>[0038]实施例2
[0039]一种用实施例1的试剂盒对乙型肝炎病毒HBV基因分型及耐药性位点分析的方法，包括以下步骤:
[0040]I)乙型肝炎病毒HBV基因组的提取:以含灭活乙肝病毒的血清为样本，取200ul血清样本，加入20ul蛋白酶K溶液到1.5ml离心管中，另外加入5ulRNaseA(50mg/ml)溶液，混合均匀；加入200ul红细胞裂解液，混匀充分，瞬时离心后置于56°C水浴中，温浴15min，并且每隔3min颠倒混匀一次，加入200ul无水乙醇，震荡10s，将混合后的溶液全部转移到套有2ml收集管的吸附柱中，室温下，1000g离心lmin，倒掉收集管中废液，将吸附柱放到一个新的2ml收集管中，使用washing buffer 500ul，室温离心13000g离心lmin，重复洗脱两次，室温下13000g离心2min，去除残留在吸附柱上面的废液和.washing buffer，然后将吸附柱置于一个干净灭菌的1.5ml离心管中，使用去离子水将吸附柱硅胶膜上的DNA洗脱下来；
[0041]2)基因组序列扩增:根据已知乙型肝炎病毒HBV基因组序列分析，得到P区及S区序列，P区和S区经过同源性比对，设计合成一对引物扩增目的区域的序列:
[0042]引物序列:
[0043]HBV-forward primer(HBV-FP):GGTGGACTTCTCTCAATTTTCTAGG
[0044]HBV-reverse primer (HBV-RP):GTGCAGAGGTGAAGCGAAGTG
[0045]其中的PCR 反应液包括:1xTaq buffer、1pmoI/uI 的 HBV-FP 和 HBV_RP、25mM 的Mgcl2、2mM的dNTPs、IU的Taq酶、乙型肝炎病毒HBV DNA及去离子水，扩增结果如附图1所示，其中，M:marker DL2000 ；1:阳性对照标准品；2:样品I ;3:样品2 ;4:阴性对照。
[0046]3)乙型肝炎病毒HBV分型:对扩增得到的DNA进行测序，测序所得P区(包含S区)的碱基序列，通过NCBI在线分型数据库进行分型分析:
[0047]分型网站:http://www.ncb1.nlm.nih.gov/projects/genotyping/formpage.cgi ；
[0048]测序结果拼接如附图2所示。
[0049]阳性对照标准品分型结果如附图3所示，样品I为B型，样品2为C型；
[0050]4)乙型肝炎病毒HBV耐药性位点分析:基于目前治疗乙肝的药物主要是核苷类药物，其治疗原理是通过与乙型肝炎病毒HBV多聚酶的天然底物dNTP竞争来达到抑制乙型肝炎病毒HBV多聚酶活性，从而达到抑制乙型肝炎病毒HBV复制的作用；测定对下列位点的基因分析，确定耐药性情况:
[0051]A、拉米夫定(LAM):rtM204V/I，rtL180M、rtV173L，
[0052]B、阿德福韦酯(ADV):rtA181T/V、rtN236T、rtI233V，
[0053]C、恩替卡韦(ETV):rtT184G、rtS202G/1、rtI169T、rtM250V，
[0054]D、替比夫定(LdT):rtM204I/V、rtL180M。
[0055]以标准品为例，耐药性位点比对如附图4所示。
[0056]从附图4的测序峰图分析得到，四种药物的耐药性位点均未发生突变，所以前期用药可以暂不考虑耐药性问题。
[0057]以此:样品I为rtM204V突变，为LAM耐药；样品2没有耐药性突变发生。
[0058]以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1.一种对HBV基因分型及耐药性位点分析的试剂盒，该试剂盒包括1xPCR Permix、乙型肝炎病毒HBV靶DNA扩增引物以及去离子水，所述乙型肝炎病毒HBV靶DNA扩增引物是:HBV-forward primer (HBV-FP):GGTGGACTTCTCTCAATTTTCTAGGHBV-reverse primer (HBV-RP):GTGCAGAGGTGAAGCGAAGTG所述 1xPCR Permix 包括:1xTaq buffer^ 25mM 的 Mgcl2、2mM 的 dNTPs、IU 的 Taq 酶及去离子水。2.