Exo III能够通过目标物循环来有效的扩 增信号。然而，当体系中缺少H-DNA或A-DNA时，荧光强度（curve d和curve e)比阴性信 号（curve c)稍低，这就更加确定了增强的荧光信号是由Hg2+与H-DNA和A-DNA之间的相 互作用产生。此外，聚丙烯酰胺凝胶电泳实验被用来证实所提出的策略。如图2B所示，条 带1和条带2分别仅含有H-DNA和A-DNA。条带3含有H-DNA和A-DNA，并没有产生新的亮 带，表明H-DNA与A-DNA之间很难发生相互作用。然而，当Hg 2+存在时，如条带4所示，产生 了新的亮带为DNAzyme序列，并且A-DNA的亮度几乎与条带2中相同。这一结果表明，Exo III能够催化Hg-Complex中部分H-DNA水解，产生A-DNA用于另一个杂交反应和DNAzyme 来进行循环切割，此为双重信号放大策略。
[0059] 本发明方法用到的DNA探针设计
[0060] 本发明的关键点在于H-DNA与A-DNA之间双链结构的形成，此双链结构包括Hg 2+ 介导的金属碱基对和邻近的沃森-克里克碱基对。因此，特异性的形成H-DNA与A-DNA之间 的T-Hg2+-T碱基对与邻近的碱基有关11。在这一观点的基础上，发明人设计了六种T-rich 部分具有不同G/C碱基数量的DNA探针，研究并获得了最佳设计。如图3所示，随着G/C碱 基个数的增加，阳性体系的荧光强度逐渐增加，当G/C碱基个数达到6个后趋于平衡，这是 由于随着G/C碱基个数的增加，Hg-Complex越容易形成。比较阴性结果，当G/C碱基个数 从3增加到6时，信号略微增加；而当G/C碱基个数从6增加到8时，信号显著增长，因为 H-DNA与A-DNA之间T-rich部分氢键的形成。考虑到上述情况，发明人利用相对强光强度 来衡量实验结果。如图2所示，H-DNA和A-DNA的T-rich部分具有6个G/C碱基的设计相 对荧光强度最大。因此，申请人选择此设计来进行后续实验。
[0061] 本发明方法的灵敏度
[0062] 在最优实验条件下，发明人对不同浓度的Hg2+进行检测来获得方法的线性范围和 灵敏度。不同浓度Hg 2+的荧光光谱在图4A中展示出来。随着目标物浓度的增加，荧光强 度显著增加。如图4B所示，相对荧光强度与2. OXK^Vol .L1到1.0X10 smol .L1范围 的目标物呈良好的线性关系，其相关系数为0. 998。根据35规则，计算Hg2+的检测限为 7. 2X 10 nm〇l ? L \与已报导的荧光放大策略检测Hg2+的方法相当。高灵敏度的获得依赖 于基于Exo III辅助的目标物循环和DNAzyme切割循环的双重放大策略，此策略依赖于特 殊设计的DNA探针，而这些探针不需要引物和特殊的识别位点。
[0063] 本发明方法的选择性
[0064] 本发明方法用于Hg2+检测的选择性通过测定Hg 2+、其他金属离子 (K+，Ba2+，Zn2+，Ni 2+，Co2+，Pb2+，Cr3+，Ag+)和混合物来验证。图5展示的为其他金属离子、Hg 2+ 和混合物的相对荧光强度柱状图。Hg2+检测体系信号显著，而其他金属离子相对强度较低， 这就表明此策略对于Hg 2+具有良好的选择性，这是由于特殊的T-Hg2+-T的形成。进一步来 说，混合物的信号强度与仅含Hg 2+体系的信号强度相当。这就表明，此方法具有检测环境水 样的潜力。
[0065] 环境水样中Hg2+的检测
[0066] 本发明方法的应用通过研究标准加入的Hg2+在自来水、湖水和河水样品中的回收 率来验证。如表1所示，所提策略的精密度和回收率均令人满意。随后，污水样品的信号响 应也在表1中列出来。污水中Hg 2+的含量能够通过双重放大策略精确定量，且几乎不受背 景干扰。为了确保双重放大策略的准确度和可靠性，水样中Hg 2+含量通过标准电感耦合等 离子体质谱进行定量。数据显示，双重放大策略与电感耦合等离子体质谱的测定结果无明 显差别。此结果进一步证实，发明人所提出的双重放大策略能够鉴别水样是否被汞污染并 且能够准确定量其含量。因此，此策略能够成功地用于水样中Hg 2+的分析。
[0067] 表1.双重放大策略和电感耦合等离子体质谱检测环境水样中Hg2+的比较
[0068]
[0069] 上述虽然结合实施例对本发明的【具体实施方式】进行了描述，但并非对本发明保护 范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员 不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。
