Stac2基因及其编码蛋白在抑制盆腔脱垂中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物医药领域，具体涉及STAC2基因及其编码蛋白在抑制盆腔脱垂中 的应用。
【背景技术】
[0002] 盆腔器官脱垂（pelvic organ prolapse，P0P)是由环境和遗传因素共同作用所致 的复杂多因素疾病。除阴道分娩、妊娠损伤、激素水平改变、衰老、肥胖、长期腹压增加等环 境因素可以增加POP的易感性外，个体遗传因素也在POP的发生中扮演着重要角色。目前 认为POP是由于盆底支持组织因退化、损伤所致松弛，而引发的一种盆底肌肉退行性疾病。 但关于POP的基础研究较少，且涉及的领域局限，其病因及发病机制不明，尤其是分子水平 的基础研究尚不能全面阐明盆底支持组织的损伤机制，需更深入广泛的探讨。
[0003] 发明人对9例盆腔脱垂病例样本及3例对照进行高通量测序，结合生物信息学方 法进行基因筛选，挑选出候选的STAC2基因。进一步，本发明进行了分子细胞生物学方法证 实了候选基因与盆腔脱垂的关系：候选基因与盆腔脱垂具有很好的相关性，候选基因在盆 腔脱垂患者组织中明显低表达，可用于制备盆腔脱垂辅助诊疗制剂，具有重要的临床应用 价值。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供一种分子标志物在制备盆腔脱垂诊断制剂中的应用，所述 分子标志物为STAC2基因和/或STAC2基因的表达产物。
[0005] 为实现上述目的，本发明首先通过高通量测序结合生物信息学方法筛选到候选基 因STAC2基因，进而通过分子细胞生物学方法验证了 STAC2基因与盆腔脱垂的关系：STAC2 基因与盆腔脱垂具有很好的相关性，可用于制备盆腔脱垂辅助诊断制剂，具有重要的临床 应用价值。
[0006] 进一步的，所述的分子标志物在盆腔脱垂组织中低表达。
[0007] 进一步，所述的盆腔脱垂的诊断制剂采用荧光定量PCR试剂盒、基因芯片检测盆 腔脱垂组织中STAC2基因的表达，优选的，所述的荧光定量PCR试剂盒中含有一对特异性扩 增STAC2基因的引物；所述的基因芯片中包括与STAC2基因的核酸序列杂交的探针。更优 选的，所述特异性扩增STAC2基因的引物为SEQ ID NO. 1和SEQ ID N0. 2。
[0008] 进一步，所述的盆腔脱垂的诊断制剂采用免疫方法检测盆腔脱垂组织中STAC2基 因的表达产物，优选的，所述免疫方法为ELISA检测和/胶体金检测。
[0009] 进一步，所述检测STAC2蛋白的ELISA法为使用ELISA检测试剂盒。所述试剂盒 中的抗体可采用市售的STAC2单克隆抗体。进一步，所述的试剂盒包括：包被STAC2单克隆 抗体的固相载体，酶标抗体，酶的底物，蛋白标准品，阴性对照品，稀释液，洗涤液，酶反应终 止液等。
[0010] 进一步，所述检测STAC2蛋白的胶体金法为使用检测试剂盒，所述的抗体可采用 市售的STAC2单克隆抗体。进一步，所述的胶体金检测试剂盒采用胶体金免疫层析技术或 胶体金渗滤法。进一步，所述的胶体金检测试剂盒硝酸纤维素膜上的检测区（T)喷点有抗 STAC2单克隆抗体、质控区（C)喷点有免疫球蛋白IgG。
[0011] 本发明的目的还在于提供一种分子标志物在制备盆腔脱垂治疗制剂中的应用，所 述分子标志物为STAC2基因和/或基因的表达产物。
[0012] 进一步，所述盆腔脱垂治疗制剂促进STAC2基因的转录和/或表达。
[0013] 本领域人员熟知促进基因及其表达产物的表达通常可以采用下述方法中的一种 和/或几种：激活分子标志物的启动子、激活分子标志物表达的蛋白或因子、导入促进分子 标志物转录或表达的载体。
[0014] 本发明的目的在于提供一种盆腔脱垂抑制剂，所述盆腔脱垂抑制剂促进STAC2基 因的转录或表达，优选的，盆腔脱垂抑制剂中含有促进STAC2基因的转录或表达的载体和/ 或激活STAC2基因的启动子和/或激活STAC2基因表达的蛋白或因子。
[0015] 本发明的目的在于提供一种盆腔脱垂诊断制剂，所述盆腔脱垂诊断制剂检测 STAC2基因的转录或表达，优选的，盆腔脱垂诊断制剂采用荧光定量PCR试剂盒、基因芯片、 免疫方法检测。
[0016] 荧光定量PCR法是通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针，对PCR产物进行标 记跟踪，实时在线监控反应过程，结合相应的软件可以对产物进行分析，计算待测样品模板 的初始浓度。荧光定量PCR的出现，极大地简化了定量检测的过程，而且真正实现了绝对定 量。多种检测系统的出现，使实验的选择性更强。自动化操作提高了工作效率，反应快速、 重复性好、灵敏度高、特异性强、结果清晰。