根据权利要求1所述的对乙型肝炎病毒HBV基因分型及耐药性位点分析的试剂盒，其特征在于:所述试剂盒还包括乙型肝炎病毒HBV DNA提取试剂、阳性对照标准品和阴性对照。3.根据权利要求2所述的对乙型肝炎病毒HBV基因分型及耐药性位点分析的试剂盒，其特征在于:所述乙型肝炎病毒HBV DNA提取试剂包括20mg/ml的蛋白酶K、50mg/ml的RNaseA、红细胞裂解液、无水乙醇、吸附柱、washing buffer以及去离子水。4.根据权利要求2所述的对乙型肝炎病毒HBV基因分型及耐药性位点分析的试剂盒，其特征在于:所述的阳性对照标准品为已知型别的乙型肝炎病毒HBV DNA样品，所述阴性对照为去离子水。5.一种对乙型肝炎病毒HBV基因分型及耐药性位点分析的方法，其特征在于，包括以下步骤: 1)乙型肝炎病毒HBV基因组的提取:以含灭活乙型肝炎病毒HBV的血清为样本，取200ul血清样本，加入20ul蛋白酶K溶液到1.5ml离心管中，另外加入5ul RNaseA溶液，混合均匀；加入200ul红细胞裂解液，混匀充分，低速瞬时离心后置于56°C水浴中，温浴15min，并且每隔3min颠倒混匀一次，加入200ul无水乙醇，震荡10s，将混合后的溶液全部转移到套有2ml收集管的吸附柱中，室温下，1000g离心lmin，倒掉收集管中废液，将吸附柱放到一个新的2ml收集管中，使用washing buffer 500ul，室温离心13000g离心lmin，重复洗脱两次，室温下13000g离心2min，去除残留在吸附柱上面的废液和.washing buffer，然后将吸附柱置于一个干净灭菌的1.5ml离心管中，使用去离子水将吸附柱硅胶膜上的DNA洗脱下来； 2)基因组序列扩增:根据已知乙型肝炎病毒HBV基因组序列分析，得到P区及S区序列，P区和S区经过同源性比对，设计合成一对引物扩增目的区域的序列: 引物序列:HBV-forward primer (HBV-FP):GGTGGACTTCTCTCAATTTTCTAGGHBV-reverse primer (HBV-RP):GTGCAGAGGTGAAGCGAAGTG 其中的 PCR 反应液包括:1xTaq buffer、1pmoI/uI 的 HBV-FP 和 HBV_RP、25mM 的Mgcl2、2mM的dNTPs、IU的Taq酶、乙型肝炎病毒HBV DNA及去离子水； 3)乙型肝炎病毒HBV分型:对扩增得到的DNA片段进行测序分析，测序所得P区(包含S区)的碱基序列，通过NCBI在线分型数据库进行分型分析:分型网站:http://www.ncb1.nlm.nih.gov/projects/genotyping/formpage.cgi ； 4)乙型肝炎病毒HBV耐药性位点分析:基于目前治疗乙肝的药物主要是核苷类药物，其治疗原理是通过与乙型肝炎病毒HBV多聚酶的天然底物dNTP竞争来达到抑制乙型肝炎病毒HBV多聚酶活性，从而达到抑制乙型肝炎病毒HBV复制的作用；测定对下列位点的基因分析，确定耐药性情况: A、拉米夫定(LAM):rtM204V/I，rtL180M、rtV173L， B、阿德福韦酯(ADV):rtA181T/V、rtN236T、rtI233V，C、恩替卡韦(ETV):rtT184G、rtS202G/1、rtI169T、rtM250V， D、替比夫定(LdT):rtM204I/V、rtL180M。
【专利摘要】本发明提出了一种对HBV基因分型及耐药性位点分析的试剂盒及其方法，试剂盒包括10xPCR？Permix、乙型肝炎病毒HBV靶DNA扩增引物、阳性对照标准品以及去离子水，本发明的方法是基于sanger法DNA一代测序技术，对乙型肝炎病毒HBV的基因组进行序列测序分析，碱基序列测读的准确率达99.9％，根据测序得到的乙型肝炎病毒HBV的基因组序列，来对病毒进行分型，及其相关耐药性位点分析；该方法得到的结果准确性极高，灵敏度高，可高通量操作，有利于应用在精准医疗，对慢性乙肝长期治疗给予准确的指导。
【IPC分类】C12R1/93, C12Q1/70, C12Q1/68
【公开号】CN105112562
【申请号】CN201510528416
【发明人】张明航, 陈文娟, 刘志海, 黄寅
【申请人】广州艾基生物技术有限公司
【公开日】2015年12月2日
【申请日】2015年8月25日