goettingen，Germany)的PgroE启动子替代Pspac启动子。通过Xhol和BamHI限制性消化从不相关的质粒切除6,039bppFP988Dss栽体片段，如SEQIDNO:146给出的，并凝胶纯化。从质粒pHTOlPCR扩增PgroE启动子，使用引物T-groE(Xhol)(SEQIDNO:147)和B曙groEL(Spel,BamHI)(SEQIDNO:148)。用Xhol和BamHI消化PCR产物，连接6,039bppFP988Dss栽体片段，并转化至DH5a感受态细胞中。通过PCR扩增筛选转化体，使用引物T-groE(Xhol)和B-groEL(Spel，BamHI)。阳性克隆显示出预期的174bpPgroEPCR产物并称为pFP988DssPgroE。还通过DNA测序证实了质粒pFP988DssPgroE。用Spel和Pmel消化质粒pFP988DssPspac-budB-ilvD-kivD并将所得到的5,313bpbu犯-ilvD-kivD片段凝胶純化。将budB-ilvD-kivD片段连接pFP988DssPgroE的Spel和Pmel位点并转化至DH5a感受态细胞中。通过PCR扩增筛选阳性克隆的1，6卯bpPCR产物，使用引物T-groEL(SEQIDNO:149)和Nlll(SEQIDNO:20)。将阳性克隆称为pFP988DssPgroE-budB-ilvD-kivD。从大肠杆菌转化体制备质粒pFP988DssPgroE-budB-ilvD-kivD，并转化至枯草芽孢杆菌BE1010感受态细胞中，如上所迷。通过PCR扩增筛选转化体，对于6w必使用引物N130SeqFl(SEQIDNO:40)和N130S叫R1(SEQIDNO:44)，对于A/vD使用引物N133S叫F1(SEQIDNO:62)和N133SeqRl(SEQIDNO:66)。阳性整合体显示出预期的1.7kbp6w必和1.7kbp/b'vZ)PCR产物。分离了两个阳性整合体并命名为枯草芽孢杆菌BE1010AsacB::PgroE-budB-ilvD-kivD#1-7和枯草芽孢杆菌BE1010厶sacB::PgroE-budB-ilvD-kivD#8-16。!7vC和6d/^基因的质粒表达。从质粒表达两个剩余的异丁酵基因，z/vC和Z^/2S。将质粒pHT01(MoBitec)，芽孢杆菌-大肠杆菌穿梭栽体，用于将来自枯草芽孢杆菌的Z/vC基因与PgroE启动子融合，使得Z/vC基因从含有/acO序列的PgroE启动子表达。从枯草芽孢杆菌BR151(ATCC33677)基因组DNAPCR扩增,7vC基因，如SEQIDNO:186给出的，使用引物T-ilvCB.s.(BamHI)(SEQIDNO:150)和B-ilvCB.s.(SpelBamHI)(SEQIDNO:151)。用BamHI消化l,067bp//vCPCR产物并连接pHTOl的BamHI位点。将连接混合物转化至DH5a感受态细胞中。通过PCR扩增筛选阳性克隆的l，188bpPCR产物，使用引物T-groEL和B-ilvB.s(SpelBamHI)。将阳性克隆称为pHT01-ilvC(B.s)。将质粒pHTOl-ilvC(B.s)用作PgroE-ilvC融合片段的PCR扩增的才莫板。质粒pBD64(Minton等，Wwc/e/c爿c/A18'.1651(1990))是相当稳定的载体，用于在枯草芽孢杆菌中表达外源基因，并含有repB基因以及氯霉素和卡那霉素抗性基因，用于在枯草芽孢杆菌中的选择。该质粒用于！7vC和6d/zfi在PgroE启动子控制下的表达。为了将PgroE-i/vC，和/ac/阻遏基因克隆至质粒pBD64中，使用一步装配方法(Tsuge等，A^c/e/c爿c/^尺仏31:e133(2003))。从pBD64PCR扩增3,588bppBD64片段，该片段含有^/7i5基因，其包括复制功能，和卡那霉素抗生素标记，使用引物T-BD64(DraIII)(SEQIDNO:152),其引入DraIII序列(CACCGAGTG),和B-BD64(DraIII)(SEQIDNO:153)，其引入Drain序列(CACCTGGTG)。