用于生物学产生脂肪酸衍生物的组合物和方法
【专利说明】
[0001] 背景
技术领域
[0002] 本公开提供用于生物学产生脂肪酸衍生物的组合物和方法，并且更确切地说使用 重组Q代谢微生物以从(^底物（如甲烷或天然气）产生脂肪醇、羟基脂肪酸或二羧酸。
[0003] 背景描述
[0004] 脂肪醇是主要为直链且一元的脂族醇。其由非极性亲脂性、饱和或不饱和的通常 (：6至c 24烃链和附接至末端碳的极性、亲水性羟基组成。脂肪醇为具有许多应用的高价值的 化学品，如表面活性剂、洗绦剂、润滑剂添加剂、消泡剂、阻溶剂（solubility retarder)以 及稠度赋予因子。2009年，脂肪醇生产能力为每年大约200万公吨。C12/C 14醇、C16/C18醇以 及C15/C 18醇包括在所述能力内。预期截至2012年，全球表面活性剂市场将达到$166. 5亿。 非离子型表面活性剂在表面活性剂市场中构成第二大产品组。基于脂肪酸的表面活性剂代 表着大约20 %的非离子型表面活性剂。
[0005] 目前，脂肪醇市场中主要为天然醇和合成醇产品。天然醇是使用酯基转移和氢化 工艺由植物或动物的天然油、脂肪以及蜡（如椰子油或棕榈油）制备的。合成醇是由石油 化工原料如乙稀、稀径以及石赌，主要由齐格勒醇工艺（Ziegler alcohol process)、SHOP 工艺以及羰基合成工艺（Oxo process)产生。然而，这些工艺要求苛刻的生产环境、可疑的 土地利用实践或对环境有害的副产物。
[0006] -直致力于实现从丰富且节省成本的可再生资源微生物学产生脂肪醇。具体而 言，重组微生物如大肠杆菌（E.coli)和各种酵母已用来将生物质来源的原料转化成脂肪 醇，如月桂醇。然而，即便使用相对廉价的纤维素生物质作为原料，碳水化合物原料质量的 一半以上由氧组成，这代表着对转化效率有显著限制。长链脂肪酸和其衍生物（如脂肪醇、 羟基脂肪酸、脂肪醛）具有比原料显著低的氧含量，由于氧必须作为废物消除，因此这限制 了理论产率。因此，由碳水化合物原料产生脂肪酸和其衍生物的经济学是极其昂贵的。
[0007] 鉴于与用于产生脂肪醇和相关化合物的基于碳水化合物的发酵方法相关联的限 制，本领域中需要替代、节省成本且环保的用于产生脂肪醇的方法。本公开满足所述需要并 且进一步提供其它相关优势。
[0008] 发明概述
[0009] 在某些方面，本公开涉及一种通过用Q底物原料培养非天然C i代谢非光合微生物 并且回收脂肪酸衍生物来制备脂肪酸衍生物的方法，其中(^代谢非光合微生物包含编码脂 肪酸转化酶的重组核酸分子，并且其中Q代谢非光合微生物将C i底物转化成c 8-c24脂肪酸 衍生物，所述脂肪酸衍生物包括脂肪醛、脂肪醇、羟基脂肪酸、二羧酸或其组合。
[0010] 在相关方面，本公开提供非天然甲烷营养菌，其包含编码的脂肪酸转化酶重组核 酸分子，其中甲烷营养菌能够将Ci底物转化成c8-c24脂肪醛、脂肪醇、脂肪酯蜡、羟基脂 肪酸、二羧酸或其组合。在某些实施方案中，提供非天然甲烷营养菌，其包含编码异源酰 基-CoA依赖性或独立性脂肪酰基-CoA还原酶的重组核酸分子、编码异源硫酯酶的重组核 酸分子，以及编码异源酰基-CoA合成酶的重组核酸分子，其中甲烷营养菌能够将Ci底物转 化成C8-C2,肪醇。
[0011] 在其它实施方案中，提供非天然甲烷营养菌，其含有编码羧酸还原酶的重组核酸 分子、编码磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶的重组核酸分子，以及编码醇脱氢酶的重组核酸分 子，其中甲烷营养菌能够将Ci底物转化成C 8-(：24脂肪醇。
