盆腔脱垂高表达基因及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物医药领域，具体涉及盆腔脱垂高表达基因及其应用，更具体的涉 及CHRDL2基因在盆腔脱垂诊治中的应用。
【背景技术】
[0002] 盆腔器官脱垂（pelvic organ prolapse，POP)是由于盆底支持结构的缺陷、损伤 或功能障碍造成的，是影响中老年女性生活质量的常见疾病，主要是由盆底支持结构缺陷 或者退化、损伤及功能障碍所导致。关于POP的基础研究较少，且涉及的领域局限，其病因 及发病机制不明，尤其是分子水平的基础研究尚不能全面阐明盆底支持组织的损伤机制， 需更深入广泛的探讨。由于其发病机制尚不明确，目前的治疗大多数只是对其症状进行治 疗，而无法从病因上根治疾病。无论是手术治疗还是保守治疗，都存在并发症以及复发等问 题，因此，要及早诊断P0P，选择合适的治疗方式并防止复发，就需要从发病机制上对POP进 行研究。
[0003] 发明人对9例盆腔脱垂病例样本及3例对照进行高通量测序，结合生物信息学方 法进行基因筛选，挑选出候选的CHRDL2基因。进一步，本发明进行了荧光定量实验，结果证 实了 CHRDL2与盆腔脱垂具有很好的相关性，CHRDL2在盆腔脱垂患者组织中明显高表达，细 胞生物学实验结果表明，CHRDL2基因影响宫骶韧带成纤维细胞的生长增殖活性。本发明提 供的CHRDL2基因可用于制备盆腔脱垂辅助诊疗制剂，具有重要的临床应用价值。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供一种分子标志物在制备盆腔脱垂诊断制剂中的应用，所述 分子标志物为CHRDL2基因和/或CHRDL2基因的表达产物。
[0005] 为实现上述目的，本发明首先通过高通量测序结合生物信息学方法筛选到候选 基因CHRDL2基因，进而通过分子细胞生物学方法验证了 CHRDL2基因与盆腔脱垂的关系： CHRDL2基因与盆腔脱垂具有很好的相关性，可用于制备盆腔脱垂辅助诊断制剂，具有重要 的临床应用价值。
[0006] 进一步的，所述的分子标志物在盆腔脱垂组织中高表达。CHRDL2基因在盆腔脱垂 组织中的表达水平高于对照组织6倍多。
[0007] 进一步，所述的盆腔脱垂的诊断制剂采用荧光定量PCR试剂盒、基因芯片检测盆 腔脱垂组织中CHRDL2基因的表达，优选的，所述的荧光定量PCR试剂盒中含有一对特异性 扩增CHRDL2基因的引物；所述的基因芯片中包括与CHRDL2基因的核酸序列杂交的探针。 更优选的，所述特异性扩增CHRDL2基因的引物为SEQ ID N0. 11和SEQ ID N0. 12。
[0008] 进一步，所述的盆腔脱垂的诊断制剂采用免疫方法检测盆腔脱垂组织中CHRDL2 基因的表达产物，优选的，所述免疫方法为ELISA检测和/胶体金检测。
[0009] 进一步，所述检测CHRDL2蛋白的ELISA法为使用ELISA检测试剂盒。所述试剂盒 中的抗体可采用市售的CHRDL2单克隆抗体。进一步，所述的试剂盒包括：包被CHRDL2单克 隆抗体的固相载体，酶标抗体，酶的底物，蛋白标准品，阴性对照品，稀释液，洗涤液，酶反应 终止液等。
[0010] 进一步，所述检测CHRDL2蛋白的胶体金法为使用检测试剂盒，所述的抗体可采用 市售的CHRDL2单克隆抗体。进一步，所述的胶体金检测试剂盒采用胶体金免疫层析技术或 胶体金渗滤法。进一步，所述的胶体金检测试剂盒硝酸纤维素膜上的检测区（T)喷点有抗 CHRDL2单克隆抗体、质控区（C)喷点有免疫球蛋白IgG。
[0011] 优选的抗CHRDL2单克隆抗体选自下列抗体：Novus Biologicals公司提供的货号 为 H00025884-D01P Chordin-like 2/CHRDL2 抗体，Abeam 公司提供的 Anti-CHRDL2 抗体 (货号为 abl33852)。
[0012] 本发明的目的还在于提供一种分子标志物在制备盆腔脱垂治疗制剂中的应用，所 述分子标志物为CHRDL2基因和/或基因的表达产物。
[0013] 进一步，所述盆腔脱垂治疗制剂抑制分子标志物的转录和/或表达。
