检测的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及环境污染物检测领域，具体涉及基于Exo III (核酸外切酶III)辅助 的目标物循环和DNAzyme (脱氧核酶）切割循环构建的双重放大荧光反应用于检测Hg2+，尤 其涉及检测水溶液中的Hg2+的检测。
【背景技术】
[0002] Hg2+作为一种最常见和稳定形式的汞，由于其即使在较低浓度下具有高毒性的性 质，是一种严重的环境污染物。因为其具有生物累积性，Hg 2+的摄取危害人类健康。当其在 人体内过量存在时，会损害人类的神经系统、肾脏和其他器官。因此，迫切需要发展一种可 靠且灵敏的方法用于Hg 2+的检测。传统的检测方法，包括原子吸收光谱和电感耦合等离子 体质谱已经发展起来用于Hg2+的检测。然而，这些方法需要复杂的仪器和样品预处理，限制 了其在实际和日常检测中的应用。在荧光、电化学和比色技术的基础上，一些简便且经济的 方法被建立起来。其中，荧光法以其良好的准确性和高灵敏度受到广泛关注。
[0003] Ono及其合作者报导，T-T错配碱基能够选择性的结合Hg2+，形成T-Hg 2+-T金属碱 基对，由于N-Hg2+-N键的形成，此金属碱基对比天然的沃森-克里克碱基对更稳定。这一发 现为Hg 2+检测实验提供了高选择性和有效的识别方式。Yang课题组展示了金属离子诱导 的单、双链DNA的构型转变，借助金纳米颗粒实现对Hg 2+的检测。Lou课题组构建了基于芯 片的传感器用于检测Hg2+。然而，多数这些方法的检测限大于1. 0X 10 sm〇l ? L \不能满足 美国环境保护署的检测要求（1. 0X 10 sm〇l ? L \ 2011)。
[0004] -些基于酶的灵敏的方法被建立起来，这些酶包括切刻酶，外切酶和聚合酶。虽然 灵敏度有所提尚，实验结果并不完全令人满意，这是由其一步放大机制造成的。Zhang和他 的合作者将链置换扩增和短的淬灭-荧光探针结合起来发展了一种Hg 2+检测方法。Wi 1 lner 课题组提出了一种Hg2+诱导的聚合/切刻机器，产生DNAzyme用于循环切割底物。虽然实 现了两步放大，此过程需要引物来产生大量的DNA重复序列和特殊的切刻酶识别位点来进 行切刻反应，这就增加了探针设计的复杂性。因此，仍然需要构建一种新的机制来简化探针 设计并且获得良好的扩增能力。
【发明内容】
[0005] 为解决上述现有技术存在的问题，发明人提出了一种新型双重放大反应用于灵敏 和选择性的检测Hg 2+。所述的双重放大方法是基于Exo III辅助的目标物循环和DNAzyme 切割循环，通过T-rich部分T-Hg2+-T碱基对的形成，A-DNA靠近H-DNA，打开封闭在发卡结 构中的DNAzyme，形成Hg-Complex。在Exo III的作用下，Hg2+和A-DNA被释放出来，引发 与另一个H-DNA的杂交反应，产生大量的DNAzyme。得到的DNAzyme能够对分子信标底物进 行循环切割。因此，这种新型双重放大方法被建立起来并且能够灵敏和选择性的检测水溶 液中的Hg 2+甚至是污水样品中的Hg 2+。此外，这一方法克服了设计上的要求并且较好的实 现了双重放大效果。
[0006] 本发明涉及以下技术方案：
[0007] -种双重放大反应方法，其特征是：Hg2+存在时，其能够与颈环结构探针和单链 探针中T-T错配碱基相互作用，形成Hg 2+介导的金属碱基对，加入Exo III后释放出Hg2+、 DNAzyme和单链探针，自由的Hg2+和单链探针引发与颈环结构探针之间的杂交反应，产生 大量的DNAzyme序列，完成信号一级放大；DNAzyme催化分子信标裂分释放焚光信号，并重 新释放DNAzyme，进行信号的二级放大；当Hg2+不存在时，颈环结构的探针与单链探针的 T-rich部分存在T-T碱基错配，不产生自由的DNAzyme序列来产生信号。
[0008] -种双重放大反应方法，包括探针H-DNA (发卡DNA)和A-DNA (辅助DNA)，H-DNA 包含悬垂在3'末端的T-rich部分和封闭在发卡结构中的DNAzyme部分，T-rich部分含有 用于选择性识别Hg 2+的T碱基和辅助Hg-Complex形成的G/C碱基，DNAzyme被封闭在发卡 的颈环结构中，用来进行随后的DNAzyme切割循环。A-DNA是一条单链结构的DNA，自5'到 3'依次为保护部分、互补部分和T-rich部分，A-DNA中T-rich部分与H-DNA中的类似，两 者共同作用完成对Hg 2+的特异性结合和H-DNA和A-DNA双链的形成，互补部分和保护部分 引发链置换反应、打开封闭有DNAzyme的发卡结构并进一步辅助Exo III介导的循环。