[0012] 在其它实施方案中，提供非天然甲烷营养菌，其含有编码异源脂肪酰基-CoA还原 酶的重组核酸分子、编码异源硫酯酶的重组核酸分子，以及编码异源P450或单加氧酶的重 组核酸分子，其中原生醇脱氢酶受抑制并且甲烷营养菌能够将(^底物转化成C 8-C24?-羟基 脂肪酸。
[0013] 在其它实施方案中，提供非天然甲烷营养菌，其含有编码异源脂肪酰基-CoA还原 酶的重组核酸分子和编码异源硫酯酶的重组核酸分子，其中与原生醇脱氢酶的正常表达水 平相比，甲烷营养菌过度表达原生醇脱氢酶、用编码异源醇脱氢酶的重组核酸分子转化或 两者，并且其中甲烷营养菌能够将Ci底物转化成c 8-c24二羧酸醇。
[0014] 在另一方面，本公开提供包含脂肪酸衍生物组合物的Ci代谢微生物生物质，其 中含有脂肪酸衍生物的生物质或来自其的脂肪酸衍生物组合物的S 13c为约-35%。至 约-50%。、-45%。至约-35%。，或约-50%。至约-40%。，或约-45%。至约-65%。，或约 _60%〇至 约-70%。，或约-30%。至约-70%。。在某些实施方案中，脂肪酸衍生物组合物包含脂肪醛、月旨 肪醇、脂肪酯蜡、羟基脂肪酸、二羧酸或其任何组合。在其它实施方案中，脂肪酸衍生物组合 物包含C 8-C24脂肪醇、C 8-C24支链脂肪醇、C 8-C24脂肪醛、C 8-C24? -羟基脂肪酸或C8-C24二羧 酸醇。在其它实施方案中，脂肪酸衍生物组合物包含大多数（超过50%w/w)具有在(： 8到 C14或C 1Q到C 16或C 14到C 24范围内的碳链长度的脂肪酸，或大多数具有小于C 18的碳链长度 的脂肪酸衍生物，或含有脂肪醇的组合物，其中至少70%的总脂肪醇包含C1(l到C 18脂肪醇。
[0015] 附图简述
[0016] 图1示出了用于脂肪醇产生的酰基-CoA依赖性FAR途径的概视图。
[0017] 图2示出了用于脂肪醇产生的酰基-CoA独立性FAR途径的概视图。
[0018] 图3示出了用于脂肪醇产生的酰基-CoA独立性CAR途径的概视图。
[0019] 图4示出了羟基脂肪酸产生途径的概视图。
[0020] 图5示出了二羧酸产生途径的概视图。
[0021] 图6示出了用于脂肪酯产生的酰基-CoA依赖性FAR途径的概视图。
[0022] 图7示出了多种碳源的S13C分布的示意图。
[0023] 详细说明
[0024] 本公开提供用于产生脂肪酸衍生物的组合物和方法。例如，用(^底物原料（例如 甲烷）培养重组Q代谢微生物，以产生C 8至C 24脂肪醛、脂肪醇、脂肪酯蜡、羟基脂肪酸、二 羧酸或其任何组合。这种新方法允许使用甲基营养菌或甲烷营养菌作为新宿主系统来产生 供用于生产例如表面活性剂、润滑剂、溶剂或洗涤剂的脂肪酸衍生物。
[0025] 作为背景，来自包括天然气的多种来源的甲烷代表着丰富的国内资源。如以上所 述，基于碳水化合物的原料的质量一半以上为氧，这是对转化效率的显著限制，因为长链脂 肪醇具有比这些原料明显低的氧含量。解决当前系统的限制的方案是利用甲烷或天然气作 为转化原料。来自天然气的甲烷廉价且丰富，并且重要地是不含氧，这允许显著提高理论转 化效率。此外，与碳水化合物原料相比，（^碳源廉价且丰富，这还有助于改善脂肪醇生产的 经济学。
