TG。
[0025] MB中发卡结构的颈部序列：CCACCAC ;GTGGTGG。
[0026] 本反应方法的关键点在于H-DNA与A-DNA之间双链结构的形成，此双链结构包括 Hg 2+介导的金属碱基对和邻近的沃森-克里克碱基对。因此，特异性的形成H-DNA与A-DNA 之间的T-Hg 2+-T碱基对与邻近的碱基有关。发明人设计了六种T-rich部分具有不同G/C 碱基数量的DNA探针。如图2所示，随着G/C碱基个数的增加，阳性体系的荧光强度逐渐增 加，当G/C碱基个数达到6个后趋于平衡，这是由于随着G/C碱基个数的增加，Hg-Complex 越容易形成。比较阴性结果，当G/C碱基个数从3增加到6时，信号略微增加；而当G/C碱 基个数从6增加到8时，信号显著增长，因为H-DNA与A-DNA之间T-rich部分氢键的形成。 考虑到上述情况，发明人利用相对强光强度来衡量实验结果。如图2所示，H-DNA和A-DNA 的T-rich部分具有6个G/C碱基的设计相对荧光强度最大。
[0027] -种基于Exo III辅助的循环和DNAzyme循环的双重放大反应检测Hg2+的方法， 步骤如下：
[0028] (1)将发卡结构的H-DNA、A-DNA和待检测的样品加入到TM缓冲溶液中，37°C下孵 育，形成T-Hg2+-T结构；所述H-DNA包含悬垂在3'末端的T-rich部分和封闭在发卡结构 中的DNAzyme部分，T-rich部分含有用于选择性识别Hg2+的T碱基和辅助Hg-Complex形 成的G/C碱基，DNAzyme被封闭在发卡的颈环结构中，所述A-DNA是一条单链结构的DNA，自 5'到3'依次为保护部分、与H-DNA配对的互补部分和与H-DNA的T-rich部分作为识别单 元结合Hg2+的T-rich部分；
[0029] (2)向步骤（1)中得到的反应溶液中加入Exo III，37°C下孵育，进行水解反应后 使ExoIII失活（所述酶失活的方法：将反应溶液在85°C下保持20min，冷却至室温即可）；
[0030](3)将发卡结构的分子信标（MB)、Zn2+和10XHEPES缓冲溶液加入到步骤⑵的 溶液中，37°C下孵育；
[0031] (4)利用荧光光谱仪记录结果。
[0032] 分子信标为具有茎环结构的分子信标，其两端分别标记有荧光基团和猝灭基团， 与DNAzyme杂交，从而引发自身二级裂分，释放焚光信号。
[0033] 所述发卡结构的H-DNA和发卡结构的MB的制备方法，将H-DNA或MB稀释到TM或 HEPES缓冲溶液中，混匀，95°C退火5min，自然冷却至室温即得。
[0034] 所述待检测的样品为水样时的制备方法如下，将待检测的水样经0. 22 y m的滤膜 过滤，将标准Hg2+溶液加入水样中，再向上述水样中加入硝酸酸化，备用。
[0035] -种基于Exo III辅助的循环和DNAzyme循环的双重放大反应检测Hg2+的试剂 盒，包括探针H-DNA、探针A-DNA、Exo III、MB、Zn2+、TM缓冲溶液和HEPES缓冲溶液。
[0036] 所述试剂盒在检测水样中Hg2+污染中的应用。
[0037] 本发明的有益效果：
[0038] 1.本发明设计了一种基于Exo III辅助的目标物循环和DNAzyme切割循环的新型 双重放大荧光方法来灵敏和选择性的检测Hg2+，本发明方法不仅能鉴别水样是否被汞污染 并且能够准确定量其含量。
[0039] 2. T-T碱基错配被引入到此方法中用来特异性的识别Hg2+，实现了高选择性。
[0040] 3.通过有效的将Exo III辅助的目标物循环和DNAzyme切割循环结合起来，此方 法表现出良好的灵敏度，其检测限为7. 2X 10 nm〇l ? L \能够与已报导的借助T-Hg2+-T形 成的荧光放大方法相当。此外，此策略成功地用于污水样品中Hg 2+的检测，其结果具有良好 的精确度和准确度，且能够与电感耦合等离子体质谱的检测结果相比较。所设计的探针无 需引物和特殊的识别位点，大大简化了探针设计。
[0041] 4.本发明方法用到的探针不需要引物和特殊的识别位点。
【附图说明】
[0042] 图1为基于Exo III辅助的目标物循环和DNAzyme切割循环的双重放大荧光策略 用于灵敏检测Hg2+的原理；
[0043] 图2为（A)不同情况下双重放大策略典型荧光发射光谱；(B)聚丙烯酰胺凝胶电 泳表征Exo III辅助的目标物循环；