[0009] 当Hg2+存在时，其能够与H-DNA和A-DNA中T-T错配碱基相互作用，形成Hg 2+ 介导的金属碱基对，T-Hg2+-T，目标物的识别将H-DNA与A-DNA结合起来，引发它们之间 的链置换反应，获得Hg 2+介导的带有悬垂的保护部分和DNAzyme部分的双链结构（称为 Hg-Complex)，在Exo III的作用下，催化Hg-Complex双链部分由3'平末端的核苷酸逐步水 解，最终，释放出Hg2+和A-DNA，自由的Hg 2+和A-DNA能够引发与另一个H-DNA之间的杂交反 应，产生大量的DNAzyme序列，产生的DNAzyme序列能够与加入的MB杂交，在辅助因子Zn 2+ 存在下，重复地催化MB的断裂。因此，实现了基于Exo III辅助的目标物循环和DNAzyme 切割循环的新型双重放大策略，两种探针，H-DNA和A-DNA被合理的设计用来获得最佳的结 果。如图1所示。
[0010] 所述探针H-DNA和A-DNA的T-rich部分的G/C碱基个数为3、4、5、6、7或8个，优 选6个。
[0011] 优选：H-DNA3(SEQ ID N0:1) :CAT CTC TTC TCC GAG CCG GTC GAA ATA GTG GGT AAT GAA GAG ATG GTT TCG 与 A-DNA3(SEQ ID N0:2) :CGT TTC CAT CTC TTC AAA AAG;
[0012] H-DNA4(SEQ ID NO:3) :CAT CTC TTC TCC GAG CCG GTC GAA ATA GTG GGT AAT GAA GAG ATG GTT TCG G 与 A-DNA4(SEQ ID N0:4) :CCG TTT CCA TCT CTT CAA AAA G;
[0013] H-DNA5(SEQ ID NO:5) :CAT CTC TTC TCC GAG CCG GTC GAA ATA GTG GGT AAT GAA GAG ATG GTT TCG GG与A-DNA5(SEQ ID N0:6) :CCC GTT TCC ATC TCT TCA AAA AG;
[0014]更优选：H-DNA6(SEQ ID NO:7) :CAT CTC TTC TCC GAG CCG GTC GAA ATA GTG GGT AAT GAA GAG ATG GTT TCG GGG与A-DNA6(SEQ ID N0:8) :CCC CGT TTC CAT CTC TTC AAA AAG；
[0015] H-DNA7(SEQ ID NO:9) :CAT CTC TTC TCC GAG CCG GTC GAA ATA GTG GGT AAT GAA GAG ATG GTT TCG GGG G与A-DNA7(SEQ ID N0:10) :CCC CCG TTT CCA TCT CTT CAA AAA G；
[0016]或H-DNA8(SEQ ID N0:11) :CAT CTC TTC TCC GAG CCG GTC GAA ATA GTG GGT MT GAA GAG ATG GTT TCG GGG GG与A-DNA8(SEQ ID N0:12) :CCC CCC GTT TCC ATC TCT TCA AAA AG〇
[0017]优选分子信标为SEQ ID N0:13 :FAM-CCA CCA CAC TGA AAT TGA CCC ACT ATrA GGA AGA GAT GIT ACG AGG CGG TGG TGG-Dacyl，rA为核糖核酸。
[0018] DNAzyme序列：CATCTCTTCTCCGAGCCGGTCGAAATAGTGGGTAAo
[0019] H-DNA 的互补序列：T GAAGAGATG。
[0020] A-DNA 的互补序列：CATCTCTTC A。
[0021] H-DNA 的T-rich序列：GITTCG。
[0022] A-DNA 的T-rich序列：CGTITC。
[0023] A-DNA 的保护序列：AA AAG。
[0024] H-DNA的发卡结构的颈部序列：CATCTCTTC ;GAAGAGA