适用于选育具备红皮性状的柚子共显性rfp分子标记及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及柑橘分子育种技术领域，具体地指一种适用于选育具备红皮性状的柚 子共显性RFP分子标记及其应用，该分子标记可以作为柚子红皮分子育种标记辅助选择， 为培育遗传稳定的红皮柚子新品种提供新的分子标记。
【背景技术】
[0002] 柚子（Citrus grandis)是芸香科柑橘属水果，味道酸甜，营养价值高，含有丰富的 蛋白质、维生素及妈、磷、铁等人体必需的元素。柚子有健脾胃、润肺、助消化等功效，深受人 们喜爱。我国柚类资源丰富，现在市场上较常见的柚品种大多数都是黄色或淡黄色外果 皮，色泽单一。但红皮柚属于果皮色泽突变体，其成熟果实的表皮是红色的，红皮柚是柚资 源中罕见的在外果皮上合成和积累花青素的品种资源，使果实呈现绚丽色彩，对消费者极 具吸引力，且红色是中国文化中"吉祥"的象征，具有重要的文化内涵。对于果实品质研究 来说，色泽是果实外观品质的核心，具有重要的观赏和经济价值。
[0003] 传统的柚子品种大部分是黄色或淡黄色外果皮，因不能在果皮上积累花青素而色 泽单一，通过传统的表型选择方法将红皮这个特征导入传统柚子品种中又存在育种周期 长、效率低等缺点。现代生物技术为作物育种提供了强有力的工具，分子标记辅助选择技术 就是其中重要的一项技术，与传统表型选择相比，分子标记辅助选择可在任何生长期进行， 不受环境条件影响，可排除非等位基因相互作用而造成的干扰，具有快速、经济、效率、准确 性强等优点。在柑橘红皮育种过程中可借助分子标记对杂交后代进行直接而快速的背景选 择，缩短育种年限。
【发明内容】
[0004] 本发明所要解决的技术问题就是提供一种适用于选育具备红皮性状的柚子共显 性RFP分子标记及其应用；其为柚子红皮分子育种提供一种简单、快速和有效地辅助选育 方法。
[0005] 为解决上述技术问题，本发明提供的一种适用于选育具备红皮性状的柚子共显性 RFP分子标记，其核苷酸序列分别为SEQ ID N0 :3和SEQ ID N0 :4所示。
[0006] 本发明还提供了一种用于获得分子标记的引物对，所述引物对分别为：
[0007] 引物对RFP F/R1 (在序列表中的命名分别为SEQ ID N0 :7和SEQ ID N0 :8)
[0008] 正向引物 5, -CATTCATACAGGACTCGACTAGCTT-3'，
[0009] 反向引物 5'-TGTATGAATGGGACCTGTCTATGG-3' ；
[0010] 引物对RFP F/R2(在序列表中的命名分别为SEQ ID N0 :9和SEQ ID N0 :10)
[0011] 正向引物 5' -GGATGACGGGAGATGTTTGTTAC-3'，
[0012] 反向引物 5' -TCCTTACCTCCmTTGGACCTA-3'。
[0013] 本发明还提供了一种适用于选育具备红皮性状的柚子共显性RFP分子标记制备 方法，包括以下步骤：
[0014] 1)以红皮柚和普通柚两个基因组DNA为模板，采用引物对MYB2 F/R(在序列表中 的命名分别为SEQ ID N0 :5和SEQ ID N0 :6):
[0015] 正向引物 5' -TGGAGAGACCCACGGAAAGA-3'，
[0016] 反向引物 5' -TCTTCTTACAGTCCAGGACCCTIT-3' ；
[0017] 扩增调控花青素合成关键转录因子CgMYB2基因的启动子，得到两个DNA扩增片 段；
[0018] 2)对所述的DNA扩增片段进行克隆、测序，其中从红皮柚中扩增得到如SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列，从CK柚中扩增得到如SEQ ID N0:2所示的核苷酸序列；
[0019] PCR 反应体系如下：4yl 5XPCR buffer，0.4uL dNTPs(10mM)，0.2uL phusion hotstart酶（均购自于Thermo公司），lOOng DNA，正、反向引物各1 y L，ddH20补充至终体 积 20ul。热循环参数为：98°Clmin;98°C 30sec，60°C 30sec，72°C lmin，32 个循环；72°C 10min，l个循环；4°C保存，反应是在S1000 Thermal Cycler PCR仪上完成；
[0020] 3)将所述的SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2的核苷酸序列进行比对发现，在SEQ ID NO :1中间有一段162bp的插入突变，导致序列特异扩增区域多态性；
[0021] 4)根据SEQ ID N0 :1和SEQ ID N0 :2所示的核苷酸序列差异设计引物对RFP F/ R1 和 RFP F/R2 :
[0022] 引物对 RFP F/R1
[0023] 正向引物 5' -CATTCATACAGGACTCGACTAGCTT-3'，
[0024] 反向引物 5'-TGTATGAATGGGACCTGTCTATGG-3' ；
[0025] 引物对 RFP F/R2
[0026] 正向引物 5' -GGATGACGGGAGATGTTTGTTAC-3'，
[0027] 反向引物 5'-TCCTTACCTCCTmTGGACCTA-3' ；
[0028] 以红皮柚和普通柚两个基因组DNA为模板，采用引物对RFP F/R1和RFP F/R2进 行PCR扩增，得到如SEQ ID N0:3和SEQ ID N0:4所示核苷酸序列的能够区分红皮与普通 柑橘的共显性RFP分子标记。
[0029] 本发明还提供了一种柚子共显性RFP分子标记在辅助选择红皮柚的应用。
[0030] 本发明还提供了一种特异性引物对RFP F/R1和引物对RFP F/R2在选育红皮柚的 应用。
[0031] 本发明的有益效果在于：
[0032] 本发明成功得到红皮柚子的共显性RFP分子标记，运用该标记进行具有红皮性状 的柚子的辅助选择，可以克服传统育种中依靠表型进行选择的缺点，减少育种工作量，加快 了培育色泽新颖、营养价值高的红皮柑橘的进程。
【附图说明】
[0033] 图1、2 :引物对RFP F/R1和引物对RFP F/R2分别在红皮柚、CK柚、红夏橙等柑橘 基因组DNA的扩增结果。
[0034] 图中：H代表红皮柚；CK代表CK柚；R代表琯溪蜜柚I型；Y代表琯溪蜜柚II型； Q代表钱德勒柚；C代表橙皮柚；F代表Flame ;S代表Star Ruby ;HC代表红夏橙；HQ代表 华脐；CA代表Cara Cara ;XC代表血橙；PG代表栊柑；BD代表本地早；HL代表黄陵庙橘；SM 代表温州蜜柑；XZ代表枸橼；YLK代表尤力克柠檬；Li代表里斯本；Xi代表株檬；LM代表黎 檬；XY代表香橼；YC代表宜昌橙；JG代表金柑；DD代表代代，GT代表枸头橙；HH代表红河 大翼橙；MFG代表马蜂柑，M代表Marker (片段大小依次为250, 500, 750, 1000, 1500, 2000bp 等）。
[0035] 图3、4 :引物对RFP F/R 2在红皮柚、琯溪蜜柚及其杂交后代的基因组DNA的扩增 结果。
[0036] 图中：H代表红皮柚；G代表琯溪蜜柚；无编号的为红皮柚、琯溪蜜柚杂交后代群 体；M 代表 M