分子标记辅助选择多基因高抗稻瘟病材料的育种方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种分子标记辅助选择多基因高抗稻瘟病材料的育种方法，尤其是采用特异性的分子标记辅助选择聚合含多个抗稻瘟病基因的水稻材料，结合田间表型性状和抗病性鉴定，选育目标更加明确高效，属于水稻育种领域。
【背景技术】
[0002]稻瘟病是由稻瘟病菌引起的水稻病害，其分布范围十分广泛。据统计，全世界有80余个国家均有发生，一般流行年份可造成10 % -20%的减产，严重发生时则达到40% -50%。20世纪90年代以来，我国稻瘟病的年发生面积均在380万hm2以上，每年损失稻谷数亿千克。随着品种应用的单一化、集中化以及气候的影响，稻瘟病的危害也越来越严重。尽管人们在防害防治上耗费了巨大的精力和物质投入，但限于诸多方面因素的影响，防治效果一直不尽人意，尤其在病害严重发生的年份，常常给生产育种造成了巨大的损失。以辽宁省为例，辽宁省主栽水稻品种辽星I号，近年来由于品种抗病性退化导致穗茎瘟大面积发生，严重影响了辽宁省粳稻的生产。产生这种现象的根本原因就是主栽品种对稻瘟病病苗的抗谱狭窄，且单一化，集中化种植普遍，这样一旦稻瘟病病菌流行小种发生变化，品种对稻瘟病的抗性便迅速下降。因此选育广谱多基因聚合水稻品种很重要。
[0003]目前，在抗稻瘟病品种选育过程中，育种家主要采用系谱法。传统的系谱法通过两亲本组配，从分离后代中择优选育品种，抗病表型依赖于田间自然鉴定或人工接种鉴定，鉴别难度大，准确率很低。由于不了解亲本的抗病基因型，育种者在亲本选择上非常盲目，通常是海量配组，海量选择后代，工作量大，育种效率低。利用分子标记结合田间抗病表现进行选择，可以大大提高抗性品种选育的准确性和效率。
[0004]P1-ta基因位于水稻第12染色体靠近着丝点附近的区域，定位于BAC克隆BAC142E8上(Bryan et al.，2000)，Pi_ta基因包含2个外显子和I个1463bp的内含子，编码一个长度为928个氨基酸的细胞质膜受体蛋白，该蛋白含NBS结构域和富亮氨酸结构域(LRD)，P1-ta位点上的抗感两基因的编码产物仅有一个氨基酸的差异，即第918氨基酸由抗病产物的丙氨酸变异为感病产物的丝氨酸，其抗病机制是P1-ta基因的编码产物能与稻瘟病菌的无毒基因AVR-Pita表达产物相互作用引发抗病反应(Bryan et al.,2000), Pita对辽宁地区的稻瘟病小种有一定的效果。
[0005]Ρ?5以前定位于第4染色体，与RG788连锁(Wang et al.，1994);后被更正，重新定位于第9染色体上S04G03和C1454之间的170kb区间内(Jeon et al.，2003)。研究表明Pi5与Pi3等位或紧密连锁(Inukai et al.，1996)，而对Pi5/Pi3区间的测序表明它们实质上就是同一个基因，而且它们的抗性供体不是Moroberekan和Pa1-Kan-Tao (Jeon etal.，2003)，最有可能的供体是Tetep (Yi et al.，2004)。此外，Pi5/Pi3与Pii位于同一位置，且抗谱一致，推测它们是同一个基因(Yi et al.，2004)。
【发明内容】
[0006]为了高效选择高抗稻瘟病新品种，有针对性、特异性的选择针对辽宁地区，选育含有抗病基因Pita和pi5的育种材料，本发明提供了一种有效的育种方法。利用DNA标记Al，A2和A3，A4对稻瘟病抗性基因Pita进行分子标记辅助选择，利用DNA标记BI，B2对稻瘟病抗性基因Pi5进行分子标记辅助选择，结合田间不同分离世代的性状选择及抗性鉴定，在最佳世代进行抗病基因聚合，提闻了选育多基因闻抗水稻新材料的效率。
[0007]本发明提供以下解决方案:
[0008]利用含有稻瘟病抗性基因Pita的水稻材料Pl与辽宁感病材料辽星I号构建抗感F2群体。利用特异分子标记Al、A2、A3、A4筛选田间表型性状优良且含有Pita的单株，利用筛选出的抗病单株与感病亲本辽星I号进行回交，得到回交群体BC1F1在海南进行加代；在天津正季播种BC1F2的种子，再次利用分子标记A1、A2、A3、A4对稻瘟病抗性基因Pita进行筛选，同时结合田间表型及抗病性鉴定筛选抗病单株，利用抗病单株再与感病亲本辽星I号进行回交，得到BC2F1群体在海南加代；在天津正季播种BC 2F2种子，利用分子标记Al、A2、A3、A4对稻瘟病基因Pita进行筛选，筛选出的抗病单株进行自交加代，得到BC2F4代含有抗病基因Pita单株。
