因组DNA、合成DNA、半合成DNA等等。
[0056] 如本文所用，"转化"指的是将核酸分子（例如外源性或异源核酸分子）转移到宿 主中。所转化的宿主可在染色体外携带外源性或异源核酸分子，或核酸分子可整合到染色 体中。整合到宿主基因组和自主复制载体中通常产生所转化核酸分子的在遗传上稳定的遗 传。含有所转化核酸的宿主细胞称为"重组"或"非天然存在"或"遗传工程化"或"转化" 或"转基因"细胞（例如细菌）。
[0057] 如本文所用，如本文所用，术语"内源"或"原生"指的是通常存在于宿主细胞中的 基因、蛋白质、化合物或活性。
[0058] 如本文所用，"异源"核酸分子、构筑体或序列指的是对于宿主细胞而言并非原生 的核酸分子或核酸分子序列的一部分，对于已经被改变或突变的宿主细胞而言原生的核酸 分子或核酸分子的一部分，或为在类似条件下与原生的表达水平相比具有改变的表达的核 酸分子。例如，异源控制序列（例如，启动子、增强子）可以用于以与通常在自然界或培养 物中表达的原生基因或核酸分子不同的方式调控原生基因或核酸分子的表达。在某些实施 方案中，异源核酸分子可以与原生宿主细胞基因同源，但可能具有改变的表达水平或具有 不同的序列，或两者。在其它实施方案中，异源或外源核酸分子可能对于宿主细胞或宿主基 因组而言并非内源的，而是可以通过接合、转化、转染、电穿孔等等添加到宿主细胞中，其中 所添加的分子可以整合到宿主基因组中或可以作为染色体外遗传物质（例如，质粒或其它 自主复制载体）存在。另外，"异源"可以指不同于或自宿主细胞中所见改变的酶、蛋白质 或其它活性，或对于宿主细胞而言并非原生，而是由引入到宿主细胞中的核酸分子编码。术 语"同源"或"同源物"指的是宿主细胞、物种或菌株中所见或源于其的分子或活性。例如， 异源核酸分子可与原生宿主细胞基因是同源的，但可具有改变的表达水平或可具有不同的 序列或两者。
[0059] 多于一个异源核酸分子可以作为独立的核酸分子、作为多顺反子核酸分子、作为 编码融合蛋白的单一核酸分子或其任何组合而被引入到宿主细胞中，并且仍然被视为多于 一个异源核酸。例如，如本文所公开，(^代谢微生物可以经过修饰以表达两个或更多个异源 或外源核酸分子，所述核酸分子编码所需的脂肪酸生物合成途径组分（例如硫酯酶、脂肪 酰基-CoA还原酶、醇脱氢酶）。当两个或更多个编码脂肪酸生物合成途径组分的外源核酸 分子被引入到宿主(^代谢微生物中时，应理解两个以上外源核酸分子可以作为单一核酸分 子（例如，在单一载体上）引入，在独立的载体上引入，可在单一位点或多个位点处整合到 宿主染色体中，并且仍然被视为两个或更多个外源核酸分子。因此，所提及的异源核酸分子 或蛋白质活性的数目指的是编码核酸分子的数目或蛋白质活性的数目，而不是引入到宿主 细胞中的独立的核酸分子的数目。
[0060] 术语"嵌合"指的是不为内源性并且包含接合或连接在一起的通常在自然界中未 发现接合或连接在一起的序列的任何核酸分子或蛋白质。例如，嵌合核酸分子可包含得自 不同来源的调控序列和编码序列，或得自相同来源、但以自然界中所发现的不同方式安排 的调控序列和编码序列。
[0061] 两个或更多个核酸序列之间的"同一性百分比"是序列所共有的相同位置的数目 的函数（即，同一性％=相同位置的数目/位置的总数X100)，这将间隙的数目以及需要 引入以优化两个或更多个序列的比对的每个间隙的长度考虑在内。序列的比较以及两个 或更多个序列之间的同一性百分比的确定可以使用数学算法来实现，如处于默认参数下 的 BLAST 和 Gapped BLAST 程序（例如，Altschul 等，J. Mol. Biol. 215:403, 1990 ;还参见 BLASTN，www. ncbi. nlm. nih. gov/BLAST) 〇
