检测DNA甲基化鉴别同卵双生子的试剂盒及方法与流程

本发明属于分子生物学领域，具体涉及检测dna甲基化鉴别同卵双生子的试剂盒及方法。

背景技术：

目前短串联重复序列分型是法医学广泛采用的分型技术，单核苷酸多态性是近些年来应用于法医领域的遗传标记，它对于处理降解检材，以及推测嫌疑人个性特征有一定的优势。目前利用法医的常规技术手段能够解决案件中大多数同一认定和亲子关系鉴定问题，但对于同卵双胞胎仍然很难进行区分。由于同卵双生子是从同一个受精卵发育而来，他们拥有相同的dna序列，这就给涉及同卵双胞胎的犯罪案件的侦破带来很大的困难。英国的朴次茅斯市发生的汽车盗窃案，在被盗汽车上采集到嫌疑人dna，经调查发现有一对同卵双胞胎都拥有这份dna数据，这就无法认定真正的盗窃者。法国马赛地区发生的多次强奸案，警方通过监控锁定了一名送货司机，但最终查出的嫌犯是一对同卵双胞胎兄弟，由于应用现有的技术无法区分这对兄弟，也只好把两人无罪释放。同卵双胞胎违法犯罪事件同样在国内也有发生，陕西省岐山县公安局受理的一起强奸杀人案，dna证据直指邻家一对同卵双胞胎，由于他们具有相同的dna分型，从而给案件的侦破带来了很大的困难。因此，应用分子生物学的方法对同卵双生子进行鉴别，对案件的侦破将起到很大的作用。

技术实现要素：

针对同卵双生子之间有着相同或极其相似的基因序列，难以区分的问题，提供检测dna甲基化鉴别同卵双生子的试剂盒及方法。

为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：

检测dna甲基化鉴别同卵双生子的试剂盒，包括：血液dna提取试剂盒、dna甲基化转化试剂盒、pcr缓冲溶液、引物、焦磷酸测序试剂盒、磁珠、结合缓冲液、洗涤缓冲液、退火缓冲液和变性缓冲液；所述引物包括分别对应靶序列igs3、igs4、igs5和igs6，用于pcr扩增的上下游引物和测序引物：

（1）对于igs3靶序列：

上游引物：5’-agagggttatttgagtttagtttttt-3’，

下游引物：5’-biotin-aaaatttacaaatttccaatctactatcc-3’，

测序引物：5’-ttttttttttaattttgtaatgagt-3’；

（2）对于igs4靶序列：

上游引物：5’-gtttttggtaggaagagggaaaaat-3’，

下游引物：5’-biotin-attaaccaaaataatcttaatcacctaac-3’，

测序引物：5’-aggaagagggaaaaataatta-3’；

（3）对于igs5靶序列：

上游引物：5’-gtttttgatagggttggtttgtattg-3’，

下游引物：5’-biotin-ccactaaaaaaaacaaaaacaacctaatta-3’，

测序引物：5’-ggttggtttgtattgg-3’；

（4）对于igs6靶序列：

上游引物：5’-gttgggtttatttttgttattgttgg-3’，

下游引物：5’-biotin-actcttccaaaaaacccctaat-3’，

测序引物：5’-atttttgttattgttggaga-3’；

所述下游引物标有生物素。

本发明所述的鉴别同卵双生子的方法，包括如下步骤：

a）利用所述血液dna提取试剂盒提取同卵双生子dna，得到dna提取液；

b）利用所述dna甲基化转化试剂盒对步骤a）中所提取的dna进行亚硫酸氢盐转化；

c）pcr扩增

在pcr缓冲溶液、上下游引物和无核酶水混合溶液中加入步骤b）中经亚硫酸氢盐转化后的dna进行pcr扩增；

d）分别建立相应的assay，确定每条序列喷碱基的相应顺序

对于igs3的序列喷碱基顺序：

atcgctgatcgtgtgactgattcgtagttgatatatatgtgtgtagtgtagagaatcgtg；

对于igs4的序列喷碱基顺序：

attgactgatcgtgtgctgatcgtgtgatcgtgtattagtattgatgtcgagtgtatatgatcgag；

对于igs5的序列喷碱基顺序：

atgctgatcgctagttattagtgtatgtcgtgagtatcgat；

对于igs6的序列喷碱基顺序：

atatgtcagtcgctagttggagctattgatcgagtgatagtcgtattgtgtagttcgtatgatcgag；

e）对扩增产物进行单链分离和纯化

步骤c）中所得的扩增产物加入含有结合缓冲液和磁珠的pcr板孔内，恒温水平震荡处理后，用样品吸附器吸附结合在磁珠上的含生物素的pcr扩增产物，经纯化处理得到纯净的单链dna模板；将所述单链dna模板转移至含测序引物的退火缓冲液中，恒温退火，冷却至室温待测序；