[0014] 本领域人员熟知抑制基因及其表达产物的表达通常可以采用下述方法中的一种 和/或几种：通过激活目的基因的抑制基因、激活目的基因的抑制基因表达的蛋白、采用 RNA干扰技术抑制目的基因表达、激活促进目的基因mRNA降解的microRNA、导入促进目 的基因编码蛋白降解的分子、抑制促进目的基因表达的因子及蛋白的表达。即通过激活 CHRDL2基因的抑制基因、激活抑制CHRDL2基因表达的蛋白、导入抑制CHRDL2基因表达的 siRNA、激活促进CHRDL2基因mRNA降解的microRNA、导入促进CHRDL2基因表达的蛋白降解 的分子、抑制促进CHRDL2基因表达的因子及蛋白的表达。
[0015] 进一步，所述抑制CHRDL2基因转录或表达的siRNA序列选自下列序列中的一种和 / 或几种：SEQ ID N0. 1、SEQ ID N0. 2、SEQ ID N0. 3、SEQ ID N0. 4、SEQ ID N0. 5、SEQ ID N0.6、SEQ ID N0.7、SEQ ID N0.8。
[0016] RNA干扰（RNAi)是指外源性和内源性双链RNA在生物体内诱导同源靶基因的 mRNA特异性降解，导致转录后基因沉默的现象，是一种使用小的双链RNA高效、特异地阻断 体内某种特定基因的表达，促使mRNA降解，使细胞表现出特定基因缺失表型的技术。siRNA 设计完成后可以采用直接合成法或者构建siRNA表达载体，制备好的siRNA可以通过磷酸 ?丐共沉淀法、电穿孔法、DEAE-葡聚糖和polybrene法、显微注射或基因枪等机械法、阳离子 脂质体试剂法等途径转染细胞。
[0017] 本发明的目的在于提供一种盆腔脱垂抑制剂，所述盆腔脱垂抑制剂抑制CHRDL2 基因的转录或表达，优选的，盆腔脱垂抑制剂中含有抑制CHRD L 2基因的转录或表达的 siRNA〇
[0018] 本发明的目的在于提供一种盆腔脱垂诊断制剂，所述盆腔脱垂诊断制剂检测 CHRDL2基因的转录或表达，优选的，盆腔脱垂诊断制剂采用荧光定量PCR试剂盒、基因芯 片、免疫方法检测。
[0019] 荧光定量PCR法是通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针，对PCR产物进行标 记跟踪，实时在线监控反应过程，结合相应的软件可以对产物进行分析，计算待测样品模板 的初始浓度。荧光定量PCR的出现，极大地简化了定量检测的过程，而且真正实现了绝对定 量。多种检测系统的出现，使实验的选择性更强。自动化操作提高了工作效率，反应快速、 重复性好、灵敏度高、特异性强、结果清晰。
[0020]基因芯片又称为DNA微阵列（DNA microarray)，可分为三种主要类型：1)固定在 聚合物基片（尼龙膜，硝酸纤维膜等）表面上的核酸探针或cDNA片段，通常用同位素标记 的靶基因与其杂交，通过放射显影技术进行检测。2)用点样法固定在玻璃板上的DNA探针 阵列，通过与荧光标记的靶基因杂交进行检测。3)在玻璃等硬质表面上直接合成的寡核苷 酸探针阵列，与荧光标记的靶基因杂交进行检测。基因芯片作为一种先进的、大规模、高通 量检测技术，应用于疾病的诊断，其优点有以下几个方面：一是高度的灵敏性和准确性；二 是快速简便；二是可同时检测多种疾病。
[0021] 酶联免疫吸附实验（ELISA)即将已知的抗原或抗体吸附在固相载体表面，使酶标 记的抗原抗体反应在固相表面进行的技术。该技术可用于检测大分子抗原和特异性抗体 等，具有快速、灵敏、简便、载体易于标准化等优点。ELISA检测试剂盒根据检测目的和操作 步骤可分为间接法、双抗夹心法、竞争法、双位点一步法、捕获法测IgM抗体、应用亲和素和 生物素的ELISA。ELISA检测试剂盒中生色底物可选择辣根过氧化物酶（HRP)或者碱性磷 酸酶（AP)。
[0022] 常用的免疫胶体金检测技术：（1)免疫胶体金光镜染色法细胞悬液涂片或组织切 片，可用胶体金标记的抗体进行染色，也可在胶体金标记的基础上，以银显影液增强标记， 使被还原的银原子沉积于已标记的金颗粒表面，可明显增强胶体金标记的敏感性。（2)免疫 胶体金电镜染色法可用胶体金标记的抗体或抗抗体与负染病毒样本或组织超薄切片结合， 然后进行负染。可用于病毒形态的观察和病毒检测。（3)斑点免疫金渗滤法应用微孔滤膜 作载体，先将抗原或抗体点于膜上，封闭后加待检样本，洗涤后用胶体金标记的抗体检测相 应的抗原或抗体。（4)胶体金免疫层析法将特异性的抗原或抗体以条带状固定在膜上，胶 体金标记试剂（抗体或单克隆抗体）吸附在结合垫上，当待检样本加到试纸条一端的样本 垫上后，通过毛细作用向前移动，溶解结合垫上的胶体金标记试剂后相互反应，当移动至固 定的抗原或抗体的区域时，待