3-3。
[0134] 对不同黄连属植物的008H3-U008H3-2和008H3-3进行0/1分型：将008H3-1为 A时定义为1，将008H3-1为G时定义为0 ;对于008H3-2,将PCR扩增产物对应于SEQ ID No. 4的第130-150位核苷酸同源染色体对应片段长度相同时定义为1，将PCR扩增产物对 应于SEQ ID No. 4的第130-150位核苷酸同源染色体对应片段长度不同时定义为0 ;对于 008H3-3,将PCR扩增产物对应于SEQ ID No. 4的第220-240位核苷酸同源染色体对应片段 长度相同时定义为1，将PCR扩增产物对应于SEQ ID No. 4的第220-240位核苷酸同源染色 体对应片段长度不同时定义为0,各黄连属植物的黄连分子标记008H3多态性的0/1分型结 果如表2、表3和表4所不。
[0135] 测序结果显示，当008H3-2为1时，PCR扩增产物对应于SEQ ID No. 4的第130-150 位核苷酸的测序结果无双峰，当008H3-2为0时，PCR扩增产物对应于SEQ ID No. 4的第 130-150位核苷酸的测序结果有双峰；当008H3-2为1时，PCR扩增产物对应于SEQ ID No. 4 的第220-240位核苷酸的测序结果无双峰，当008H3-2为0时，PCR扩增产物对应于SEQ ID No. 4的第220-240位核苷酸的测序结果有双峰。
[0136] 表2、不同黄连属植物分子标记的0/1分型
[0137]
[0138] 表3、不同黄连属植物分子标记的0/1分型
[0139]
[0140]
[0141] 表4、不同黄连属植物分子标记的0/1分型
[0142]
[0143] 3.差异位点的聚类分析和黄连属植物分类
[0144] 根据步骤2的不同黄连属植物的037A4-1、037A4-2、037A4-3、034H11-1、 034H11-2、034H11-3、034H11-4、006G4-1、006G4-2、006G4-3、006G4-4、006G4-5、008H3-1、 008H3-2和008H3-3的0/1分型结果，利用软件NTsys-pc2. 1进行聚类分析，算法为UPGMA， 结果如图9所不。
[0145] 按照聚类分析结果，可将这25种黄连属植物分成5大类，一类为黄连，一类为峨眉 黄连，一类为云南黄连，一类为短萼黄连，一类为三角叶黄连。结果表明，黄连属植物中相 同种聚为一类，黄连属植物中不同种不聚为一类，且种之间无交叉现象，说明〇37A4、006G4、 008H3和034H11这4个分子标记能够用来区分不同的黄连属植物。
【主权项】
1. 黄连分子标记或所述黄连分子标记的多态性在鉴定或辅助鉴定黄连属植物中的应 用； 所述黄连分子标记，为下述A1-A4 : Al、以黄连属植物的基因组DNA为模板，采用引物对037A4进行扩增得到的DNA分子； 所述引物对037A4由与SEQ ID No. 1的第430位上游特异结合的单链DNA和与SEQ ID No. 1的第440位下游特异结合的单链DNA组成； A2、以黄连属植物的基因组DNA为模板，采用引物对034H11进行扩增得到的DNA分子； 所述引物对034H11由与SEQ ID No. 2的第154位上游特异结合的单链DNA和与SEQ ID No. 2的第368位下游特异结合的单链DNA组成； A3、以黄连属植物的基因组DNA为模板，采用引物对006G4进行扩增得到的DNA分子； 所述引物对006G4由与SEQ ID No. 3的第31位上游特异结合的单链DNA和与SEQ ID No. 3的第350位下游特异结合的单链DNA组成； A4、以黄连属植物的基因组DNA为模板，采用引物对008H3进行扩增得到的DNA分子； 所述引物对008H3由与SEQ ID No. 4的第120位上游特异结合的单链DNA和与SEQ ID No. 4的第240位下游特异结合的单链DNA组成。2. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述扩增为PCR扩增； 和/或， 所述Al的多态性为下述A11-A13 : All为对应于SEQ ID No. 1第433-435位所述Al的核苷酸为GTA或TCC ; A12为对应于SEQ ID No. 1的第438-440位所述Al的核苷酸为TCC或GTA ; A13为对应于SEQ ID No. 1的第430-440位间所述Al的同源染色体比较有或无核苷酸 的替换； 所述A2的多态性为下述A21-A24 : A21为对应于SEQ ID No. 2的第154位所述A2的核苷酸为G或A ; A22为对应于SEQ ID No. 2的第285位和第286位间所述A2有或无核苷酸的插入； A23为对应于SEQ ID No. 2的第359-360位所述A2的核苷酸为CC或TT ; A24为对应于SEQ ID No. 2的第320-330位间所述A2有或无核苷酸插入和/或删除， 造成同源染色体对应核苷酸区段长度不同或相同； 所述A3的多态性可为下述A31-A35 : A31为对应于SEQ ID No. 3的第254位所述A3的核苷酸为G或A ; A32为对应于SEQ ID No. 3的第286位所述A3的核苷酸为C或T ; A33为对应于SEQ ID No. 3的第225-245位间所述A3有或无核苷酸插入和/或删除， 造成同源染色体对应核苷酸区段长度不同或相同； A34为对应于SEQ ID No. 3的第325-345位间所述A3有或无核苷酸插入和/或删除， 造成同源染色体对应核苷酸区段长度不同或相同； A35为对应于SEQ ID No. 3的第31-50位间所述A3有或无核苷酸插入和/或删除，造 成同源染色体对应核苷酸区段长度不同或相同； 所述A4的多态性可为下述A41-A43 : A41为对应于SEQ ID No. 4的第126位所述A4的核苷酸为A或G ; A42为对应于SEQ ID No. 4的第130-150位间所述A4有或无核苷酸插入和/或删除， 造成同源染色体对应核苷酸区段长度不同或相同； A43为对应于SEQ ID No. 4的第220-240位间所述A4有或无核苷酸插入和/或删除， 造成同源染色体对应核苷酸区段长度不同或相同。3. 检测权利要求1或2所述黄连分子标记的多态性的物质在鉴定或辅助鉴定黄连属植 物属植物中的应用。4. 检测权利要求1或2所述黄连分子标记的多态性的物质在制备鉴定或辅助鉴定黄连 属植物的产品中的应用。5. 根据权利要求1-4中任一所述的应用，其特征在于： 所述引物对037A4为由SEQ ID No. 1的第17-40位所示的单链DNA和与SEQ ID No. 1 的第519-538位反向互补的单链DNA组成的引物对； 所述引物对034H11为由SEQ ID No. 2的第15-36位所示的单链DNA和与SEQ ID No. 2 的第557-576位反向互补的单链DNA组成的引物对； 所述引物对006G4为由SEQ ID No. 3的第9-30位所示的单链DNA和与SEQ ID No. 3 的第776-795位反向互补的单链DNA组成的引物对； 所述引物对008H3为由SEQ ID No. 4的第10-32位所示的单链DNA和与SEQ ID No. 4 的第573-595位反向互补的单链DNA组成的引物对。6. 权利要求1_5中任一所述黄连分子标记。7. 检测权利要求1-5中任一所述黄连分子标记多态性的物质，为权利要求1-5中任一 所述引物对037A4、所述引物对034H11、所述引物对006G4和/或所述引物对008H3。8. 鉴定或辅助鉴定黄连属植物的产品，其特征在于：所述鉴定或辅助鉴定黄连属植物 的产品含有检测权利要求1-5中任一所述黄连分子标记多态性的物质。9. 根据权利要求8所述的产品，其特征在于：所述检测黄连分子标记多态性的物质为 权利要求1-5中任一所述引物对037A4、所述引物对034H11、所述引物对006G4和/或所述 引物对008H3。10. 鉴定或辅助鉴定黄连属植物的方法，包括如下步骤：分别以黄连、峨眉黄连、云南 黄连、短萼黄连、三角叶黄连和待鉴定黄连属植物的基因组DNA为模板，采用权利要求1-4 中任一所述引物对037A4、所述引物对034H11、所述引物对006G4和所述引物对008H3分别 进行PCR扩增，分别得到037A4的PCR扩增产物，034H11的PCR扩增产物，006G4的PCR扩 增产物和008H3的PCR扩增产物，根据这四种PCR扩增产物的序列进行分型； 对所述黄连、所述峨眉黄连、所述云南黄连、所述短萼黄连、所述三角叶黄连和所述待 鉴定黄连属植物的分型结果进行聚类分析，所述待鉴定黄连属植物与所述黄连聚为一类， 所述待鉴定黄连属植物为或候选为黄连；所述待鉴定黄连属植物与所述峨眉黄连聚为一 类，所述待鉴定黄连属植物为或候选为峨眉黄连；所述待鉴定黄连属植物与所述云南黄连 聚为一类，所述待鉴定黄连属植物为或候选为云南黄连；所述待鉴定黄连属植物与所述短 萼黄连聚为一类，所述待鉴定黄连属植物为或候选为短萼黄连；所述待鉴定黄连属植物与 所述三角叶黄连聚为一类，所述待鉴定黄连属植物为或候选为三角叶黄连；所述待鉴定黄 连属植物与所述黄连、所述峨眉黄连、所述云南黄连、所述短萼黄连和所述三角叶黄连均不 聚为一类，所述待鉴定黄连属植物不为或候选不为黄连、峨眉黄连、云南黄连、短萼黄连和 三角叶黄连。
【专利摘要】本发明公开了检测黄连分子标记多态性的物质在鉴定或辅助鉴定黄连属植物中的应用。本发明所提供的应用中，黄连分子标记为下述A1-A4：A1以黄连属植物的基因组DNA为模板，采用引物对037A4进行扩增得到的DNA分子；A2以黄连属植物的基因组DNA为模板，采用引物对034H11进行扩增得到的DNA分子；A3以黄连属植物的基因组DNA为模板，采用引物对006G4进行扩增得到的DNA分子；A4以黄连属植物的基因组DNA为模板，采用引物对008H3进行扩增得到的DNA分子。实验证明，本发明的黄连分子标记037A4、034H11、006G4和008H3的多态性与黄连属植物的不同种相关，可用来鉴定黄连属植物。
【IPC分类】C12N15/11, C12Q1/68
【公开号】CN105132527
【申请号】CN201510419214
【发明人】黄璐琦, 孙义民, 谢兰, 袁媛, 李好勋, 穆婧, 程京
【申请人】博奥生物集团有限公司, 中国中医科学院中药研究所, 清华大学
【公开日】2015年12月9日
【申请日】2015年7月16日