f）对单链dna模板进行焦磷酸测序反应

准备好焦磷酸测序反应所用的酶混合物、底物混合物及dntp，加入试剂舱，将步骤e)所得的单链dna模板放入焦磷酸测序仪，根据步骤c）中的喷碱基顺序进行焦磷酸测序反应；

g）分析测序结果

焦磷酸测序仪自动对测序结果进行判读并标记出每个甲基化位点的甲基化程度及平均甲基化水平，根据测序结果获得的甲基化信息，对同卵双生子进行鉴别：以焦磷酸测序仪灵敏度a为标准，若同卵双生子之间甲基化水平差值大于a，则认为双生子之间有差异；若同卵双生子之间甲基化水平差值小于或等于a，则认为双生子之间无差异。

进一步地，所述步骤e）中，pcr板孔内扩增产物、结合缓冲液、磁珠的体积比为37:40:3。

进一步地，所述恒温水平震荡采用恒温混匀仪实现，所述恒温混匀仪为thermomixer。

进一步地，所述步骤e）中，纯化处理依次包括：用70%乙醇洗涤5秒，变性缓冲液中变性15秒，洗涤缓冲液中洗涤15秒。

进一步地，所述步骤e）中，含测序引物的退火缓冲液中退火缓冲液与测序引物体积比为25:1。

进一步地，所述步骤e）中，恒温退火温度为80℃，时间为5min。

基因序列：gs1序列(genebankaccesionnumber:xm_006726188)位于跨膜通道样蛋白4（transmembranechannel-like4，tmc4）的外显子区，可检测6个cpg位点，扩增片段为85bp；gs3序列(genebankaccesionnumber:nm_001256358)位于酪氨酸蛋白激酶6（proteintyrosinekinase6,ptk6)的外显子区，可检测5个cpg位点，扩增片段为129bp；igs1、igs2两条序列均位于基因间区，其染色体定位分别为chr3:22416669-22416925、chr3:79754432-79754736，其扩增片段长度分别为139bp、164bp，可分别检测4个、3个cpg位点；line-1序列扩增片段为168bp，可检测3个cpg位点；5条靶序列dna甲基化鉴别同卵双生子的能力的累积效能为77.5%。

本发明中所提供的基因序列：igs3、igs4、igs5和igs6四条序列均位于基因间区，其染色体定位分别为chr1:114870877-114871203、chr12:67213759-67214092、chr11:5539842-5540207、chr1:56877427-56877787，其扩增片段长度分别为152bp、141bp、109bp、168bp，可分别检测4个、5个、3个、4个cpg位点。

采用上述技术方案所产生的有益效果在于：

（1）本发明所提供的检测dna甲基化鉴别同卵双生子的试剂盒，所包含的4条序列igs3、igs4、igs5和igs6在相应的cpg位点上甲基化水平存在明显差异，可以有效的对同卵双生子进行鉴别，与现有的gs1、gs3、igs1、igs2和line-1序列联合使用，可以提高对同卵双生子的鉴别能力，鉴别同卵双生子的能力的累积效能，从原来的77.5%可以提升到94.2%，更好地为同卵双生子犯罪案件的侦破提供技术支持。

（2）本发明所提供的鉴别同卵双生子的方法，采用焦磷酸测序技术，可重复性和精确性高，成本低，可以大通量、适时、快速、直观地进行同卵双生子的鉴别。

附图说明

图1和图2是本发明实施例中同卵双生子个体的igs3序列甲基化代表性结果。

图3和图4是本发明实施例中同卵双生子个体的igs4序列甲基化代表性结果。

图5和图6是本发明实施例中同卵双生子个体的igs5序列甲基化代表性结果。

图7和图8是本发明实施例中同卵双生子个体的igs6序列甲基化代表性结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步详细的说明。