[0062] "保守取代"在本领域中被公认为一个氨基酸取代具有类似特性的另一个氨基 酸。示例性的保守取代在本领域中是众所周知的（参见例如W0 97/09433,第10页， 1997 年 3 月 13 日公开；Lehninger，Biochemistry,第 2 版；Worth Publishers，Inc. NY:NY(1975),第 71-77 页；Lewin, Genes IV，0xford University Press, NY and Cell Press, Cambridge, MA(1990)，第 8 页）。
[0063]如本文所用，"抑制"或"受抑制"指的是靶基因的表达或靶分子（例如，硫酯酶、酰 基-CoA合成酶、醇脱氢酶）的活性相对于对照、内源或参考分子直接或间接地改变、降低、 下调、消除，其中这种改变、降低、下调或消除在统计上、生物学上、工业上或临床上是显著 的。
[0064]如本文所用，术语"衍生物"指的是通过化学或生物手段，使用或者不使用酶对化 合物改性，所改性的化合物在结构上类似于母体化合物并且（实际上或理论上）可从母体 化合物衍生。衍生物可具有母体化合物的不同化学、生物或物理特性，如与母体化合物相 比，更亲水或具有改变的反应性。衍生化（即，改性）可涉及取代分子内的一个或更多个部 分（例如，官能团变化）。例如氢可被卤素如氟或氯取代，羟基（-OH)可被羧酸部分（-C00H) 置换。其它示例性衍生物包括糖基化、烷基化、酰基化、乙酰基化、遍在蛋白化、酯化以及酰 胺化。如本文所用，"脂肪酸衍生物"包括细胞中所发现的脂肪酸生物合成途径的中间体和 产物，诸如脂肪酰基载体蛋白、活化脂肪酸（例如含有酰基或辅酶）、脂肪醛、脂肪醇、脂肪 酯蜡、羟基脂肪酸、二羧酸、支链脂肪酸等等。
[0065]术语"衍生物"还指的是母体化合物的所有溶剂合物例如水合物或加合物（例如 与醇加合），活性代谢物以及盐。可制备的盐的类型取决于化合物内部分的性质。例如，酸 性部分如羧酸基团可形成碱金属盐或碱土金属盐（例如钠盐、钾盐、镁盐以及钙盐，以及具 有生理学上可耐受的季铵离子的盐，和与氨以及生理学上可耐受的有机胺的酸加成盐，所 述有机胺例如像三乙胺、乙醇胺或三_(2_羟乙基）胺）。碱性基团可例如与无机酸或有机 羧酸和磺酸形成酸加成盐，所述无机酸如盐酸、硫酸或磷酸，所述有机羧酸和磺酸如乙酸、 柠檬酸、乳酸、苯甲酸、马来酸、富马酸、酒石酸、甲磺酸或对甲苯磺酸。同时含有碱性基团和 酸性基团的化合物，例如除了碱性氮原子以外还有羧基，可作为两性离子存在。可通过本领 域技术人员已知的常规方法获得盐，例如通过在溶剂或稀释剂中组合化合物与无机或有机 酸或碱，或通过阳离子交换或阴离子交换由其它盐获得。
[0066] 制各脂肪酸衍牛物的组合物和方法
[0067] 用于产生脂肪酸衍生物的(^代谢微生物可经重组修饰以包含表达或过度表达所 关注的多肽的核酸序列。例如，Q代谢微生物可经修饰以增加酰基-CoA的产生，并且减小 脂肪酸生物合成途径中脂肪酸衍生物和中间体诸如酰基-CoA的分解代谢，或减小脂肪酸 生物合成途径中特定点的反馈抑制。除了修饰本文所述的基因，可使其它细胞资源转向以 过度产生脂肪酸，例如可削弱乳酸、丁二酸或乙酸途径，并且可过度表达乙酰基CoA羧化酶 (acc)。对本文所述的(^代谢微生物的修饰可通过基因组改变、添加重组表达系统或其组 合。