[0026] 脂肪酸产生在实际上所有生物体中均为重要的途径，因为要求其用于膜生物合 成。在本公开中，应用代谢工程技术来例如通过过度表达与脂肪酸生物合成相关联的基因 (例如酰基-CoA合酶、乙酰基-CoA羧化酶、酰基载体蛋白、丙酮酸脱氢酶），而同时抑制、下 调或消除与脂肪酸降解相关联的酶或竞争代谢途径而增加脂肪酸产生的总体碳通量。在 其它实施方案中，脂肪酸的组合物和链长度是通过引入对所需链长度特异的异源硫酯酶基 因、而同时任选地抑制、下调或消除原生硫酯酶基因来进行控制（例如在细菌中，引入来自 加州月桂（Umbellularia californica)的选择性地产生C12脂肪酸链的fatBl硫醋酶，并 且消除典型地在细菌中产生C 16-C18链长度的原生硫酯酶）。在其它实施方案中，通过在支 链a-酮酸合成途径中引入多种酶产生支链脂肪酸（对于一些表面活性剂和洗涤剂应用而 言，支链还提供显著优势）。
[0027] 在一方面，本公开提供一种用于产生脂肪酸衍生物的方法，其包括在(^底物原料 存在下培养非天然Q代谢非光合微生物和回收脂肪酸衍生物，其中q代谢非光合微生物 包含编码脂肪酸转化酶的重组核酸分子，并且其中Q代谢非光合微生物将C i底物转化成 C8_C24脂肪酸衍生物，所述脂肪酸衍生物包括脂肪醛、脂肪醇、脂肪酯蜡、羟基脂肪酸、二羧 酸或其组合。在另一方面，本公开提供非天然甲烷营养菌，其包含编码脂肪酸转化酶的重组 核酸分子，其中甲烷营养菌能够将q底物转化成C 8_C24脂肪醛、脂肪醇、脂肪酯蜡、羟基脂肪 酸、二羧酸或其组合。
[0028] 在更详细地阐述本公开之前，提供用于本文中的某些术语的定义可以有助于理解 本公开。额外的定义在本公开通篇加以阐述。
[0029] 在本说明书中，除非另有指示，否则任何浓度范围、百分比范围、比率范围或整数 范围应理解为包括在所叙述的范围内的任何整数的值，并且适当时包括其分数（如整数的 十分之一和百分之一）。而且，除非另有指示，否则本文所叙述的关于任何物理特征（如聚 合物子单元、大小或厚度）的任何数值范围应理解为包括在所叙述的范围内的任何整数。 除非另有指示，否则如本文所用，术语"约"意味着所指示的范围、值或结构的±20%。术语 "基本上由……组成"将权利要求的范围限于指定的物质或步骤，或限于不会实质性地影响 所要求的本发明的基本和新颖特征的那些。应了解，如本文所用，术语"一个/种"指的是 所列举的组分中的"一个/种或个/种"。替代方式的使用（例如，"或"）应理解为意味着 替代方式中的一者、两者或其任何组合。如本文所用，术语"包括"、"具有"和"包含"同义 地使用，这些术语和其变型打算被解释为非限制性的。
[0030] 如本文所用，术语"重组"或"非天然"指的是包含至少一个遗传变化或已经通过 引入外源性核酸而加以修饰的生物体、微生物、细胞、核酸分子或载体，或指的是已被改变 以使得内源性核酸分子或基因的表达可受控制的细胞，其中通过遗传工程引入所述变化或 修饰。遗传变化包括例如引入编码蛋白质或酶的可表达的核酸分子的修饰，其它核酸添加、 核酸缺失、核酸取代或细胞遗传物质的其它功能破坏。所述修饰包括例如参考物种的异源 或同源多肽的编码区和其功能片段。其它修饰包括例如其中修饰改变基因或操作子的表达 的非编码调控区。示例性蛋白质或酶包括脂肪酸生物合成途径中的蛋白质或酶（即组分） (例如脂肪酰基-CoA还原酶、硫酯酶、酰基-CoA合成酶或其组合）。对编码酶的核酸分子 或其功能片段的遗传修饰可对重组细胞赋予生物化学反应能力或代谢途径能力，所述重组 细胞已自其天然存在状态改变。
[0031] 本文中使用酶名称的以下缩写："脂肪酰基还原酶"或"脂肪醇形成酰基CoA还原 酶"被称为"FAR" ； "酰基载体蛋白"被称为"ACP" ； "辅酶A"被称为"CoA" ； "硫酯酶"被称 为"TE" ；"脂肪酸合酶"或"脂肪酸合成酶"被称为"FAS" ；"脂肪酰基-CoA还原酶"被称为 "FACR" ；"脂肪酰基CoA合酶"或"酰基-CoA合成酶"或"酰基CoA合酶"或"酰基-CoA合 成酶"在本文中可互换使用并且被称为"FACS" ；并且"乙酰基-CoA羧化酶"被称为"ACC"。