从pMUTIN4PCR扩增1，327bp/ac/阻遏基因(Vagner等，Mcra6/。/.144:3097-3104(1988)),使用T-lacIq(DraIII)(SEQIDNO:154)，其引入了DraIII序列(CACCAGGTG),和B-lacIq(DraIII)(SEQIDNO:155),其引入了DmIII序列(CACGGGGTG)。从p謂l-ilvC(B,s)PCR扩增l,224bpPgroE-ilvC融合的盒，使用T-groE(DraIII)(SEQIDNO:156),其引入了Drain序列(CACCCCGTG),和B-B.s.ilvC(DraIII)(SEQIDNO:157)，其引入了DraIH序列(CACCGTGTG)。从丙醇丁酮梭菌(ATCC824)基因组DNAPCR扩增1.2kbpW/^基因(SEQIDNO:158)，使用引物T-bdhB(DraIII)(SEQIDNO:159),其引入了DmIII序列(CACACGGTG)，和B-bdhB(rrnBTlDraIII)(SEQIDNO:160),其引入了DraIII序列(CACTCGGTG)。Dralll识别序列的可变区中的三个下划线字母是为了特异性碱基配对而设计的，以pBD64-/ac/-PgroE,7vC-Z^//^的次序装配四个片段。用Drain分开消化两个末端的每个具有Dralll的PCR产物，将所得到的Dralll片段，3,588bppBD64,/ac/，PgroE/7vC和凝胶純化，使用QIAGEN凝胶提取试剂盒(QIAGEN)。制备含有等摩尔浓度的每个片段的混合物，用于连接，总DNA浓度为30至50ng/100fiL。然后将连接溶液在16'C孵育过夜。连接产生高分子量串联重复DNA。将连接的长线性DNA混合物直接转化至感受态枯草芽孢杆菌BEIOIO中，按照以上所迷的来制备。枯草芽孢杆菌优选采用长的重复的线性DNA形式，而不是环状DNA来建立质粒。转化后，将培养物涂布在含有1(Hig/mL卡那霉素的LB平板上，用于选择。通过Dralll消化筛选阳性重组质粒，获得四个具有预期大小3，588bp(pBD64)，l,327bp(/ac/)，1'244bp(PgoE々/vC)和1,194bp(W/^)的片段。将阳性质粒称为pBDPgroE-ilvC(B.s.)-bdhB。通过枯草芽孢杆菌BEIOIOAsacB::PgroE-budB-ilvD-kivD/DBDPgroE-ilvC(B.s.VbdhB从葡菊糖或蔗糖生产异丁醇的证明。为了构建表达异丁醇生物合成途径的五个基因的重组枯草芽孢杆菌，如上所迷制备两个整合体枯草芽孢杆菌BEIOIOAsacB::PgroE-budB-ilvD-kivD#1-7和枯草芽孢杆菌BEIOIO厶sacB::PgroE-budB-ilvD-kivD#8-16的感受态细胞，并用质粒pBDPgroE-ilvC(B.s.)-bdhB转化，产生枯草芽孢杆菌BEIOIOAsacB::PgroE-budB-UvD-kivD#l-7/pBDPgroE-ilvC(B.s.)-bdhB和枯草芽孢杆菌BEIOIOAsacB::PgroE-budB曙ilvD-kivD#8-16/pBDPgroE-UvC(B.s.)-bdhB。将两个重组菌林在125mL烧瓶中的25mL或100mL含有卡那霉素(lOpg/mL)的葡萄糖培养基中培养，来各自模拟高氧和低氧条件，并在37。C200rpm振荡好氧生长。培养基由10mM(NH4)2S04,5mM磷酸钾緩冲液(pH7.0),100mMMOPS/KOH緩冲液(pH7.0),20mM谷氨酸/KOH(pH7.0),2。/。S10金属混合物，1%葡萄糖，0.01%酵母提取物，0.01%酪蛋白氨基酸以及各自50ng/mL的L-色氨酸，L-甲硫氨酸和L-赖氨酸组成。S10金属混合物由200mMMgCl2,70mMCaCl2，5mMMnCl2，O.lmMFeCl3,O.lmMZnCl2，0.2mM盐酸硫胺素，0.172mMCuS04,0.253mMCoCl2和0.242mMNa2MoC04组成。在早对数期(大约0.2的OD600)用l.OmM异丙基-P-D-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)诱导细胞。