[0017] 基因芯片又称为DNA微阵列（DNA microarray)，可分为三种主要类型：1)固定在 聚合物基片（尼龙膜，硝酸纤维膜等）表面上的核酸探针或cDNA片段，通常用同位素标记 的靶基因与其杂交，通过放射显影技术进行检测。2)用点样法固定在玻璃板上的DNA探针 阵列，通过与荧光标记的靶基因杂交进行检测。3)在玻璃等硬质表面上直接合成的寡核苷 酸探针阵列，与荧光标记的靶基因杂交进行检测。基因芯片作为一种先进的、大规模、高通 量检测技术，应用于疾病的诊断，其优点有以下几个方面：一是高度的灵敏性和准确性；二 是快速简便；二是可同时检测多种疾病。
[0018] 酶联免疫吸附实验（ELISA)即将已知的抗原或抗体吸附在固相载体表面，使酶标 记的抗原抗体反应在固相表面进行的技术。该技术可用于检测大分子抗原和特异性抗体 等，具有快速、灵敏、简便、载体易于标准化等优点。ELISA检测试剂盒根据检测目的和操作 步骤可分为间接法、双抗夹心法、竞争法、双位点一步法、捕获法测IgM抗体、应用亲和素和 生物素的ELISA。ELISA检测试剂盒中生色底物可选择辣根过氧化物酶（HRP)或者碱性磷 酸酶（AP)。
[0019] 常用的免疫胶体金检测技术：（1)免疫胶体金光镜染色法细胞悬液涂片或组织切 片，可用胶体金标记的抗体进行染色，也可在胶体金标记的基础上，以银显影液增强标记， 使被还原的银原子沉积于已标记的金颗粒表面，可明显增强胶体金标记的敏感性。（2)免疫 胶体金电镜染色法可用胶体金标记的抗体或抗抗体与负染病毒样本或组织超薄切片结合， 然后进行负染。可用于病毒形态的观察和病毒检测。（3)斑点免疫金渗滤法应用微孔滤膜 作载体，先将抗原或抗体点于膜上，封闭后加待检样本，洗涤后用胶体金标记的抗体检测相 应的抗原或抗体。（4)胶体金免疫层析法将特异性的抗原或抗体以条带状固定在膜上，胶 体金标记试剂（抗体或单克隆抗体）吸附在结合垫上，当待检样本加到试纸条一端的样本 垫上后，通过毛细作用向前移动，溶解结合垫上的胶体金标记试剂后相互反应，当移动至固 定的抗原或抗体的区域时，待检物与金标试剂的结合物又与之发生特异性结合而被截留， 聚集在检测带上，可通过肉眼观察到显色结果。该法现已发展成为诊断试纸条，使用十分方 便。
[0020] 本发明的目的在于提供一种检测盆腔脱垂的基因检测试剂盒，所述试剂盒检测基 因STAC2,采用特异的上游引物和下游引物，上游引物序列为SEQ IDN0.1，下游引物序列为 SEQ IDN0.2。
[0021] 进一步，该PCR试剂盒适合于目前存在市场上的所有类型荧光定量基因扩增仪， 灵敏度高，定量快速准确、稳定性好，具有良好的应用前景。
[0022] 进一步，上述荧光定量PCR试剂盒组分包括：特异性引物、内参引物、荧光定量PCR 反应液。所述内参为GAPDH。
[0023] 所述的试剂盒还包含RNA抽提试剂。
[0024] 本发明还检测了本试剂盒灵敏性，结果显示本试剂盒检测范围为106-102c〇pieS/ y1，最小检出浓度为lOOcopies/ y1。
[0025] 本发明目的是提供了一种盆腔脱垂蛋白检测试剂盒，所述的检测试剂盒检测 STAC2蛋白。进一步的，所述的试剂盒还包括其他检测试剂。
[0026] 本发明目的是提供了一种检测盆腔脱垂的基因芯片，所述的基因芯片包括与 STAC2基因的核酸序列杂交的探针。
【附图说明】
[0027] 图1宫骶韧带成纤维细胞的生长曲线
【具体实施方式】
[0028] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，仅用于解释本发明，而不能理解为对本 发明的限制。本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可 以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限 定。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照厂商所建议的条 件实施检测。
[0029] 实施例1病例的收集
[0030] 取2012年9月到2013年12月期间在协和医院妇产科就诊的POP患者，共收集9 例，对照来源于同时期妇产科住院的其他妇科疾病（除癌症患者）患者以及体检人群，以 年龄、居住地为匹配因素，收集共3例。获取所有研究对象的子宫骶韧带组织样本，编号后 置-80°C低温冰箱保存。
[0031] POP组入选标准：a.经妇科检查后P0P-Q评分彡II度；
[0032] b.连续居住北京地区；
[0033] c?至少一次分娩史。
[0034] 排除标准：a.近3个月行激素替代治疗患者；
[0035] b?结缔组织疾病患者（风湿性关节炎、系统性红斑
[0036] 狼疮、多发性肌炎、马方综合征、爱唐综合征）；
[0037] c?妊娠患者；
[0038] d?患者拒绝加入；
[0039] e.恶性肿瘤患者。
[0040] 对照组入选标准：a. P0P-Q评分< I度；
[0041] b?至少一次分娩史；
[0042] c?年龄、居住地与病例组匹配
[0043] d?无 POP 病史。
[0044