[0032] 如图1所示和本文所用的脂肪酰基还原酶（FAR)是指催化脂肪酰基-CoA、脂肪酰 基-ACP或其它脂肪酰基硫酯复合物（各自具有结构R-KO^S-Ri，式I)还原成脂肪醇（结 构R-OH，式II)的酶。例如，在两分子的NADPH氧化成NADP+时，R- (CO) -S-R i (式I)转化成 R-OH(式II)和RrSH(式III)，其中R为(：8至C 24饱和、不饱和、直链、支链或环状烃，并且 &代表C〇A、ACP或其它脂肪酰基硫酯底物。CoA为在脂肪酸的合成和氧化中涉及的非蛋白 酰基载体组。"ACP"为脂肪酸合成中所用的FAS的多肽或蛋白质亚单位。FAR不同于FACR。 FACR仅将脂肪酰基-CoA中间体还原成脂肪醛，并且要求另一氧化还原酶来产生对应的脂 肪醇。如本文所用，脂肪醛（参见图1)是指饱和或不饱和脂族醛，其中R如以上所定义。
[0033] 如本文所用，术语"脂肪酸"是指结构R-C00H(式IV)的化合物，其中R为(： 8至 C24饱和、不饱和、直链、支链或环状烃，并且羧基处于1位。饱和或不饱和脂肪酸可描述为 "Cx: y"，其中"x"为代表碳原子总数目的整数，并且"y"为指的是碳链中双键数目的整数。 例如，称为C12:0或1-十二烷酸的脂肪酸是指具有12个碳和0个双键的化合物。
[0034] 如本文所用，术语"羟基脂肪酸"是指结构0H-R-C00H(式V)的化合物，其中R为 (：8至(：24饱和、不饱和、直链、支链或环状烃。《羟基脂肪酸（还称为羟基酸）是一类 天然存在的直链脂族有机酸，其具有一定数目的碳原子长度，羧基处于1位并且羟基处于n 位。例如，示例性C 16?-羟基脂肪酸为16-羟基棕榈酸（具有16个碳原子，羧基处于1位 并且羟基处于16位）和10, 16-二羟基棕榈酸（具有16个碳原子，羧基处于1位，第一羟 基处于10位，并且第二羟基处于16位）。
[0035] 如本文所用，术语"脂肪醇"是指式II的脂族醇，其中R为(：8至C 24饱和、不饱和、 直链、支链或环状烃。饱和或不饱和脂肪醇可描述为"Cx:y-〇H"，其中"x"为代表脂肪醇中 碳原子总数目的整数，并且"y"为指的是碳链中双键数目的整数。
[0036] 不饱和脂肪酸或脂肪醇可称为"顺式Az"或"反式Az"，其中"顺式"和"反式"指 的是双键周围的碳链构象，并且"z"指示双键中第一个碳的编号，其中编号始于具有脂肪酸 的羧酸的碳或键合至脂肪醇的-OH基团的碳。
[0037] 术语"脂肪酰基-硫酯"或"脂肪酰基-硫酯复合物"指的是式I化合物，其中脂肪 酰基部分经由硫酯键共价键联至载体部分。脂肪酰基-硫酯为本文所述的FAR酶的底物。
[0038] 术语"脂肪酰基-CoA"指的是式I化合物，其中札为辅酶A，并且术语"脂肪酰 基-ACP"指的是式I化合物，其中&为酰基载体蛋白ACP。
[0039] 短语"酰基-CoA独立性途径"指的是通过将脂肪酰基-ACP底物直接酶促转化成 脂肪醇来产生脂肪醇，并且不涉及游离脂肪酸或脂肪酰基-CoA中间体的使用。这种生物 合成途径不同于两种类型的脂肪酰基-CoA依赖性途径一一种经由酰基转移反应将脂肪酰 基-ACP直接转化成脂肪酰基CoA，并且第二种经由游离脂肪酸中间体将脂肪酰基-ACP转化 成脂肪酰基-C〇A(参见图1)。酰基-CoA独立性途径具有以下优点：绕过由游离脂肪酸形 成脂肪酰基-CoA底物的步骤，所述步骤要求使用ATP。因此，酰基-CoA独立性途径可使用 比利用游离脂肪酸中间体的酰基-CoA依赖性途径更少的能量。