检测dna甲基化鉴别同卵双生子的试剂盒，包括：血液dna提取试剂盒、dna甲基化转化试剂盒、pcr缓冲溶液、引物、无核酶水、焦磷酸测序试剂盒、磁珠、结合缓冲液、洗涤缓冲液、退火缓冲液和变性缓冲液；所述引物包括分别对应靶序列igs3、igs4、igs5和igs6，用于pcr扩增的上下游引物和测序引物。

血液dna提取试剂盒可以简单、方便地从新鲜或长时间存放（超过24小时）的全血中分离高纯度基因组dna；该试剂盒将硅胶膜技术的优势与微量离心形式结合在一起，同时无需采用昂贵的树脂、乙醇沉淀，以及诸如苯酚和氯仿等有害化学成分。

dna甲基化转化试剂盒在3小时内完全转化富含gc的dna，两次加热变性的反应步骤简化了由未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶的过程，无dna沉淀，并且通过柱层析一步完成dna的纯化和脱硫，洗脱的超纯dna对于一系列的分子生物分析是非常理想的。

用于pcr扩增的上下游引物及测序引物均由上海生工生物技术有限公司合成，上游引物均采用的page纯化的方法，下游标记生物素的引物则采用反向高压液相层析（hplc）纯化的方法合成，所述上下游引物的碱基序列如下表所示。

为了更好的说明本发明实施例提供的检测dna甲基化鉴别同卵双生子的试剂盒及方法，下面通过实施例做进一步的举例说明。

实施例1

本发明鉴别同卵双生子的方法，包括如下步骤：

a)双生子血样dna的提取、定量、分装及保存

应用qiagen公司的血液dna提取试剂盒提取2ml血液样本的dna，应用核酸蛋白定量仪对所提取的dna进行检测，并记录下每个样本dna的浓度与纯度，分装于-20°c保存。

b)亚硫酸氢盐转化

1)加入130μl的ct转化试剂于20μldna样品中(20μl的样品中dna含量约500ng)；

2)颠倒混匀1)中的试剂，简短离心并均分到2个200μl的离心管中并离心；

3)把2）中的离心管放入pcr中，98℃变性10分钟，64℃孵育2.5小时；

4)向zymo-spinic™column纯化柱中加600μl的m-bindingbuffer，并把纯化柱放到收集管中；

5)将3）中转化后的样品转移到zymo-spinic™column纯化柱中，盖上盖子颠倒数次混匀；

6)室温全速离心1分钟，弃掉收集管中的液体，擦干柱子边缘并放回收集管中；

7)向纯化柱中加入200μl的洗涤缓冲溶液，全速离心1分钟；

8)向纯化柱中加入200μl的m-desulphonationbuffer并且在室温下放置15-20分钟，全速离心30秒，弃掉收集管中的液体，擦干柱子边缘并放回收集管中；

9)加200μl的m-washbuffer到纯化柱中。全速离心1分钟；

10）重复8）步骤一次，弃掉收集管中的液体，擦干柱子边缘并放到一个新的1.5mll的离心管内。

11)直接加10~15μl的m-elutionbuffer到纯化柱底部膜上，室温放置5分钟，全速离心收集dna到1.5ml离心管内。

c）转化后的dna进行pcr扩增

本实施例采用pcr进行扩增（polymerasechainreaction，聚合酶链式反应）。扩增体系如下表所示。

pcr扩增步骤：在abi9700pcr扩增仪中进行扩增，热循环参数：95°c，5min；（95°c，15sec，x°c，30sec，72°c，15sec）×48，72°c，5min。5条序列的退火温度分别为gs1序列:58°c，gs3序列:59°c，igs1序列:54°c，igs2序列:54°c，igs3序列:55°c，igs4序列:52°c，igs1序列:54°c，igs2序列:56°c，line-1序列:50°c；，最终保持在4°c，得扩增产物。