接种后24h，通过HPLC(ShodexSugarSHlOll柱)使用折射率(RI)检测分析等份培养液的异丁醇含量，如一般方法部分中所述。表12中显示了HPLC结果。表12通过枯草芽孢杆菌BE1010AsacB::PgroE-budB-UvD-kivD/pBDPgroE-ilvC(B.s.VbdhB菌株从葡菊糖生产异丁酵<table>tableseeoriginaldocumentpage79</column></row><table>枯草芽孢杆菌a是枯草芽孢杆菌BE1010△sacB::PgroE-budB-ilvD-kivD#l-7/pBDPgroE-ilvC(B.s.)-bdhB枯草芽孢杆菌b是枯草芽孢杆菌BE1010△sacB::PgroE-budB-ilvD-kivD#8-16/pBDPgroE-ilvC(B.s.)-bdhB还检测了枯草芽孢杆菌BE1010AsacB::PgroE-budB-iWD-kivD#l-7/pBDPgroE-ilvC(B.s.)-bdhB分离物从蔗糖的异丁醇生产，基本上如上所述。将重组菌林在125mL烧瓶中的25mL或75mL含有卡那霉素(lOpg/mL)的蔗糖培养基中培养，来模拟高氧和中等氧水平，并在37°C200rpm振荡生长。除了用10g/L蔗糖替代葡萄糖(10g/L)，蔗糖培养基与葡萄糖培养基相同。细胞没有诱导，或在早对数期(大约0.2的OD600)用l.OmM异丙基-卩-D-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)诱导。接种后24h,通过HPLC(ShodexSugarSHlOll柱)使用折射率(RI)检测分析等份培养液的异丁醇含量，如一般方法部分中所述。表13中显示了HPLC结杲。表13通过枯草芽孢杆菌BE1010AsacB::PgroE-bu犯-ilvD-kivD/DBDPgroE-ilvC(B.s.VbdhB菌株从蔗糖生产异丁酵菌林02水平异丁醉，mM摩尔选择性，％枯草芽孢杆菌a(未诸导)高未测出未测出枯草芽孢軒菌a(诱导的)高0.444.9枯草芽孢杆菌a(诱导的)中等0.838.6枯草芽孢杆菌a是枯草芽孢杆菌BE1010△sacB::PgroE-budB-ilvD-kivD#1-7/pBDPgroE-ilvC(B.s.)-bdhB实施例21(预测的)植物乳杆菌中异丁酵生物合成途径的表达该预测实施例的目的是描述怎样在植物乳杆菌中表达异丁醇生物合成途径。将异丁醇途径的编码五个酶活性的五个基因分至用于表达的两个操纵子中。通过同源重组将各自编码乙酰乳酸合酶，乙酰醇酸脱水酶和支链a-酮酸脱羧酶的基因6waf仏/7vD和/fc/vD整合至植物乳杆菌的染色体中，使用Hols等所述的方法(^p/.Em;!'nw.A^cra6〖o/.60:1401-1413(1994))。将剩余的两个基因(!7vC和M/i仏各自编码乙酰醇酸还原异构酶和丁醇脱氢酶)克隆至表达质粒中并转化至携带整合异丁醇基因的乳杆菌菌株中。将植物乳杆菌生长于37'CMRS培养基(DifcoLaboratories,Detroit,MI)中，并分离染色体DNA,如Moreira等所述的(SMCM/cro6/0/.5:15(2005))。整合。通过同源重组将合成Pll启动子(Rud等，M/cTo6/o/ogy152:1011-1019(2006))控制下的Zm必-歸-ybvD盒在/W丄/基因座整合至植物乳杆菌ATCCBAA-793(NCIMB8826)的染色体中。为了构建/说乙整合靶向栽体，将来自植物乳杆菌的具有/^丄同源性的DNA片段(GenbankNC—004567)PCR扩增，使用引物IDHEcoRVF(SEQIDNO:161)和IDHAatIIR(SEQIDNO:162)。将1986bpPCR片段克隆至pCR4Blunt-TOPO中并测序。用EcoRV和AatII消化pCR4Blunt-TOPO-IdhLl克隆，释放1982bpIdhLl片段，将其凝胶纯化。用HmdIII消化整合栽体pFR988,如SEQIDNO:177给出的，用KlenowDNA聚合酶处理来钝化末端。