检测黄连分子标记多态性的物质在鉴定或辅助鉴定黄连属植物中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域中检测黄连分子标记多态性的物质在鉴定或辅助鉴定 黄连属植物中的应用。
【背景技术】
[0002] 黄连是我国传统医学广泛使用的一种中药材，全世界黄连属（Coptis)植物有16 种，其中我国有6种类，分别为黄连、三角叶黄连、云南黄连、峨嵋黄连、五裂黄连和五叶黄 连。作为多基源的中药材，药典上规定来源黄连、三角叶黄连和云南黄连的干燥根茎为正 品，上述3种黄连的商品名分别为"味连"、"雅连"和"云连"。由于生长周期较长，价格较高， 市场上常见以单叶升麻的根茎和酸模的根伪充黄连使用；此外，黄连伪品还有定木香、滇豆 根、山黄连、岩黄连、箭叶淫羊藿、铁破锣、马尾黄连和峨嵋黄连等等。黄连真品与伪品的化 学成分、功效、主治等有很大差异，因此开发一种系统全面的黄连真品和伪品的鉴定方法具 有重要意义。
[0003]目前，黄连真伪品的鉴定大多利用形态和化学手段进行，具有通量低、成本高和重 复性差的缺点。主要方法有组织学鉴定方法、红外鉴定方法、核磁共振氢谱法和高效液相色 谱法等。组织学鉴定方法需要做大量的切片和显微观察，通量低、耗费大量的人力和物力， 同时具有不准确性；红外鉴定方法、核磁共振氢谱法和高效液相色谱法都需要提取样品的 药效成分，同样具有通量低和耗费大的缺点；此外，由于黄连有效成分受环境因素的影响， 不同产地黄连的有效成分含量和比例可能存在极大的差异，因此这种以测定有效成分为基 础的鉴定方法同样具有不可靠性和不准确性。针对于饮片或粉碎后的黄连药材，上述鉴定 方法非常困难，甚至无法鉴定。
[0004] DNA分子标记（DNA molecular markers)是以个体间遗传物质内核苷酸序列变异 为基础的遗传标记，是DNA水平遗传多态性的直接反映。
[0005]目前还没有一个系统详尽的鉴定黄连属植物的分子标记方法。利用真核生物rDNA 的内部转录间隔区2(internal transcribed spacer 2, ITS2)序列，孙涛等研究了不同黄 连属植物间的进化关系，同时利用黄连属植物间ITS2序列位点的差异作为一个鉴定黄连 真品和伪品的分子标记（孙涛等，2013)。但由于ITS2序列在同一个黄连属植物间的保守 性，导致该序列不能有来区分不同的黄连亚种。
【发明内容】
[0006] 本发明所要解决的技术问题是如何鉴定不同的黄连属植物。
[0007] 为解决上述技术问题，本发明首先提供了下述1)或2)或3)的应用：
[0008] 1)黄连分子标记或所述黄连分子标记的多态性在鉴定或辅助鉴定黄连属植物中 的应用；
[0009] 2)检测所述黄连分子标记的多态性的物质在鉴定或辅助鉴定黄连属植物中的应 用；
[0010] 3)检测所述黄连分子标记的多态性的物质在制备鉴定或辅助鉴定黄连属植物的 产品中的应用；
[0011] 所述黄连分子标记，为下述A1-A4 :
[0012] A1、以黄连属植物的基因组DNA为模板，采用引物对037A4进行扩增得到的DNA分 子；
[0013] 所述引物对037A4由与SEQ ID No. 1的第430位上游特异结合的单链DNA和与 SEQ ID No. 1的第440位下游特异结合的单链DNA组成；
[0014] A2、以黄连属植物的基因组DNA为模板，采用引物对034H11进行扩增得到的DNA 分子；
[0015] 所述引物对034H11由与SEQ ID No. 2的第154位上游特异结合的单链DNA和与 SEQ ID No. 2的第368位下游特异结合的单链DNA组成；
[0016] A3、以黄连属植物的基因组DNA为模板，采用引物对006G4进行扩增得到的DNA分 子；
[0017] 所述引物对006G4由与SEQ ID No. 3的第31位上游特异结合的单链DNA和与SEQ ID No. 3的第350位下游特异结合的单链DNA组成；
[0018] A4、以黄连属植物的基因组DNA为模板，采用引物对008H3进行扩增得到的DNA分 子；
[0019] 所述引物对008H3由与SEQ ID No. 4的第120位上游特异结合的单链DNA和与 SEQ ID No. 4的第240位下游特异结合的单链DNA组成。
[0020] 上述应用中，所述SEQ ID No. 1的第430位上游可为与SEQ ID No. 1第430位对 应的黄连属植物基因组DNA中那位核苷酸的上游；
[0021] 所述SEQIDNo.1的第440位下游可为与SEQIDNo.1第440位对应的黄连属植 物基因组DNA中那位核苷酸的下游；
[0022] 所述SEQ ID No. 2的第154位上游可为与SEQ ID No. 2第154位对应的黄连属植 物基因组DNA中那位核苷酸的上游；
[0023] 所述SEQIDNo. 2的第368位下游可为与SEQIDNo. 2第368位对应的黄连属植 物基因组DNA中那位核苷酸的下游；