[0040] 如本文所用，"醇脱氢酶"（ADH)指的是能够将醇转化成其对应醛、酮或酸的任何 酶。醇脱氢酶可具有一般特异性，能够转化至少若干种醇底物，或可具有窄特异性，接受一 种、两种或数种底物。
[0041] 如本文所用，"粒状甲烷单加氧酶"(pMM〇)指的是在甲烷营养细菌中催化甲烷氧化 成甲醇的膜结合粒状酶。术语PMM0是指多组分酶或包含酶活性部位的亚单位。
[0042] 如本文所用，"可溶性甲烷单加氧酶"（sMMO)指的是在细胞溶解物的可溶性部分 (细胞质）中所发现的、在甲烷营养细菌中催化甲烷氧化成甲醇的酶。术语sMMO是指多组 分酶或包含酶活性部位的亚单位。
[0043] 如本文所用，"P450"还称为细胞色素P450"或"CYP"，指的是具有宽底物特异性、 催化有机化合物氧化的一组酶，所述有机化合物包括脂质、留体激素以及异生物质底物。 P450酶最通常通过将氧原子插入到有机底物的R-H键中催化单氧合酶反应。
[0044] "转化"指的是底物酶促转化成一种或更多种对应的产物。"转化百分比"指的是在 一段时间内在指定的条件下还原成一种或更多种产物的底物百分比。因此，"酶促活性"或 多肽酶的"活性"可表示为底物向产物的"转化百分比"。
[0045] 如本文所用，术语"宿主"指的是用脂肪酸生物合成组分（例如硫酯酶、脂肪酰 基-CoA还原酶）进行遗传修饰以将Q底物原料转化成C8-C24脂肪醛、脂肪醇、脂肪酯蜡、羟 基脂肪酸、二羧酸或其任何组合的微生物（例如甲烷营养菌）。宿主细胞可能已经具有赋予 与本文公开的脂肪酸生物合成途径不相关的所需特性的其它遗传修饰。例如宿主细胞可具 有赋予以下各项的遗传修饰：高生长、对污染物或具体培养条件的耐受性、代谢其它碳底物 的能力或合成所需产物或中间体的能力。
[0046] 如本文所用，术语"甲烷营养菌（methan〇tr〇ph)"、"甲烷营养细菌 (methanotrophic bacterium) " 或"甲烧营养细菌（methanotrophic bacteria) " 指的 是能够利用（^底物如甲烷或非常规天然气作为主要或唯一碳源和能量源的甲基营养细 菌。如本文所用，"甲烷营养细菌"包括"专性甲烷营养细菌"，其仅可利用q底物用于碳 源和能量源；和"兼性甲烷营养细菌"，其除了作为其唯一碳源和能量来源的(^底物以外 天然地能够使用多碳底物，如乙酸盐、丙酮酸盐、琥珀酸盐、苹果酸盐或乙醇。兼性甲烷 营养菌包括甲基胞菌（Methylocella)、甲基孢囊菌、甲基荚膜菌（Methylocapsa)的一些 物种（例如，森林甲基胞菌、沼泽甲基胞菌（Methylocella palustris)、冻原甲基胞菌 (Methylocella tundrae)、道氏甲基抱囊菌（Methylocystis daltona)SB2、苔藓甲基抱囊 菌（Methylocystis bryophila)和金色甲基荚膜菌（Methylocapsa aurea)KYG，以及嗜有机 甲基杆菌（ATCC 27, 886)。
[0047] 如本文所用，术语" (^底物"或" C i化合物"指的是缺乏碳碳键的有机化合物。C : 底物包括合成气、天然气、非常规天然气、甲烷、甲醇、甲醛、甲酸（甲酸盐）、一氧化碳、二氧 化碳、甲基化胺（例如，甲胺、二甲胺、三甲胺，等等）、甲基化硫醇、甲基卤（例如，溴甲烷、氯 甲烷、碘甲烷、二氯甲烷，等等）以及氰化物或其任何组合。