然后用AatII消化线性化的质粒，并将293lbp载体片段凝胶纯化。将EcoRV/AatllIdhLl片段连接pFP988栽体片段并转化至大肠杆菌ToplO细胞中。在含有氨爷青霉素(100fig/mL)的LB琼脂平板上选择转化体并通过菌落PCR筛选来证实pFP988-IdhL的构建。为了将选择标记添加至整合DNA,从pC194(GenBankNC—002013,SEQIDNO:267)PCR扩增具有启动子的Cm基因，使用引物CmF(SEQIDNO:163)和CmR(SEQIDNO:164)，扩增了836bpPCR产物。将该PCR产物克隆至pCR4Bhmt-TOPO中并转化至大肠杆菌ToplO细胞中，形成pCR4Bhmt-TOPO-Cm。测序后证实了通过PCR没有引入错误，从pCR4Bhmt-TOPO-Cm将Cm盒消化为828bpMluI/Swal片段并凝胶純化。用Mlul和Swal消化含有IdhL同源性的整合栽体pFP988-IdhL，并将4740bp栽体片段凝胶纯化。将Cm盒片段连接pFP988-IdhL栽体，形成pFP988-DIdhL::Cm。最后，用合成的PU启动子替代淀粉酶启动子来修饰实施例20中所述的来自pFP988DssPspac-budB-ilvD-kivD的6wfi^-!7vD-hvZ)盒。然后，将整个操纵子转移至pFP988-DIdhL::Cm中。通过用引物PllF-Stul(SEQIDNO:165)和PUR-Spel(SEQIDNO:166)退火寡核苷酸来构建Pll启动子。将退火的寡核苷酸在6°/。UltraPAGE凝胶上凝胶純化(EmbiTec，SanDiego，CA)。用Stul和Spel消化含有淀粉酶启动子的质粒pFP988DssPspac-budB-ilvD-kivD，并将所得到的10.9kbp栽体片段凝胶纯化。将分离的Pll片段连接消化的pFP988DssPspac-budB-ilvD-kivD形成pFP988-PU-budB-ilvD-kivD。然后用Stul和BamHI消化质粒pFP988DssPspac-budB-ilvD-kivD,并将所得到的5.4kbpPll-budB-UvD-kivD片段凝胶纯化。用Hpal和BamHI消化pFP988-DldhL::Cm并分离5.5kbp栽体片段。将bu犯-ilvD-kivD操纵子连接整合载体pFP988-DIdhL::Cm形成pFP988-DIdhL-P11-budB-ilvD-kivD::Cm。将pFP988-DIdhL-Pll-budB-ilvD-kivD::Cm整合至植物乳杆菌BAA-793中形成包括外源6"d仏i/vD，hvD基因的植物乳杆菌AIdhLl::budB-ilvD-ldvD::Cm。按照Aukrust,T.W.等所述的制备植物乳详干菌的电感受'态细胞(在￡7e"ro/7on3〃ow/Vofoco/j/brA/z'croorgaw"/7w;Nickoloff，J.A编辑；A^/Zcxisz力A/o/ecw/ar5/o/ogy，Vol.47;HumanaPress,Inc.,Totowa,NJ,1995,pp201-208)。电穿孔后，按照上文中Aukrust等所述的将细胞在MRSSM培养基中(补充0.5M蔗糖和0.1MMgCh的MRS培养基)37。C生长2h,没有振荡)。将电穿孔的细胞涂布于用于选择的含有氯霉素(10ng/mL)的MRS平板上并在37匸培养。最初通过菌落PCR扩增来筛选转化体以证实整合，然后通过PCR使用一组引物来更严格地篩选最初的阳性克隆。Z/vC和6c//^基因的质粒表达。在植物乳杆菌IdhL启动子的控制下(Ferain等，S餘"W.176:596-601(1994))从质粒pTRKH3(O，SulHvanDJ和KlaenhammerTR，Ge"e137:227-231(1993))表达剩余的两个异丁醇基因。使用引物PIdhLF-HindIII(SEQIDNO:167)和PIdhLR-BamHI(SEQIDNO:168)从植物乳杆菌ATCCBAA-793的基因组PCR扩增IdhL启动子。将411bpPCR产物克隆至pCR4Blunt-TOPO中并测序。