[0068] 所涉及的脂肪酸生物合成途径示出在图1至6中。所述途径中的不同步骤是由不 同的酶催化，并且每一步骤是基因过度表达以产生更多酶并且因此驱动更多脂肪酸和脂肪 酸衍生物学产生的潜在位置。编码所述途径所需的酶的核酸分子还可重组添加至缺少所述 酶的Ci代谢微生物。最终，可削弱或封闭将与产生脂肪酸和脂肪酸衍生物的途径竞争的步 骤，以便增加所需产物的产量。
[0069] 脂肪酸合酶（FAS)是催化酰基链的起始和延长的一组酶（Marrakchi 等，Biochemical Society 30:1050,2002)。酰基载体蛋白（ACP)连同FAS途径中的酶控制 着所产生的脂肪酸的长度、饱和度以及支化。这一途径中的步骤由脂肪酸生物合成（fab) 和乙酰基-辅酶-A羧化酶（acc)基因家族中的酶催化。取决于所需的产物，可削弱、表达 或过度表达这些基因中的一种或更多种（对于各酶的酶促活性的描绘和其酶分类编号，参 见图1-6)。
[0070] 产生宿主中的脂肪酸生物合成途径使用前体乙酰基-CoA和丙二酰基-CoA(参见 例如图1)。这一途径中的步骤由脂肪酸生物合成（fab)和乙酰基-辅酶-A羧化酶（acc) 基因家族中的酶催化。这一途径描述于Heath等，Prog. Lipid Res. 40:467, 2001中。
[0071] 乙酰基-CoA被乙酰基-CoA羧化酶（Acc，一种由四个独立的基因accABCD编码 的多亚单位酶）羧化，以形成丙二酰基-CoA。丙二酯基通过丙二酰基-C 〇A:ACP转酰基酶 (FabD)转移至ACP，以形成丙二酰基-ACP。然后，发生缩合反应，其中丙二酰基-ACP与乙酰 基-CoA合并，产生0 -酮脂酰基-ACP。0 -酮脂酰基-ACP合酶III (FabH)起始FAS循环， 而0 -酮脂酰基-ACP合酶I (FabB)和0 -酮脂酰基-ACP合酶II (FabF)涉及在后续循环 中。
[0072] 接着，重复一个循环的步骤，直至制得适当长度的饱和脂肪酸。首先，0 -酮脂酰 基-ACP被NADPH还原以形成0-羟酰基-ACP。这一步骤由0-酮脂酰基-ACP还原酶（FabG) 催化。羟酰基-ACP然后脱水以形成反式-2-烯酰基-ACP。羟酰基-ACP脱水酶/ 异构酶（FabA)或0-羟酰基-ACP脱水酶（FabZ)催化这一步骤。NADPH依赖性反式-2-烯 酰基-ACP还原酶I、II或III (分别为FabI、FabK以及FabL)将反式-2-烯酰基-ACP还 原以形成酰基-ACP。后续循环通过0 -酮脂酰基-ACP合酶I或0 -酮脂酰基-ACP合酶 II (分别为FabB和FabF)由丙二酰基-ACP与酰基-ACP的缩合起始。
[0073] 如本文所述的Q代谢微生物可经工程化以过度产生乙酰基-CoA和丙二酰 基-CoA。可对Q代谢微生物组合或单独地进行数种不同的修饰，以获得增加的乙酰 基-CoA/丙二酰基-CoA/脂肪酸和脂肪酸衍生物学产生。
[0074] 例如，为增加乙酰基-CoA产生，可在Q代谢微生物中表达以下基因中的一种或 更多种：pdh、panK、aceEF(编码丙酮酸和2-酮戊二酸脱氢酶复合物的Elp脱氢酶组分和 E2p二氢硫辛酰胺酰基转移酶组分）、fabH、fabD、fabG、acpP或fabF。在其它实例中，其 它编码脂肪酰基-CoA还原酶和醛脱羰酶的DNA序列可在Q代谢微生物中表达。本领域中 熟知的是，可构筑含有以上基因中的一种或更多种（均在组成型、或以其它方式可控的启 动子的控制下）的质粒。这些基因的示例性GenBank检索号为pdh(BAB34380、AAC73227、 AAC73226)、panK(还称为 coaA，AAC76952)、aceEF(AAC73227、AAC73226)、fabH(AAC74175)、 fabD(AAC74176)、fabG(AAC74177)、acpP(AAC74178)、fabF(AAC74179)。