【主权项】
1. 一种双重放大反应方法，其特征是：Hg 2+存在时，其与颈环结构探针和单链探针中 T-T错配碱基相互作用，形成Hg2+介导的金属碱基对，加入Exo III后释放出Hg 2+、DNAzyme 和单链探针，自由的Hg2+和单链探针引发与颈环结构探针之间的杂交反应，产生大量的 DNAzyme序列，完成信号一级放大；DNAzyme催化分子信标裂分释放荧光信号，并重新释放 DNAzyme，进行信号的二级放大；当Hg 2+不存在时，颈环结构的探针与单链探针的T-rich部 分存在T-T碱基错配，不产生自由的DNAzyme序列来产生信号。2. 如权利要求1所述的方法，其特征是：所述探针H-DNA和A-DNA的T-rich部分的G/ C碱基个数为3、4、5、6、7或8个。3. 权利要求1或2所述的方法在检测Hg 2+中的应用。4. 一种基于Exo III辅助的循环和DNAzyme循环的双重放大反应检测Hg 2+的方法，其 特征是：步骤如下： (1) 将H-DNA、A-DNA和待检测的样品加入到TM缓冲溶液中孵育，形成T-Hg2+-T结构；所 述H-DNA包含悬垂在3'末端的T-rich部分和封闭在发卡结构中的DNAzyme部分，T-rich 部分含有用于选择性识别Hg 2+的T碱基和辅助Hg-Complex形成的G/C碱基，DNAzyme被封 闭在发卡的颈环结构中，所述A-DNA是一条单链结构的DNA，自5'到3'依次为保护部分、与 H-DNA配对的互补部分和与H-DNA的T-rich部分作为识别单元结合Hg 2+的T-rich部分； (2) 向步骤（1)中得到的反应溶液中加入Exo III孵育后，使Exo III失活； (3) 然后将步骤（2)的溶液中加入分子信标，进行信号检测。5. 如权利要求4所述的方法，其特征是：所述步骤（1)中H-DNA的发卡结构是将H-DNA 稀释到TM缓冲溶液中，混匀，95°C退火5min，自然冷却至室温得到。6. 如权利要求4所述的方法，其特征是：所述待检测的样品为水样。7. 如权利要求4所述的方法，其特征是：所述水样经0. 22 y m的滤膜过滤，加入标准 Hg2+溶液，再加入硝酸酸化，备用。8. 如权利要求4所述的方法，其特征是：所述步骤⑵中Exo III失活的方法为将反 应溶液在85°C下保持20min，冷却至室温即可。9. 一种基于Exo III辅助的循环和DNAzyme循环的双重放大反应检测Hg 2+的试剂 盒，其特征是：包括探针H-DNA :包含悬垂在3'末端的T-rich部分和封闭在发卡结构中的 DNAzyme部分，T-rich部分含有用于选择性识别Hg 2+的T碱基和辅助Hg-Complex形成的 G/C碱基，DNAzyme被封闭在发卡的颈环结构中；探针A-DNA :A-DNA是一条单链结构的DNA， 自5'到3'依次为保护部分、与H-DNA配对的互补部分和与H-DNA的T-rich部分作为识别 单元结合Hg 2+的T-rich部分；Exo III ;分子信标：具有莖环结构的分子信标，其两端分别 标记有荧光基团和猝灭基团，与DNAzyme杂交，从而引发自身二级裂分，释放荧光信号和标 准Hg 2+溶液。10. 如权利要求9所述的试剂盒在检测水样中Hg2+污染中的应用。
【专利摘要】本发明公开了ExoIII辅助的循环和DNAzyme循环的双重放大反应用于Hg2+检测，当Hg2+存在时，H-DNA和A-DNA中的T-rich部分形成T-Hg2+-T金属碱基对，H-DNA与A-DNA杂交，引发链置换反应，形成Hg2+介导的含有悬垂的保护部分和DNAzyme部分的双链结构(称为Hg-Complex)。在ExoIII的作用下，Hg2+和A-DNA被释放出来，与另一个H-DNA杂交，进行循环，得到大量的DNAzyme序列。得到的DNAzyme序列能够循环切割分子信标，产生放大的信号。通过两种循环的有效结合，这一策略能够灵敏的检测水溶液中的Hg2+，并且实现了高选择性。同时，此方法能够成功地用于污水中Hg2+的检测，为环境水样中Hg2+的定量检测提供了潜在的工具。
【IPC分类】C12Q1/44
【公开号】CN105132524
【申请号】CN201510624187
【发明人】姜玮, 王磊, 魏海平
【申请人】山东大学
【公开日】2015年12月9日
【申请日】2015年9月25日