用HindIII和BamHI消化所得到的质粒pCR4Blunt-TOPO-PIdhL,释放PIdhL片段。用HindIII和Sphl消化质粒pTRKH3，并将凝胶純化的栽体片段以三通方式连接PIdhL片段和来自芽孢杆菌表达质粒pBDPgroE-ilvC(B.s.)-bdhB的凝胶純化的含有ilvC(B.s.)-bdhB的2.4kbpBamHI/Sphl片段(实施例20)。将连接混合物转化至大肠杆菌Top10细胞中并将转化体生长于含有红霉素(150mg/L)的脑心浸液(BHI，DifcoLaboratories,Detroit,MI)平板上。通过PCR筛选转化体来证实构建。通过电穿孔将所得到的表达质粒pTRKH3-ilvC(B.s.)-bdhB转化至植物乳杆菌△IdhLl:bu犯-iWD-kivD::Cm中，如上所迷。将含有pTRKH3-ilvC(B.s.)-bdhB的植物乳杆菌△IdhLl::budB-ilvD-kivD::Cm接种至含有50mL添加红霉素(10|iig/mL)的MRS培养基的250mL烧瓶中并在37'C生长18至24h，没有振荡，此后，通过HPLC或GC分析检测异丁醇，如一般方法部分所述的。实施例22(预测的)粪肠球菌中异丁酵生物合成途径的表达该预测实施例的目的是描述怎样在粪肠球菌中表达异丁醇生物合成途径。已经公开了粪肠球菌菌株V583的完整基因组序列(Paulsen等，Scie"ce299:2071-2074(2003))，将其用作该实施例中表达异丁醇生物合成途径的宿主菌株。将大肠杆菌革兰氏阳性穿梭栽体，质粒pTRKH3(O，SullivanDJ和KlaenhammerTR，137:227-231(1993))，用于异丁醇途径的五个基因(6"仏〃vC，//v￡>，h'vD，涵S)在一个操纵子中的表达。pTRKH3含有大肠杆菌质粒pl5A复制起点，pAM|31复制子，以及用于四环素和红霉素的两个抗生素抗性选择标记。四环素抗性只在大肠杆菌中得到表达，而红霉素抗性在大肠杆菌和革兰氏阳性细菌中都得到表达。质粒pAMpi衍生物可以在粪肠球菌中复制(Poyart等，F5"MSM.，編.156:193-198(1997))。将诱导型nisA启动子(PnisA)用于控制编码异丁醇生物合成途径的酶的五个所需基因的表达，该启动子已经用于基因表达的有效控制，通过各种革兰氏阳性细菌包括粪肠球菌中的乳酸链球菌肽(Eichenbaum等，々y/.E"v,ro".M/cra6/'o/.64:2763-2769(1998))。将含有异丁醇途径操纵子的质粒pTrc99A::budB-ilvC-UvD-kivD(实施例14中所迷的)进行修饰，用枯草芽孢杆菌//vC基因(SEQIDNO:)替代大肠杆菌,7vC基因(SEQIDNO:3)。此外，将来自丙醇丁酮梭菌的bdhB基因(SEQIDNO:158)添加至操纵子的末端。首先，使用引物F-bdhB-AvrII(SEQIDNO:169)和R-bdhB-BamHI(SEQIDNO:170)扩增来自pBDPgroE-ilvC(B.s.)德B(实施例20中所述的)的Z>^2基因，然后TOPO克隆并测序。通过用AvrII和BamHI消化接着凝胶纯化分离了1194bp6d/^片段。将6cZ/^片段连接之前已经用AvrII和BamHI消化的pTrc99A::budB-ilvC-"vD-kivD,并将所得到的片段凝胶纯化。通过电穿孔将连接混合物转化至大肠杆菌ToplO细胞中并在含有氨苄青霉素(100ng/mL)的LB琼脂平板上37'C生长过夜后选择转化体。然后通过菌落PCR筛选转化体以证实含有pTrc99A::budB-iWC-ilvD-kivD-bdhB的正确克隆。接着，使用引物F-ilvC(B.s.)-AflII(SEQIDNO:171)和R-ilvC(B.s.)-NotI(SEQIDNO:172)扩增来自pBDPgroE-ilvC(B.s.)-bdhB(实施例20中所迷的)的//vC(B.s)。将PCR产物克隆并测序。通过用AflII和Notl消化接着凝胶純化分离了1051bp/7vC(及J.)片段。将该片段连接已经用AflII和Notl切割释放了大肠杆菌Z/vO(在连接i/vC(及s.)