[0075]另外，可在工程化微生物中通过用含有对应基因的无效或缺失突变的条件复制 或不复制质粒转化，或通过取代启动子或增强子序列减小、抑制或敲除fadE、gpsA、ldhA、 pflb、adhE、pta、poxB、ackA或ackB的表达水平。这些基因的示例性GenBank检索号为 fadE(AAC73325)、gspA(AAC76632)、ldhA(AAC74462)、pflb(AAC73989)、adhE(AAC74323)、 pta(AAC75357)、poxB(AAC73958)、ackA(AAC75356)以及 ackB(BAB81430)。当在适当环境中 如用(^底物原料生长时，所得工程化C i代谢微生物将具有增加的乙酰基-CoA产生水平。
[0076] 此外，可通过用从头合成的质粒中包含的accAB⑶（例如，检索号AAC73296, EC 6. 4. 1. 2)将如本文所述的Q代谢微生物工程化来影响丙二酰基-CoA过度产生。脂肪酸过 度产生可通过在从头合成的质粒中还包含编码脂肪酶的核酸分子（例如，Genbank检索号 CAA89087、CAA98876)来实现。
[0077] 因此，在一些实例中，乙酰基-CoA羧化酶被过度表达以将其细胞内浓度相对于原 生表达水平增加至少约2倍、优选地至少约5倍或更优选地至少约10倍。
[0078] 在一些实施方案中，plsB(例如Genbank检索号AAC77011)D311E突变可用来增加 可用的酰基-CoA的量。在其它实施方案中，Ci代谢微生物中可包含sfa基因（FabA的压 制因子，例如Genbank检索号AAN79592)的过度表达，以增加单不饱和脂肪酸的产生（Rock 等，J. Bacteriology 178:5382, 1996) 〇
[0079] 如本文所述，在若干步骤中处理乙酰基-CoA和丙二酰基-CoA以形成酰基-ACP 链。酶sn-甘油-3-磷酸酰基转移酶（PlsB)催化酰基从酰基-ACP或酰基-CoA转移至甘 油-3-磷酸的sn-1位。因此，PlsB是磷脂合成中的关键调控酶，磷脂合成是脂肪酸途径的 一部分。抑制PlsB导致长链酰基-ACP的水平增加，这种反馈将抑制途径中的早期步骤（例 如accAB⑶、fabH以及fabl)。例如通过硫酯酶过渡表达将这种调控作用解联接引起脂肪 酸产生增加。Tes和fat基因家族表达硫酯酶。FabI还体外受长链酰基-CoA抑制。
[0080] 为将Ci代谢微生物工程化以用于产生均匀或混合的脂肪酸衍生物群体，可削弱、 抑制或功能性缺失一种或更多种内源性基因，并且因此可表达一种或更多种硫酯酶。例如， 可通过削弱使用C 18:1-ACP的硫酯酶C18 (例如Genbank检索号AAC73596和P0ADA1)并且同 时表达使用C1(I-ACP的硫酯酶C 1(l (例如Genbank检索号Q39513)产生C1(l脂肪酸衍生物。这 产生相对均匀的碳链长度为10的脂肪酸衍生物群体。在另一实例中，C 14脂肪酸衍生物通过 削弱产生非C14脂肪酸的内源性硫酯酶并且表达硫酯酶检索号Q39473(其使用C 14-ACP)产 生。在另一实例中，C12脂肪酸衍生物可通过表达使用C12-ACP的硫酯酶（例如Genbank检索 号Q41635)并且削弱产生非C 12脂肪酸的硫酯酶产生。可使用本领域已知的方法验证乙酰 基-CoA、丙二酰基-CoA以及脂肪酸过度表达，例如通过使用放射性前体、HPLC以及GC-MS， 随后进行细胞溶解。在本公开所要求保护的方法和Q代谢微生物中有用的硫酯酶的非限 制性实例列于美国专利号8, 283, 143的表1中，所述表特此以引用的方式全部并入。
