03] (5)当生长的细胞铺满瓶底70% -80%时，采用差时贴壁法按照上述步骤对培养 出的宫骶韧带细胞再次进行纯化；
[0104] (6)第二次纯化后的细胞用含15% FBS的M199培养基进行培养，当纯化后细胞铺 满瓶底70 % -80 %时，进行传代培养。
[0105] 三、细胞传代培养
[0106] (1)在超净台上，将原培养基弃去，用PBS 2ml洗两次，弃去，加入0.25 % Trypsin-0. 02% EDTA lml，37°C 5%二氧化碳孵箱中消化 1-2 分钟；
[0107] (2)在常规倒置显微镜下观察，出现胞质回缩，细胞间隙增大，大部分细胞变圆变 悬浮后，加入lml的含15% FBS的M199培养基，轻轻摇晃以中和0. 25% Trypsin-0. 02% EDTA ；
[0108] (3)将混合液吸至无菌的15ml离心管中，1500rpm，4°C，离心5min，弃上清，加入含 15% FBS的M199培养基2ml，用吸管轻轻吹打，混匀细胞后，按1:2或1:3接种与新的25cm2 培养瓶中，放入37 °C 5 %二氧化碳孵箱，次日更换培养基；
[0109] (4)当细胞长满瓶壁后，同法将细胞传入新培养瓶，3-8代的细胞用于本实验。
[0110] 实施例含STAC2表达载体的构建及对宫骶韧带成纤维细胞的影响
[0111] 一、材料
[0112] (一）细胞来源
[0113] 实施例4培养的宫骶韧带成纤维细胞。
[0114] (二）真核表达载体构建与合成
[0115] 含STAC2基因的真核表达载体的构建委托生行生物公司，公司提供含有STAC2基 因的质粒。
[0116] 二、实验方法
[0117] (一）含STAC2基因的真核表达载体的转染
[0118] 1、细胞分组及转染
[0119] (1)细胞分组
[0120] C组：空白对照组；C1组：转染脂质体组；C2组：转染空载体组；S组：转染含STAC2 基因的真核表达载体组。
[0121] (2)转染
[0122] 按照 Lipofectamine?2000 Transfection Reagent 提供的步骤进行。
[0123] 2、转染效率的验证
[0124] (1)荧光倒置显微镜下观察细胞形态和转染情况
[0125] 转染24h后，将培养板置于荧光倒置显微镜下观察细胞形态及生长状态，绿色荧 光下观察转染情况。
[0126] (2)应用Real-time PCR方法检测转染前后STAC2基因表达的变化
[0127] ①标准曲线的构建：选取在50ml培养瓶中正常培养的宫骶韧带成纤维细胞1瓶， 提取RNA，测定RNA浓度和纯度，进行逆转录反应，将反应生成的DNA模板十倍稀释，得到相 当于10 4-10°copies/ul的DNA模板，分别加入STAC2基因引物和内参引物，配制25ul反应 体系，使用Real-time PCR扩增仪，进行PCR扩增反应。得到STAC2和内参的标准曲线。
[0128] ②Real-time PCR方法检测转染前后STAC2基因表达的变化：提取各组细胞 的RNA，测定RNA浓度和纯度，进行逆转录反应，每组DNA模板同时进行STAC2和内参的 Real-time PCR反应，实验重复三次。
[0129] ③对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳。
[0130] 三、实验结果
[0131] 结果显示构建的含STAC2基因真核表达载体增加了宫骶韧带成纤维细胞中STAC2 基因表达。
[0132] 实施例6MTT法检测宫骶韧带成纤维细胞的生长曲线：
[0133] 一、实验分组
[0134] 对照组：为开腹或阴式子宫全切除术的妇科良性疾病患者，经阴道检查排除盆腔 器官脱垂，无尿失禁症状；宫骶韧带取自韧带与宫颈连接处以外〇. 5-1. 0cm处，按照实施例 4所述的方法做宫骶韧带细胞培养，传代培养第4-6代；
[0135] POP组：由资深临床医师按照P0P-Q法判定脱垂度在P0P-QII度的患者；宫骶韧带 取自韧带与宫颈连接处以外〇. 5-1. 0cm处，按照实施例4所述的方法做宫骶韧带细胞培养， 传代培养第4-6代；
[0136] POP过表达组：由资深临床医师按照P0P-Q法判定脱垂度在P0P-QII度的患者；宫 骶韧带取自韧带与宫颈连接处以外0. 5-1. 0cm处，按照实施例4所述的方法做宫骶韧带细 胞培养，传代培养第4-6代，按照实施例5所述的方法转染表达载体；
[0137] POP空载体对照组：由资深临床医师按照P0P-Q法判定脱垂度在P0P-QII度的患 者；宫骶韧带取自韧带与宫颈连接处以外〇. 5-1. 0cm处，按照实施例4所述的方法做宫骶韧 带细胞培养，传代培养第4-6代，按照实施例5所述的方法转染空载体；
[0138] 二、MTT法实验步骤