之前凝胶纯化了10.7kbp栽体条带)的pTrc99A::bu犯-ilvC-ilvD-kivD-bdhB。通过电穿孔将连接混合物转化至大肠杆菌ToplO细胞中并在含有氨节青霉素(lOO^g/mL)的LB琼脂平板上37'C生长过夜后选择转化体。然后通过菌落PCR筛选转化体以证实含有pTrc99A::budB-ilvC(B.s.)-"vD-kivD-bdhB的正确克隆。为了提供用于大肠杆菌革兰氏阳性穿梭栽体pTRKH3的启动子，使用引物F-PnisA(HindIII)(SEQIDNO:173)和R-PnisA(SpelBamHI)(SEQIDNO:174)从乳酸乳球菌基因组DNAPCR扩增"/W启动子(Chandrapati等，Mo/.Mc油'o/.46(2):467-477(2002)),然后TOPO克隆。测序后，通过用HindIII和BamHI消化接着凝胶純化分离了213bpnisA启动子片段。用HindIII和BamHI消化质粒pTRKH3并将栽体片段凝胶纯化。将线性化pTRKH3连接PnisA片段并通过电穿孔转化至大肠杆菌ToplO细胞中。在含有红霉素(25ng/mL)的LB琼脂平板上37'C生长过夜后选择转化体。然后通过菌落PCR筛选转化体以证实pTRKH3-PnisA的正确克隆。用Spel和BamHI消化质粒pTRKH3-PnisA，并将载体凝胶純化。用Spel和BamHI消化上述的质粒pTrc99A::budB画ilvC(B.s.)-ilvD-kivD-bdhB,并将7.5kbp片段凝胶纯化。将7.5kbp6wc^w7vCYA1sv)-//vZ>A:zvD-W/^片段在Spel和BamHI位点连接pTRKH3-PnisA。通过电穿孔将连接混合物转化至大肠杆菌ToplO细胞中并在含有红霉素(25ng/mL)的LB琼脂平板上37。C生长过夜后选择转化体。然后通过菌落PCR筛选转化体。将所得到的质粒称为pTRKH3-PnisA-budB-ilvC(B.s.)-ilvD-kivD-bdhB。从大肠杆菌转化体制备该质粒并使用本领域已知的方法转化至电感受态粪肠球菌V583细胞中(Aukrust，T.W.等，在￡7e"ro/on3〃'ow尸wfoco/s/orM'craorgaw/s脂(微生物的电穿孔方案)；Nickoloff,J.A.编辑；iW^/ioA/"A/o/ecw/arS/o/ogy(分子生物学方法)，Vol.47;HumanaPress,Inc,，Totowa,NJ.,1995,pp.217-226)，得到粪肠球菌V583/pTRKH3-PnisA-budB-i1vC(Bs.)-i1vD-kivD-bdhB。通过电穿孔将含有w/"调控基因，"/W和m'jAT，ac/必壮观霉素抗性基因和pSH71复制起点的第二个质粒转化至粪肠球菌V583/pTRKH3-PnisA-budB-ilvC(B.s.)-ilvD-kivD-bdhB中含有pSH71复制起点的质粒与粪肠球菌中的pAMpi衍生物相容(Eichenbaum等，J:X)。在37'C生长的含有红霉素(25ng/mL)和壮观霉素(100ng/mL)的LB琼脂平板上选择双药物抗性转化体。将所得到的带有两个质粒(即表达质粒(pTRKH3-PnisA-budB-ilvC(B.s.)-ilvD-kivD-bdhB)和调控质粒(pSH71-nisRK))的粪肠球菌株V583B接种于含有50mL补充酵母提取物(0.2%)(Fischetti等，丄161:1384-1401(1985)),乳酸链球菌肽(20ng/mL)(Eichenbaum等，丄X)，红霉素(25吗/mL)和壮观霉素(lOOpg/mL)的Todd-Hewitt培养液的250mL烧瓶中。将烧瓶在37'C培养18-24h，没有振荡，该时间后，通过HPLC或GC分析测量异丁醇产生，如一般方法部分中所述的。权利要求1.重组微生物宿主细胞，其包括至少一个编码多肽的DNA分子，该多肽催化选自以下的底物至产物的转化i)丙酮酸至乙酰乳酸(途径步骤a)，ii)乙酰乳酸至2，3-二羟基异戊酸(途径步骤b)，iii)2，3-二羟基异戊酸至α-酮基异戊酸(途径步骤c)，iv)α-酮基异戊酸至异丁醛(途径步骤d)，和v)异丁醛至异丁醇(途径步骤e)；其中至少一个DNA分子对于所述微生物宿主细胞是异源的，并且其中所述微生物宿主细胞产生异丁醇。