[0048] 如本文所用，"(^代谢微生物"或"C i代谢非光合微生物"指的是具有使用C i底物 作为能量源，或作为其主要能量源，或作为其唯一能量源和生物质源的能力的任何微生物， 并且可使用或可能不使用其它碳底物（如糖和复合碳水化合物）用于能量和生物质。例如， Q代谢微生物可以氧化Ci底物，如甲烷、天然气或甲醇。Ci代谢微生物包括细菌（如甲烷 营养菌和甲基营养菌）和酵母。在某些实施方案中，(^代谢微生物不包括光合微生物，如海 藻。在某些实施方案中，Ci代谢微生物将为"专性(^代谢微生物"，这意味着其唯一的能量 源是Ci底物。在其它实施方案中，c i代谢微生物（例如，甲烷营养菌）将在c i底物原料存 在下进行培养（即，使用Ci底物作为主要或唯一能量源）。
[0049] 如本文所用，术语"甲基营养菌"或"甲基营养细菌"指的是能够氧化不含碳碳键的 有机化合物的任何细菌。在某些实施方案中，甲基营养细菌可以是甲烷营养菌。例如，"甲 烷营养细菌"指的是具有氧化作为主要碳源和能量源的甲烷的能力的任何甲基营养细菌。 示例性的甲烷营养细菌包括甲基单胞菌、甲基细菌、甲基球菌、甲基弯菌、甲基孢囊菌、甲基 微菌或甲烷单胞菌。在某些其它实施方案中，甲基营养细菌是"专性甲基营养细菌"，其指的 是限于使用Ci底物用来产生能量的细菌。
[0050] 如本文所用，术语"C0利用细菌"指的是天然地具有氧化作为碳源和能量源的一氧 化碳（C0)的能力的细菌。一氧化碳可以从"合成气（synthesis gas) "或"合成气（syngas) " 利用，合成气是通过气化任何有机原料而产生的一氧化碳与氢气的混合物，这种有机原料 如煤、煤油、天然气、生物质或废有机物质。C0利用细菌不包括必须经过遗传修饰用于在作 为其碳源的C0上生长的细菌。
[0051] 如本文所用，"天然气"指的是天然存在的气体混合物，其在多孔储层中形成，并且 可通过常规方法（例如，钻探）获得，并且主要由甲烷组成，但还可具有其它组分，如二氧化 碳、氮气或硫化氢。
[0052] 如本文所用，"非常规天然气"指的是在具有低渗透性的地层中产生的天然存在的 气体混合物，其必须通过非常规方法获得，所述方法如水力压裂、水平钻探或定向钻探。示 例性非常规天然气矿床包括在砂岩或碳酸盐中形成的紧密气体砂、在煤矿床中形成并且吸 附在煤颗粒中的煤床甲烷、在细粒页岩中形成的并且吸附在粘土颗粒中或容纳在小孔或微 裂纹中的页岩气、作为的甲烷天然气与水的在低温和高压下在如海洋和永冻层下的位置形 成的结晶组合的甲烷水合物。
[0053] 如本文所用，"合成气"指的是一氧化碳（C0)和氢气（H2)的混合物。合成气还可 以包含C0 2、甲烧，以及相对于C0和H2而言较小量的其它气体。
[0054] 如本文所用，"甲烷"指的是具有化学式CH4的最简单烷烃化合物。甲烷在室温下 和压力为无色且无味的气体。甲烷来源包括天然来源如天然气田，"非常规天然气"源（如 页岩气或煤床甲烷，其中含量将取决于来源而变化），以及生物来源，其中通过产甲烷微生 物以及工业或实验室合成来进行合成。甲烷包括纯甲烷、基本上纯化的组合物如"管道质量 的天然气"或"干燥天然气"，其为95-98% (百分比）的甲烷，以及未纯化的组合物，如"湿 天然气"，其中其它烃未被去除并且甲烷构成组合物的60%以上。
[0055] 如本文所用，"核酸分子"还称为多核苷酸，指的是包含共价键联的称为核苷酸的 亚单位的多聚化合物。核酸分子包括多聚核糖核酸（RNA)、多聚脱氧核糖核酸（DNA)，两者 均为单链或双链的。DNA包括cDNA、基