] 排除标准：同POP组
[0045] 盆腔器官脱垂定量分期法（Pelvic Organ Prolapse Quantitation，P0P-Q):利用 阴道顶端、阴道前后壁上的2个解剖指示点与处女膜的关系来界定盆腔器官的脱垂程度， 分为0-IV度。检查时所有患者取截石位，并做最大Valsalva动作。
[0046] 0度表示没有脱垂；
[0047]I度表示脱垂最远端在处女膜内，距离处女膜>1cm处；
[0048] II度表示脱垂最远端在处女膜边缘的1cm内，不论内外；
[0049] III度表示脱垂最远端在处女膜外，距离处女膜边缘> 1cm，但小于（阴道总长 度-2cm);
[0050] IV度表示阴道完全或几乎完全脱垂，脱垂最远端多（阴道总长度-2cm)。
[0051] 实施例2高通量测序及分析
[0052] 对组织进行RNA提取，RNA提取后琼脂糖凝胶电泳，从电泳结果可以初步判定提取 的RNA样品质量合格与否，是否可以用于进一步的转录组分析。进而通过NanoDroplOOO分 光光度计检测RNA样品的提取情况，RNA-seq测序的样品要求：0D260/0D280为1. 8-2. 2。
[0053] 测序平台为Illumina公司的HiSeq 2500高通量测序平台，进行高通量转录 组深度测序，测序后我们运用 Fast-QC (http: //www. bio informatics, babraham. ac. uk/ projects/fastqc/)软件对测序数据的质量进行整体评估，包括碱基的质量值分布，质量值 的位置分布，GC含量，PCR duplication含量，kmer的frequency等。在差异基因表达分析 时，根据得到的FPKM值，采用国际公认算法EBSeq进行差异筛选。其中，筛选时，L0G2FO1 或〈-1，FDR〈0. 05。为了更好的理解差异表达基因的功能，我们对差异表达基因进行了 Gene Onlogy和信号通路分析，并对差异表达基因进行功能注释和蛋白质互相作用网络分析，鉴 于以上数据分析的结果，结合文献我们筛选了差异表达基因STAC2。
[0054] 实施例3盆腔脱垂患者及对照的宫骶韧带组织STAC2基因表达情况
[0055] 一、材料和方法
[0056]1、材料
[0057] 选取35例盆腔脱垂患者宫骶韧带组织及5例对照宫骶韧带组织，对其进行分组及 编号。对照组为开腹或阴式子宫全切除术的妇科良性疾病患者，经阴道检查排除盆腔器官 脱垂，无尿失禁症状。35例盆腔脱垂患者中17例为II度、8例III度、10例为IV度。
[0058]2、方法
[0059] 2. 1盆腔脱垂患者及对照的宫骶韧带组织总RNA的提取
[0060] 米用 TRteol# Reagent (invitrogen，货号 15596-018)进行样本 RNA 提取，实验操 作按产品说明书进行，具体操作如下：
[0061] 收集样本后冻存于液氮，取出后把组织放入已预冷的研钵中进行研磨，待组织样 本成粉末状后：
[0062] ①加入Trizol，室温保存5分钟；
[0063] ②加氯仿〇? 2ml，用力振荡尚心管，充分混勾，室温下放置5分钟-10分钟；
[0064] ③12000rpm高速离心15分钟后吸取上层水相（吸70% )到另一新离心管管中， 注意不要吸到两层水相之间的蛋白物质。移入新管，加入等体积的-20°C预冷异丙醇，充 分颠倒混匀，置于冰上10分钟；
[0065] ④12000rpm高速离15分钟后小心弃掉上清液，按I ml/ml Trizol的比例加入 75% DEPC乙醇洗漆沉淀（4°C保存），洗漆沉淀物，振荡混合，4°C下12000rpm高速离心5分 钟；
[0066] ⑤弃去乙醇液体，室温下放置5分钟以充分晾干沉淀，加入DEPC处理过的水溶解 沉淀；
[0067] ⑥用Nan〇dr〇p2000紫外分光光度计测量RNA纯度及浓度，冻存于-70°C。RNA质 量判定标准：RNA样本的0D260/0D280值为1. 7-2. 2之间；总RNA电泳图谱有清晰的28S、 18S条带；70°C水浴保温1小时后的电泳图谱与水浴保温前的图谱无明显差异。
[0068] 2. 2逆转录合成cDNA
[0069] 米用 Superscript? niReverse Transcriptase (invitrogen，货号18〇8〇-〇44)进 行cDNA反转录，实验操作按产品说明书进行，具体操作如下：
[0070] 使用逆转录试剂盒，用逆转录缓冲液对1 y g总RNA进行逆反录合成cDNA。采用 25 y 1反应体系，每个样品取1 y g总RNA作为模板RNA，在PCR管中分别加入以下组分：