扩增产物在进行焦磷酸测序反应之前，需要用琼脂糖凝胶电泳进行简单验证。通常情况下，只需要进行琼脂糖凝胶电泳即可。如果电泳结果得到较清晰的目的条带，且非特异性条带较少，则不影响测序，即可进行焦磷酸测序反应。

d）确定喷碱基顺序（dispensationorder）

在进行焦磷酸测序之前，需要先获得dispensationorder。打开pyromarkid软件，点击newassay，将引物设计软件中所保存的本实验的待分析序列引入，程序即可自动生成一个dispensationorder和预期的焦磷酸序列图（pyrogram）。设置内指控即任意选择2个由“c”转化过来的“t”，在其前面加喷一个“c”，作为检测dna序列经亚硫酸氢盐转化是否完全的内质控，保存文件。

e）对扩增产物进行单链分离和纯化

在pcr板孔内加入40μlbingdingbuffer，再加入步骤c）中所得的扩增产物37μl，然后震荡磁珠（beads）使其混合均匀取3μl磁珠放到pcr板相应的孔内，把pcr板放在thermomixer上常温水平震荡30分钟，使beads与含生物素的产物链充分结合。用samplepreptool吸附被结合在磁珠上的含生物素的单链pcr产物，然后进行纯化（不关闭samplepreptool开关，依次用70%乙醇洗涤5秒、变性缓冲液中变性15秒，洗涤缓冲液中洗涤15秒），从而得到纯净的单链dna模板。把纯化后的单链小心转移至已准备好的测序板内，测序板每孔有40μl含1.6μl测序引物的退火缓冲液，烤箱80℃恒温退火5min，冷却至室温待测序。

f）建立run文件进行焦磷酸测序反应

打开pyromarkid软件，点击file主菜单区下的newruns，输入runname等反应的信息，选择反应孔，输入相应的样本信息等。在tools菜单中点击volumeinformation选项，即可显示本次实验需要用到的酶混合物、底物混合物和四种dntps的具体用量。向酶以及底物混合物中分别加入620μl无核酶水。将酶和底物以及四类核苷酸(a、t、c、g)按照系统显示的量分别加入试剂舱指定位置，在软件界面点击运行键run即可进行测序。

g）读取dna甲基化信息，分析测序结果

焦磷酸测序仪自动对测序结果进行判读并标记出每个甲基化位点的甲基化程度及平均甲基化水平，根据测序结果获得的甲基化信息，以焦磷酸测序仪灵敏度5%为标准，若同卵双生子之间甲基化水平差值大于5%，则被认为双生子之间有差异，小于或等于5%的视为无差异，对同卵双生子进行鉴别。

基因序列：igs3、igs4、igs5和igs6四条序列均位于基因间区，其染色体定位分别为chr1:114870877-114871203、chr12:67213759-67214092、chr11:5539842-5540207、chr1:56877427-56877787，其扩增片段长度分别为152bp、141bp、109bp、168bp，可分别检测4个、5个、3个、4个cpg位点。

如图1和图2所示，图1和图2为两个同卵双生子个体，igs3序列甲基化代表性结果，在cpg1、cpg2、cpg3位点上两个体甲基化水平存在差异。

如图3和图4所示，图3和图4为两个同卵双生子个体，igs4序列甲基化代表性结果，在cpg1、cpg2、cpg3、cpg4、cpg5位点上两个体甲基化水平存在差异。

如图5和图6所示，图5和图6为两个同卵双生子个体，igs5序列甲基化代表性结果，在cpg1、cpg2位点上两个体甲基化水平存在差异。

如图7和图8所示，图7和图8为两个同卵双生子个体，igs6序列甲基化代表性结果，在cpg1、cpg2位点上两个体甲基化水平存在差异。

由以上数据可得，本发明检测dna甲基化鉴别同卵双生子的试剂盒及方法，对同卵双生子可以进行鉴别，为同卵双生子犯罪案件的侦破提供技术支持。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，本发明要求保护范围由所附的权利要求书、说明书及其等效物界定。

序列表

<110>河北医科大学

<120>检测dna甲基化鉴别同卵双生子的试剂盒及方法

<130>2017

<160>12

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>26

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

agagggttatttgagtttagtttttt26

<210>2

<211>29

<212>dna

<213>人工序列

<400>2

aaaatttacaaatttccaatctactatcc29

<210>3

<211>25

<212>dna

<213>人工序列

<400>3

ttttttttttaattttgtaatgagt25

<210>4

<211>25

<212>dna

<213>人工序列

<400>4

gtttttggtaggaagagggaaaaat25

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<211>29

<212>dna

<213>人工序列

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attaaccaaaataatcttaatcacctaac29

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<212>dna

<213>人工序列

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aggaagagggaaaaataatta21

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<212>dna

<213>人工序列

<400>12

atttttgttattgttggaga20