[0024] 所述SEQIDNo. 3的第31位上游可为与SEQIDNo. 3第31位对应的黄连属植物 基因组DNA中那位核苷酸的上游；
[0025] 所述SEQ ID No. 3的第350位下游可为与SEQ ID No. 3第350位对应的黄连属植 物基因组DNA中那位核苷酸的下游；
[0026] 所述SEQ ID No. 4的第120位上游可为与SEQ ID No. 4第120位对应的黄连属植 物基因组DNA中那位核苷酸的上游；
[0027] 所述SEQIDNo. 4的第240位下游可为与SEQIDNo. 4第240位对应的黄连属植 物基因组DNA中那位核苷酸的下游。
[0028] 上述应用中，所述扩增可为PCR扩增。
[0029] 上述应用中，所述A1的多态性可为下述A11-A13:
[0030] All为对应于SEQ ID No. 1第433-435位所述A1的核苷酸为GTA或TCC，将该分 子标记命名为037A4-1;
[0031] A12为对应于SEQ ID No. 1的第438-440位所述A1的核苷酸为TCC或GTA，将该 分子标记命名为037A4-2;
[0032] A13为对应于SEQ ID No. 1的第430-440位间所述A1的同源染色体相比较有或无 核苷酸的替换，将该分子标记命名为037A4-3;
[0033] 所述A2的多态性可为下述A21-A24:
[0034] A21为对应于SEQ ID No. 2的第154位所述A2的核苷酸为G或A，将该分子标记 命名为034H11-1;
[0035] A22为对应于SEQ ID No. 2的第285位和第286位间所述A2有或无核苷酸的插 入，将该分子标记命名为034H11-2;
[0036] A23为对应于SEQ ID No. 2的第359-360位所述A2的核苷酸为CC或TT，将该分 子标记命名为034H11-3;
[0037] A24为对应于SEQ ID No. 2的第320-330位间所述A2有或无核苷酸插入和/或删 除，造成同源染色体对应核苷酸区段长度不同或相同，将该分子标记命名为034H11-4;
[0038] 所述A3的多态性可为下述A31-A35:
[0039] A31为对应于SEQ ID No. 3的第254位所述A3的核苷酸为G或A，将该分子标记 命名为006G4-1;
[0040] A32为对应于SEQ ID No. 3的第286位所述A3的核苷酸为C或T，将该分子标记 命名为006G4-2;
[0041] A33为对应于SEQ ID No. 3的第225-245位间所述A3有或无核苷酸插入和/或删 除，造成同源染色体对应核苷酸区段长度不同或相同，将该分子标记命名为006G4-3;
[0042] A34为对应于SEQ ID No. 3的第325-345位间所述A3有或无核苷酸插入和/或删 除，造成同源染色体对应核苷酸区段长度不同或相同，将该分子标记命名为006G4-4;
[0043] A35为对应于SEQ ID No. 3的第31-50位间所述A3有或无核苷酸插入和/或删 除，造成同源染色体对应核苷酸区段长度不同或相同，将该分子标记命名为006G4-5;
[0044] 所述A4的多态性可为下述A41-A43:
[0045] A41为对应于SEQ ID No. 4的第126位所述A4的核苷酸为A或G，将该分子标记 命名为008H3-1;
[0046] A42为对应于SEQ ID No. 4的第130-150位间所述A4有或无核苷酸插入和/或删 除，造成同源染色体对应核苷酸区段长度不同或相同，将该分子标记命名为008H3-2;
[0047] A43为对应于SEQ ID No. 4的第220-240位间所述A4有或无核苷酸插入和/或删 除，造成同源染色体对应核苷酸区段长度不同或相同，将该分子标记命名为008H3-3。
[0048] 上述应用中，所述引物对037A4可为由SEQIDNo. 1的第17-40位所示的单链DNA 和与SEQIDNo. 1的第519-538位反向互补的单链DNA组成的引物对；
[0049] 所述引物对034H11可为由SEQ ID No. 2的第15-36位所示的单链DNA和与SEQ ID No. 2的第557-576位反向互补的单链DNA组成的引物对；
[0050] 所述引物对006G4可为由SEQ ID No. 3的第9-30位所示的单链DNA和与SEQ ID No. 3的第776-795位反向互补的单链DNA组成的引物对；
[0051] 所述引物对008H3可为由SEQ ID No. 4的第10-32位所示的单链DNA和与SEQ ID No. 4的第573-595位反向互补的单链DNA组成的引物对。
[0052] 为解决上述技术问题，本发明还提供了所述黄连分子标记。
[0053] 为解决上述技术问题，本发明还提供了检测所述黄连分子标记多态性的物质。
[0054] 本发明所提供的检测所述黄连分子标记多态性的物质，为所述引物对037A4、所述 引物对034H11、所述引物对006G4和/或所述引物对008H3。
[0055] 为解决上述技术问题，本发明还提供了鉴定或辅助鉴定黄连属植物的产品。