arker (片段大小依次为 250, 500, 750, 1000, 1500, 2000bp)。
【具体实施方式】
[0037] 为了更好地解释本发明，以下结合具体实施例进一步阐明本发明的主要内容，但 本发明的内容不仅仅局限于以下实施例。
[0038] 实施例1
[0039] 1、制备红皮柚、枸橼、株檬、红夏橙等柑橘的基因组DNA
[0040] 在本实施例中，采用改良的CTAB法提取红皮柚等柑橘的基因组DNA。
[0041] 2、利用本申请人开发的引物对RFP F/R1，RFP F/R2扩增分析红皮柚、枸橼、株檬、 红夏橙等上述所有柑橘的基因组DNA。
[0042] PCR 反应体系如下：2 y 1 PCR buffer，2 y 1 MgCl2,0? 4dNTPs，Taq DNA 聚合酶（均 购自于Takara公司），lOOng DNA，正、反向引物各0. 2 yM，ddH20补充至终体积20ul。热循 环参数为：95°C SminWSt： 30sec，55°C 45sec，72°C 45sec，35 个循环；72°C 10min，l 个 循环；4°C保存，反应是在S1000 Thermal Cycler PCR仪上完成。扩增产物在水平电泳槽 上1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，使用lx TAE缓冲液（0.04M Tris-acetate，0.001M EDTA， pH8. 0)，电压8V/cm，电泳30min。电泳完毕，凝胶成像系统（UVP)拍照保存。
[0043] 本发明中引物对RFP F/Rl、RFP F/R1在红皮柚的基因组DNA中扩增产物均为 250bp或500bp左右的单一亮带。在其他柑橘品种中均无250bp或500bp的目的条带（实 验结果见图1及图2)。
[0044] 实施例2红皮柚和琯溪蜜柚杂交后代的筛选鉴定
[0045] 1、制备红皮柚、琯溪蜜柚及其杂交后代群体约200株的基因组DNA
[0046] 在本实施例中，采用改良的CTAB法提取红皮柚、琯溪蜜柚及其杂交后代群体200 株的基因组DNA。
[0047] 2、利用本申请人开发的引物对RFP F/R2扩增分析红皮柚和琯溪蜜柚及其杂交后 代的基因组DNA
[0048] PCR 反应体系如下：2 y 1 PCR buffer，2 y 1 MgCl2,0? 4dNTPs，Taq DNA 聚合酶（均 购自于Takara公司），lOOng DNA，正、反向引物各0. 2 yM，ddH20补充至终体积20 y 1。热 循环参数为：95￡€51^11;951€3〇86(3,55 1€4586(3,721€4586(3,35个循环；72。(：1〇111111，1 个循环；4°C保存，反应是在S1000 Thermal Cycler PCR仪上完成。扩增产物在水平电泳 槽上1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，使用lx TAE缓冲液（0.04M Tris-acetate，0.001M EDTA， pH8. 0)，电压8V/cm，电泳30min。电泳完毕，凝胶成像系统（UVP)拍照保存。
[0049] 本发明中引物对RFP F/R2在红皮柚的基因组DNA及有红皮性状的杂交后代群体 中扩增产物均为500bp左右的单一亮带。在琯溪蜜柚及无红皮性状的杂交后代群体中均无 500bp的目的条带（实验结果见图3、4)。
[0050] 其它未详细说明的部分均为现有技术。尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描 述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经 创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。
【主权项】
1. 一种适用于选育具备红皮性状的柚子共显性RFP分子标记，其特征在于：其核苷酸 序列分别为SEQ ID NO :3和SEQ ID NO :4所示。2. 用于获得权利要求1所述分子标记的引物对，其特征在于：所述引物对分别为： 引物对RFP F/R1 正向引物 5' -CAITCATACAGGACTCGACTAGCTT-3'， 反向引物 5' -TGTATGAATGGGACCTGTCTATGG-3' ； 引物对RFP F/R2 正向引物 5' -GGATGACGGGAGATGTITGTTAC-3'， 反向引物 5' -TCCTTACCTCCmTTGGACCTA-3'。3. -种权利要求1所述适用于选育具备红皮性状的柚子共显性RFP分子标记制备方 法，其特征在于：包括以下步骤： 1) 以红皮柚和普通柚两个基因组DNA为模板，采用引物对 MYB2F/R :正向引物 5' -TGGAGAGACCCACGGAAAGA-3'， 反向引物 5' -TCTTCTTACAGTCCAGGACCCTIT-3' ； 扩增调控花青素合成关键转录因子CgMYB2基因的启动子，得到两个DNA扩增片段； 2) 对所述的DNA扩增片段进行克隆、测序，其中从红皮柚中扩增得到如SEQ ID NO :1所 示的核苷酸序列，从CK柚中扩增得到如SEQ ID N0:2所示的核苷酸序列； 3) 将所述的SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2的核苷酸序列进行比对发现，在SEQ ID NO: 1中间有一段162bp的插入突变，导致序列特异扩增区域多态性； 4) 根据SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2所示的核苷酸序列差异设计引物对RFP F/R1和 RFP F/R2 ： 引物对RFP F/R1 正向引物 5' -CAITCATACAGGACTCGACTAGCTT-3'， 反向引物 5' -TGTATGAATGGGACCTGTCTATGG-3' ； 引物对RFP F/R2 正向引物 5' -GGATGACGGGAGATGTITGTTAC-3'， 反向引物 5' -TCCTTACCTCCmTTGGACCTA-3' ； 以红皮柚和普通柚两个基因组DNA为模板，采用引物对RFP F/R1和RFP F/R2进行PCR 扩增，得到如SEQ ID NO :3和SEQ ID NO :4所示核苷酸序列的能够区分红皮与普通柑橘的 共显性RFP分子标记。4. 权利要求1所述的分子标记在辅助选择红皮柚的应用。5. 权利要求2所述的特异性引物对RFP F/R1和引物对RFP F/R2在选育红皮柚的应 用。
【专利摘要】本发明属于柑橘分子育种技术领域，具体涉及一种适用于选育具备红皮性状的柚子共显性RFP分子标记及其应用。我国柚子绝大多数品种的果皮为浅黄色，色泽单一，色泽新颖品种对消费者更具吸引力。本发明从特色材料红皮柚入手，利用引物对MYB2F/R扩增红皮柚和普通柚调控花青素合成关键转录因子CgMYB2基因的启动子，得到两个DNA片段，然后对所述的DNA多态性区域进行PCR扩增、克隆、测序，得到的两个核苷酸序列进行比对发现：二者有一段162bp的插入突变，导致序列特异扩增区域多态性；根据二者的核苷酸序列差异设计引物对RFP？F/R1、RFP？F/R2进行PCR扩增，得到了能够区分红皮与普通柚子(浅黄色)的共显性RFP分子标记。本发明还公开了制备所述分子标记的方法及应用。
【IPC分类】C12Q1/68, C12N15/11
【公开号】CN105132537
【申请号】CN201510486356
【发明人】徐强, 黄鼎, 温少华, 邓秀新
【申请人】华中农业大学
【公开日】2015年12月9日
【申请日】2015年8月10日