[0071] 5X 逆转录缓冲液 5 y 1，10mmol/l dNTP 1. 25 y 1，0. lmmol/1 DIT 2. 5 y 1， 30ymmol/l OligodT 2yl，200U/yl MMLV 1.25yl，模板 RNA lyg，加入灭菌水至总体系 25 y 1。42°C孵育1小时，72°C 10分钟，短暂离心。cDNA保存放-20°C冰箱备用。
[0072] 2. 3Real-Time PCR
[0073] 2. 3. 1仪器及分析方法
[0074] 用ABI 7500型荧光定量PCR仪，采用2-A ACT法进行数据的相对定量分析。
[0075] 2. 3. 2引物设计
[0076]采用在线引物设计软件，基因序列参照NCBI:NM_198993. 3 (STAC2)，内参选 GAPDH，引物设计后由invitrogen公司合成。具体引物序列如下：
[0077] 表1引物序列
[0078]
[0079] 操作过程如下：
[0080] ( 一）反应体系：用 Power Green PCR Master Mix(invitrogen，货号 4367659)进行扩增，实验操作按产品说明书进行。扩增程序为：95° 5min，（95°C15sec， 6(TC 45sec) X40 个循环。
[0081] 表2 RealTime反应体系
[0082]
[0083](二）引物筛选
[0084] 将各样本cDNA混合后，以此为模板进行5倍梯度稀释，稀释后样品各取2 y 1作模 板，分别用目的基因引物和内参基因引物进行扩增，同时在60_95°C进行融解曲线分析，根 据扩增效率高和溶解曲线单峰原则进行引物筛选。
[0085] (三）样品 RealTimePCR 检测
[0086] 将各样品cDNA 10倍稀释后取2 y 1作模板，分别用目的基因引物和内参基因引物 进行扩增。同时在60_95°C进行溶解曲线分析。
[0087] 二、实验结果
[0088] 实时定量PCR扩增曲线拐点清楚，扩增曲线整体平行性好，表明各反应管的扩增 效率相近，极限平而无上扬现在，曲线指数期斜率较大，说明扩增效率较高；样本扩增产物 溶解曲线都是单峰，说明扩增产物只有一条，为特异性扩增；根据qRT-PCR的相对定量公 式：2_ A Ct X 100%，比较STAC2基因在盆腔脱垂组织和对照组织中的表达水平。结果显示： qRT-PCR扩增结果稳定，其中STAC2基因在盆腔脱垂组织中的表达水平低于对照组织3倍 多，以上结果验证了高通量转录组表达数据的整合分析STAC2基因在盆腔脱垂患者中低表 达的结果。
[0089] 实施例4宫骶韧带成纤维细胞的原代培养、纯化、传代
[0090] 一、细胞的原代培养
[0091] (1)将组织标本放平皿中，PBS冲洗3遍，眼科剪剪碎；
[0092] (2)37°C 5%二氧化碳孵箱中，1% I型胶原酶1ml消化剪碎组织2h;
[0093] (3)将含有细胞的消化液转入无菌15ml离心管，离心，40C，1500rpm，5min;
[0094] (4)弃上清液后，将离心管底部含有细胞的悬液用吸管吹匀后转移到25cm 2培养 瓶，静止0. 5h后加入含15%胎牛血清（FBS)的M199培养基5ml，放入37°C 5%二氧化碳孵 箱中进行原代细胞培养，次日更换培养基；
[0095](5)每隔3d换液一次：弃旧培养基，PBS冲洗1遍，加入含15% FBS的M199新鲜 培养基5ml ;
[0096] (6)常规倒置显微镜下观察细胞的形态及生长情况；
[0097] (7)当生长的细胞铺满瓶底70% -80%时，采用差时贴壁法对培养出的宫骶韧带 细胞进行纯化。
[0098] 二、细胞的纯化
[0099] (1)在超净台上，将原培养基弃去，用PBS 2ml洗两次，弃去，加入0. 25 % Trypsin-0. 02% EDTA lml，37°C 5%二氧化碳孵箱中消化 1-2 分钟；
[0100] (2)在常规倒置显微镜下观察，出现大部分细胞变圆变悬浮后，加入1ml的含15% FBS的M199培养基，轻轻摇晃以中和0. 25% Trypsin-0. 02% EDTA ;
[0101] (3)将混合液吸至无菌的15ml离心管中，1500rpm，4°C离心5min，弃上清，加入含 15% FBS的M199培养基3ml，用吸管轻轻吹打，混匀细胞后，接种于新的25cm2培养瓶中， 放入37°C 5%二氧化碳孵箱中0. 5h，后弃培养基，贴壁快的细胞（成纤维细胞）留在瓶壁 上，贴壁慢的细胞（平滑肌细胞）随着培养基被弃掉，再加入新的培养基放入孵箱中继续培 养；
[0102] (4)每隔3d换液一次：弃旧培养基，PBS冲洗1遍，加入含15% FBS的M199新鲜 培养基5ml ;
[01