1.180185190ProAspAspAlalieAspGinValAlaLysLeulieAlaGinAlaLys195200205AsnProliePheLeuLeuGlyLeuMetAlaSerGinProGluAsnSer210215220LysAlaUuArgArgUuLeuGluThrSerHislieProValThrSer225230235240ThrTyrGinAlaAlaGlyAlaValAsnGinAspAsnPheSerArgPhe245250255AlaGlyArgValGlyLeuPheAsnAsnGinAlaGlyAspArgLeuLeu260265270GinLeuAlaAspLeuVallieCyslieGlyTyrSerProValGluTyr275280285GluProAlaMetTrpAsnSerGlyAsnAlaThrLeuValHislieAsp290295300ValLeuProAlaTyrGluGluArgAsnTyrThrProAspValGluLeu1.<table>tableseeoriginaldocumentpage0</column></row><table><image>imageseeoriginaldocumentpage92</image><211>1476<212〉画<213〉大肠杆菌<400〉3atggctaactacttcaatacactgaatctgcgccagcagctggcacagctgggcaaatgt60cgctttatgggccgcgatgaattcgccgatggcgcgagctaccttcagggtaaaaaagta120gtcatcgtcggctgtggcgcacagggtctgaaccagggcctgaacatgcgtgattctggt180ctcgatatctcctacgctctgcgtaaagaagcgattgccgagaagcgcgcgtcctggcgt240aaagcgaccgaaaatggttttaaagtgggtacttacgemgaactgatcccacaggcggat300ctggtgattaacctgacgccggacaagcagcactctgatgtagtgcgcaccgtacagcca360ctgatgaaagacggcgcggcgctgggctactcgcacggtttcaacatcgtcgaagtgggc420gagcagatccgtaaagatatcaccgtagtgatggttgcgccgaaatgcccaggcaccgaa480gtgcgtgaagagtacaaacgtgggttcggcgtaccgacgctgattgccgttcacccggaa540aacgatccgaaaggcgaaggcatggcgattgccaaagcctgggcggctgcaaccggtggt600caccgtgcgggtgtgctggaatcgtccttcgttgcggaagtgaaatctgacctgatgggc660gagcaaaccatcctgtgcggtatgttgcaggctggctctctgctgtgcttcgacaagctg720gtggaagaaggtaccgatccagcatacgcagaaaaactgattcagttcggttgggaaacc780atcaccgaagcactgaaacagggcggcatcaccctgatgatggaccgtctctctaacccg840gcgaaactgcgtgcttatgcgctttctgaacagctgaaagagatcatggcacccctgttc900cagaaacatatggacgacatcatctccggcgaattctcttccggtatgatggcggactgg960gccaacgatgataagaaactgctgacctggcgtgaagagaccggcaaaaccgcgtttgaa1020accgcgccgcagtatgaaggcaaaatcggcgagcaggagtacttcgataaaggcgtactg1080atgattgcgatggtgaaagcgggcgttgaactggcgttcgaaaccatggtcgattccggc1140atcattgaagagtctgcatattatgaatcactgcacgagctgccgctgattgccaacacc1200atcgcccgtaagcgtctgtacgaaatgaacgtggttatctctgataccgctgagtacggt1260aactatctgttctcttacgcttgtgtgccgttgctgaaaccgtUatggcagagctgcaa1320ccgggcgacctgggtaaagctattccggaaggcgcggtagataacgggcaactgcgtgat1380gtgaacgaagcgattcgcagccatgcgattgagcaggtaggtaagaaactgcgcggctat1440atgacagatatgaaacgtattgctgttgcgggttaa1476<210>4<211>491〈212〉PRT<213〉大肠杆菌<400>4MetAlaAsnTyrPheAsnThrLeuAsnLeuArgGinGinLeuAlaGin151015LeuGlyLysCysArgPheMetGlyArgAspGluPheAlaAspGlyAla202530SerTyrLeuGinGlyLysLysValVallieValGlyCysGlyAlaGin354045GlyLeuAsnGinGlyLeuAsnMetArgAspSerGlyLeuAsplieSer505560TyrAlaLeuArgLysGluAlalieAlaGluLysArgAlaSerTrpArg65707580LysAlaThrGluAsnGlyPheLysValGlyThrTyrGluGluLeulie859095ProGinAlaAspLeuVallieAsnLeuThrProAspLysGinHisSer100105110AspValValArgThrValGinProLeuMetLysAspGlyAlaAlaLeu115120125GlyTyrSerHisGlyPheAsnlieValGluValGlyGluGinlieArg<table>tableseeoriginaldocumentpage0</column></row><table><formula>formulaseeoriginaldocumentpage97</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage97</formula>385390395400lieAlaArgLysArgLeuTyrGluMetAsnValVallieSerAspThr405410415AlaGluTyrGlyAsnTyrLeuPheSerTyrAlaCysValProLeuLeu420425430LysProPheMetAlaGluLeuGinProGlyAspLeuGlyLysAlalie435440445ProGluGlyAlaValAspAsnGlyGinLeuArgAspValAsnGluAla450455460lieArgSerHisAlalieGluGinValGlyLysLysLeuArgGlyTyr465470475480MetThrAspMetLysArglieAlaValAlaGly485490<210〉5<211〉1851<212>DNA<213〉大肠杆菌〈400〉5atgcctaagtaccgttccgccaccaccactcatggtcgtaatatggcgggtgctcgtgcg60ctgtggcgcgccaccggaatgaccgacgccgatttcggtaagccgattatcgcggttgtg120aactcgttcacccaatttgtaccgggtcacgtccatctgcgcgatctcggtaaactggtc180gccgaacaaattgaagcggctggcgg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