[0009]利用含有稻瘟病抗性基因Pi5的水稻材料P2与辽宁感病材料辽星I号构建抗感F2群体。利用特异分子标记B1、B2筛选田间表型性状优良且含有Pi5的单株，利用筛选出的抗病单株再与感病亲本辽星I号进行同交，得到回交群体BCiF1在海南进行加代；在天津正季播种BC1F2的种子，再次利用分子标记B1、B2对稻瘟病抗性基因Pi5进行筛选，同时结合田间表型及抗病性鉴定筛选抗病单株，利用抗病单株再与感病亲本辽星I号进行回交，得到BC2F1群体在海南加代；在天津正季播种BC2F2种子，利用分子标记B1、B2对稻瘟病基因Pi5进行筛选，筛选出的抗病单株进行自交加代，得到BC2F4代含有抗病基区pi5单株。
[0010]利用BC2F4代的含有抗病基因Pita单株与含有抗病基因pi5单株进行杂交，自交得到F2并利用分子标记Al、A2、A3、A4，B1、B2对抗病基因Pita、pi5进行筛选，并结合田间的抗病性鉴定，选择含有两个抗病基因且田间表现优良的单株进行自交加代。自交加代3代得到含有Pita，pi5抗病基且田间表现纯和稳定的抗病新品种。
[0011]一种检测稻瘟病抗性基因Pita是否存在的引物对，如Al、A2、A3、A4。
[0012]Al 的引物序列为 5’ AGCAGGTTATAAGCTAGGCC-3’
[0013]A2 引物序列为 5 ’ -CTACCAACAAGTTCATCAA-3 ’
[0014]A3 的引物序列为 5 ’ AGCAGGTTATAAGCTAGCTAT-3 ’
[0015]A4 的引物序列为 5 ’ CTACCAACAAGTTCATCAA-3 ’
[0016]一种检测稻瘟病抗性基因Pi5是否存在的引物对，如B1、B2。
[0017]BI 的引物序列为 5’ ATAGATCATGCGCCCTCTTG-3’
[0018]B2 的引物序列为 5’ TCATACCCCATTCGGTCATT-3’
[0019]一种检测水稻DNA中是否存在水稻稻瘟病抗性基因Pita的方法，以A1、A2、A3、A4所示序列为引物，扩增待检测DNA。利用标记Al和A2扩增产物有带并A2和A3标记扩增产物无带这样的情况为含有抗病基因Pita，如图1，图2所示。
[0020]一种检测水稻DNA中是否存在水稻稻瘟病抗性基因Pi5的方法，以B1、B2所示序列为引物，扩增待检测DNA。扩增产物含有P2带型的为含有pi5抗病基因，如图3所示。
[0021]一种多基因高抗稻瘟病材料的选育方法，以含有水稻稻瘟病抗性基因Pita、Ρ?5的水稻材料为亲本，与感病水稻品种辽星I号进行杂交，对杂交后代分离群体单株提取基因组DNA，以Al、A2、A3、A4，B1、B2所示序列为引物进行PCR扩增，结合田间抗病性及表型鉴定，最终筛选含有稻瘟病抗性基因Pita、pi5并抗病性较好的单株
【附图说明】
[0022]图1是分子标记A1、A2在稻瘟病抗性基因Pita的抗性亲本Pl和感病品种辽星I号及后代分离群体的扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图:
[0023]图2是分子标记A3、A4在稻瘟病抗性基因Pita的抗性亲本Pl和感病品种辽星I号及后代分离群体的扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图:
[0024]图3是分子标记B1、B2在稻瘟病抗性基因Pi5的抗性亲本P2和感病品种辽星I号及后代分离群体的扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图:
[0025]M:2000bp 分子量标记(片段长度分别为 2000bp, 100bp，750bp, 500bp, 250，10bp)
【具体实施方式】
[0026]实施例1:含稻瘟病抗性基因Pita的抗性亲本Pl与感病亲本辽星I号杂交构建后代群体的鉴定筛选
[0027]含稻瘟病抗性基因Pita的抗性亲本Pl与感病亲本辽星I号杂交，再自交，然后自交F2代进行性状筛选及抗稻瘟病病基因Pita筛选，选择株高、生育期、丰产性等与辽星I号相似且含有抗病基因Pita的F2单株50株；然后与感病亲本辽星I号第一次回交，自交得到BC1F2,再进行性状筛选及抗病基因Pita的筛选，选中性状优良且含有抗病基因Pita的BC1F2单株50株；然后与感病亲本辽星I号进行第二次回交，自交得到BC2F2，再进行性状筛选及抗病基因Pita的筛选，选中性状优良且含有抗病基因的BC2F2单株部自交加代，选择性状优良且含有抗病基因的BC2F3单株进行自交；得到BC2F4含有抗病基因且表型优良的株系O
[0028]实施例2:含稻瘟病抗性基因Pi5的抗性亲本P2与感病亲本辽星I号杂交构建抗感群体的鉴定筛选
[0029]含稻瘟病抗性基因Pi5的抗性亲本P2与感病亲本辽星I号杂交，再自交，然后自交F2代进行性状筛选及抗稻瘟病病基因Pi5筛选，选择株高、生育期、丰产性等与辽星I号相似且含有抗病基因Pi5的F2单株50株；然后与感病亲本辽星I号第一次回交，自交得到BC1F2，再进行性状筛选及抗病基因Pita的筛选，选中性状优良且含有抗病基因Pi5的BC1F2单株50株；然后与感病亲本辽星I号进行第二次回交，自交得