[0139] (1)取上述各组细胞，细胞密度为80% -90 %的宫骶韧带成纤维细胞，用0.25% Trysin-0. 02% EDTA消化，含10%胎牛血清（FBS)的M199培养基lml终止消化。离心后， 用细胞计数板计数，调整细胞密度为5X 104/ml，取吹打均匀的细胞悬液，每孔200ul，种至 96孔板，用含10% FBS的M199培养基置于37°C 5%二氧化碳温箱中培养；
[0140] (2)种板后第二天，弃培养基，每孔加入20ulMTT溶液（5mg/ml，即0. 5% MTT)继续 培养4h ;
[0141] ⑶MTT加入培养4h后，Formazan结晶可充分形成，将上清轻轻弃掉，避免不要将 Formazan结晶移走；
[0142] (4)每孔加入150ul二甲基亚飒（DMS0)，置摇床上低速振荡lOmin，使结晶物充分 溶解。在酶联免疫检测仪〇D490nm处测量各孔的吸光值（A)，并求其各组相应的平均吸光 值；
[0143] (5)分别于种板后第二天、第四天、第六天、第八天、第十天、第十二天测相应的A 值，并求其平均值；
[0144] (6)以时间为X轴，吸光值为Y轴作图，分别绘制各组宫骶韧带成纤维细胞的生长 曲线。
[0145] 三、实验结果
[0146] 用四唑盐（MTT)比色法测定成纤维细胞的生长曲线，96孔板最佳，接种细胞数为 1X10 4个/孔。酶标仪所测的490nm处的吸光度即A值见表3。结果显示：在相同时间内， POP组和对照组、POP组和POP空载体对照组、POP过表达组对照和对照组的A值差异显著， 有统计学意义（P〈〇. 01)，具体见图1。结果表明POP组细胞的生长增殖活性小于对照组，POP 过表达组细胞的生长增殖活性较POP组有了明显提高，差异具有统计学意义（P〈〇. 01)。
[0147] 表3宫骶韧带成纤维细胞的吸光度A (X 土 S)
[0148]
[0149] 本发明采用高通量测序筛选出盆腔脱垂相关基因STAC2,结合分子生物学实验证 实了 STAC2是盆腔脱垂诊断标志物。进一步的细胞生物学实验表明，STAC2基因影响宫骶 韧带成纤维细胞的生长增殖活性。
【主权项】
1. 一种分子标志物在制备盆腔脱垂诊断制剂中的应用，其特征在于，所述分子标志物 为STAC2基因和/或基因的表达产物。2. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的分子标志物在盆腔脱垂组织中低 表达。3. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的盆腔脱垂的诊断制剂采用荧光定 量PCR试剂盒、基因芯片检测盆腔脱垂组织中STAC2基因的表达，优选的，所述的荧光定量 PCR试剂盒中含有一对特异性扩增STAC2基因的引物；所述的基因芯片中包括与STAC2基 因的核酸序列杂交的探针。4. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的盆腔脱垂的诊断制剂采用免疫方 法检测盆腔脱垂组织中STAC2基因的表达产物，优选的，所述免疫方法为ELISA检测和/胶 体金检测。5. -种分子标志物在制备盆腔脱垂治疗制剂中的应用，其特征在于，所述分子标志物 为STAC2基因和/或基因的表达产物。6. 根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述盆腔脱垂治疗制剂促进分子标志物 的转录和/或表达。7. 根据权利要求6所述的应用，其特征在于，采用下述方法中的一种和/或几种促进分 子标志物的转录或表达：激活分子标志物的启动子、激活分子标志物表达的蛋白或因子、导 入促进分子标志物转录或表达的载体。8. -种盆腔脱垂抑制剂，其特征在于，所述盆腔脱垂抑制剂促进STAC2基因的转录或 表达。9. 根据权利要求1所述的盆腔脱垂抑制剂，其特征在于，所述盆腔脱垂抑制剂中含有 促进STAC2基因的转录或表达的载体和/或激活STAC2基因的启动子和/或激活STAC2基 因表达的蛋白或因子。10. -种盆腔脱垂诊断制剂，其特征在于，所述盆腔脱垂诊断制剂检测STAC2基因的转 录或表达，优选的，盆腔脱垂诊断制剂采用荧光定量PCR试剂盒、基因芯片、免疫方法检测。
【专利摘要】本发明涉及STAC2基因及其编码蛋白在抑制盆腔脱垂中的应用。发明人基于高通量测序结果筛选出下调表达的候选基因STAC2，进一步的细胞生物学实验表明，STAC2基因影响宫骶韧带成纤维细胞的生长增殖活性，可用于制备盆腔脱垂辅助诊疗制剂，具有重要的临床应用价值。
【IPC分类】A61K38/00, G01N33/577, C12Q1/68, C12N15/11, A61P15/00, A61K48/00
【公开号】CN105132547
【申请号】CN201510548493
【发明人】董琳, 杨承刚
【申请人】北京泱深生物信息技术有限公司
【公开日】2015年12月9日
【申请日】2015年8月31日