[0081] 酰基-CoA合酶（ACS)通过两步机制使游离脂肪酸酯化成酰基-CoA。游离脂肪酸 首先通过ATP的焦磷酸解作用转化成酰基-AMP中间体（一种腺苷酸酯）。腺苷酸酯的活 化的羰基碳然后联接至CoA的硫醇基，从而释放AMP和酰基-CoA最终产物。参见Shockey 等，Plant. Physiol. 129:1710, 2002。
[0082] 大肠杆菌ACS酶FadD和脂肪酸转运蛋白FadL是脂肪酸摄取系统的基本组分。 FadL介导脂肪酸转运到细菌细胞中，并且FadD介导酰基-CoA酯形成。在没有其它碳源 可用时，细菌摄取外源性脂肪酸，并且将其转化成酰基-CoA酯，酰基-CoA酯结合转录因 子FadR并且解除对fad基因表达的抑制，fad基因编码负责脂肪酸转运、活化（FadD)和 氧化$8(^、？&(^、？&(^、以及？ &(111)的蛋白$&也）。当其它天然碳源可用时，细菌合成 脂肪酸作为酰基-ACP，酰基-ACP用于磷脂合成，但不是氧化的底物。因此，酰基-CoA 和酰基-ACP均为将产生不同最终产物的脂肪酸的独立来源。参见Caviglia等，J. Biol. Chem. 279:1163, 2004。
[0083] Q代谢微生物可使用编码已知多肽的核酸分子进行工程化，以产生各种长度的脂 肪酸，这些脂肪酸然后可转化成酰基-CoA并且最终转化成脂肪酸衍生物，如脂肪醇。一种 制备脂肪酸衍生物的方法涉及增加一种或多种酰基-CoA合酶肽（EC 6. 2. 1.-)的表达或表 达其活性更大的形式。美国专利号8, 283, 143的表2中示出可表达以产生酰基-CoA和脂 肪酸衍生物的酰基-CoA合酶的列表，所述表特此以引用的方式全部并入。这些酰基-CoA 合酶可用于改进使用脂肪酰基-CoA作为底物的任何途径。
[0084] 酰基-CoA被NADH-依赖性酰基-CoA还原酶（例如Acr 1)还原成脂肪醛。脂 肪醛然后被NADPH-依赖性醇脱氢酶（例如YqhD)还原成脂肪醇。或者，脂肪醇形成酰 基-CoA还原酶（FAR)催化酰基-CoA还原成脂肪醇和CoASH。在这一四电子还原反应中 FAR使用NADH或NADPH作为辅因子。虽然，产生醇的FAR反应进行至醛中间体，但未释放 游离醛。因此，醇形成FAR不同于进行酰基-CoA的两电子还原并且产生游离脂肪醛作为 产物的那些酶。（参见 Cheng 和 Russell, J. Biol. Chem.，279:37789, 2004 ;Metz 等，Plant Physiol. 122:635, 2000)〇
[0085] Q代谢微生物可使用已知多肽进行工程化，以由酰基-CoA产生脂肪醇。一种制备 脂肪醇的方法涉及增加脂肪醇形成酰基-CoA还原酶（由如来自FAR的acrl的基因编码， EC 1. 2. 1. 50/1. 1. 1)或酰基-CoA 还原酶（EC 1. 2. 1. 50)以及醇脱氢酶（EC 1. 1. 1. 1)的 表达或表达其活性更大的形式。示例性GenBank检索号列于美国专利号8, 283, 143的图1 中，所述图特此以引用的方式全部并入。