[0044] 图3为H-DNA和A-DNA中T-rich部分不同数量G/C碱基对荧光信号的影响；
[0045] 图4为不同浓度的Hg2+进行检测来获得方法的线性范围和灵敏度，A :不同浓度 Hg2+的荧光光谱，B为不同浓度的Hg 2+的线性范围；
[0046] 图5为其他金属离子、Hg2+和混合物的相对荧光强度柱状图。
【具体实施方式】
[0047] 下面结合实施例对本发明作进一步说明。
[0048] 试剂和仪器
[0049] 核酸序列由生工生物工程有限公司（中国，上海）合成和纯化；核酸序列的热力学 参数和二级结构由IDT网上工具模拟。含2-5%硝酸的标准汞溶液购自百灵威科技有限公 司（中国，北京）。Exo III购自赛默飞世尔科技公司（中国，上海）。其他药品和试剂（均 为分析纯）购自标准供应商。所有溶液均由超纯水（>18. 25MQ ? cm1)配制。自来水取自 实验室。湖水取自白云湖（中国，济南）。河水取自黄河（中国，济南）。污水样品取自污 水处理厂。
[0050] Hitachi F-7000荧光光谱仪（日立有限公司，日本，东京）被用来记录荧光光谱， 激发和发射狭缝宽度均为5. Onm，激发波长为494nm。520nm处荧光发射强度被用来衡量实 验结果。雷磁PHS-3C型pH计（中国，上海）被用来测量溶液的pH值。Thermo Fisher Scientific X Series 2型电感親合等离子体质谱仪（赛默飞世尔科技公司，德国，不莱 梅）被用来测定实验结果。超纯水通过Millipore Milli-Q净化系统获得。
[0051] 凝胶电泳表征
[0052] 为了形成发卡结构，将H-DNA稀释到TM缓冲溶液中，混匀，95°C退火5min，自然冷 却至室温。对于典型的双重放大实验，3. 0X 10 7mol，L i-DNA, 2. 5X 10 7mol，L l-DNA, 1. 0 X 10 6m〇l *L iHg2+和50U Exo III分别被加入到TM缓冲溶液中，进行反应。15%的聚丙烯 酰胺凝胶在实验室中新鲜制备。在上样之前，反应样品与上样缓冲液溶液按照5:1的体积 比进行混合。聚丙烯酰胺凝胶电泳实验在TBE缓冲体系中进行电泳分离实验。随后，利用 溴化乙锭进行染色，借助紫外成像系统（伯乐公司，美国）进行成像。
[0053] Hg2+检测过程
[0054] 为了获得发卡结构的H-DNA和MB，将H-DNA和MB分别稀释到TM和HEPES缓冲溶 液中，混勾，95 °C退火5min，自然冷却至室温。对于典型的Hg2+检测实验，将制备好的H-DNA、 A-DNA和不同浓度的Hg 2+加入到TM缓冲溶液中，37°C下孵育，形成T-Hg 2+-T结构。随后，向 上述反应溶液中加入50U的Exo III，37°C下孵育，进行水解反应。将反应溶液在85°C下保 持20min，缓慢冷却至室温，使Exo III失活。然后将制备好的MB、Zn2+和10XHEPES缓冲 溶液加入到上述溶液中，37°C下孵育。利用荧光光谱仪记录实验结果，测定的光谱条件为： 激发波长494nm，电压700V，狭缝宽度均为5nm。阴性控制实验所加试剂与阳性相同，但不加 入Hg 2+。所有的实验均重复三次。
[0055] 环境水样的制备
[0056] 自来水、湖水、河水和污水样品分别经0. 22 y m的滤膜过滤来去除不溶性杂质。分 别制备含标准Hg2+浓度为2. 5X 10 9mol ? L 1和8. 0X 10 9mol ? L 1的自来水、湖水和河水样 品。再向上述四种样品中分别加入硝酸酸化，备用。利用双重放大策略和标准电感耦合等 离子体质谱对样品进行检测。
[0057] 本发明方法的可行性分析
[0058] 为了验证此策略的可行性和放大能力，发明人研究了各种情况下反应体系的荧光 发射光谱。如图2A所示，在阴性条件下，荧光强度非常低（curve c)，表明当目标物不存在 时，H-DNA与A-DNA之间几乎不会发生相互作用，这是由于在它们的T-rich部分存在T-T 错配碱基。当目标物存在时，荧光强度有所增加（curve b)，这是因为通过T-Hg2+-T金属碱 基对的形成，链置换反应能够释放出悬垂的DNAzyme序列。当Exo III被引入来进行消化 反应后，荧光强度会显著增强（curve a)，表明