[0086] 脂肪醇可描述为基于烃的表面活性剂。对于表面活性剂产生，修饰(^代谢微生 物以使得其由Ci底物原料产生表面活性剂。所述c i代谢微生物包括编码能够将脂肪酸 转化成脂肪醛的蛋白质的第一外源性核酸分子和编码能够将脂肪醛转化成醇的蛋白质的 第二外源性核酸分子。在一些实例中，第一外源性核酸分子编码脂肪酸还原酶（FAR)。在 一个实施方案中，第二外源性核酸分子编码哺乳动物微粒体醛还原酶或长链醛脱氢酶。 在另一实例中，第一和第二外源性核酸分子是来自节杆菌（Arthrobacte;r)AK 19、粘红酵 母（Rhodotorula glutinins)、不动杆菌属（Acinetobacter sp.)M_l 或解脂假丝酵母 (Candida lipolytica)。在一个实施方案中，第一和第二异源核酸分子是来自来自不动杆 菌属M-1或解脂假丝酵母的多酶复合物。
[0087]可用于表面活性剂产生中的、编码脂肪酸至长链醇转化蛋白的异源核酸分 子的其它来源包括高山被孢霉（Mortierella alpina)(ATCC 32222)、弯曲隐球酵母 (Cryptococcus curvatus)(还称为 Apiotricum curvatum)、亚德食烧菌(Akanivorax jadensis) (T9T = DSM 12718 = ATCC 700854)、不动杆菌属 H01-N(ATCC 14987)以及不透 明红球菌（Rhodococcus opacus) (PD630 DSMZ 44193)。
[0088] 在一个实例中，脂肪酸衍生物为饱和或不饱和表面活性剂产物，其碳链长度为约8 至约24个碳原子、约8至约18个碳原子、约8至约14个碳原子、约10至约18个碳原子， 或约12至约16个碳原子。在另一实例中，表面活性剂产物的碳链长度为约10至约14个 碳原子，或约12至约14个碳原子。
[0089] 用于产生表面活性剂的适当Q代谢微生物可为真核或原核微生物。使用证明由 Ci原料合成高水平脂肪酸衍生物形式的表面活性剂前体的先天性能力的C i代谢微生物，如 经工程化以表达乙酰基CoA羧化酶的产甲烷菌。
[0090] 产生宿主可使用已知多肽进行工程化，以产生各种长度的脂肪酯。一种制备脂肪 酯的方法包括增加一种或多种醇〇-乙酰基转移酶肽（EC 2. 3. 1. 84)的表达或表达其活性 更大的形式。这些肽通过将乙酰基-CoA和醇转化成CoA和酯催化醇乙酰基化。在一些实 例中，醇0-乙酰基转移酶肽可结合所选择的硫酯酶肽、FAS肽以及脂肪醇形成肽一起表达， 因此允许控制碳链长度、饱和性以及支化度。在一些情况中，可共表达bkd操纵子，以使得 能够产生支链脂肪酸前体。
[0091] 如本文所用，醇0-乙酰基转移酶肽包括酶分类编号EC 2. 3. 1. 84的肽，以及能够 催化乙酰基-CoA和醇转化以形成CoA和酯的任何其它肽。另外，本领域的一般技术人员应 理解醇0-乙酰基转移酶肽将催化其它反应。
[0092] 例如，除了脂肪醇或乙酰基-CoA硫酯以外，一些醇0-乙酰基转移酶肽将接受其它 底物，如其它醇和其它酰基-CoA硫酯。因此，还包括所述非特异性或发散特异性醇0-乙酰 基转移酶肽。醇〇-乙酰基转移酶肽序列公开可获得，并且示例性GenBank检索号列于美国 专利号8, 283, 143的图1，所述图特此以引用的方式全部并入。用于表征具体醇0-乙酰基 转移酶肽活性的测定在本领域是熟知的。〇-酰基转移酶可经工程化以对于供体酰基或受体 醇部分具有新的活性和特异性。可通过经文献充分证明的合理且变革性方法产生工程化的 酶。
[0093] 脂肪酯通过酰基-CoA:脂肪醇酰基转移酶（例如酯合酶）进行合成，所述酶经由 酯键将长链脂肪醇缀合至脂肪酰基-CoA。酯合酶和编码基因是自西蒙德木植物和细菌不 动杆菌属ADP1 (原为乙酸妈不动