一种鉴定牦牛肉真伪的检测方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种鉴定牦牛肉真伪的检测方法，属于分子生物学检测领域。
【背景技术】
[0002]肉是我们人类优质蛋白质和多种营养素的主要来源，含有丰富的必须氨基酸和多种微量元素。近年来，肉的掺假和欺诈行为越来越受到人们的关注。在“马肉风波”事件之前，国内早已爆出应用化学药物处理的“假鱼翅”、以及牛肉膏处理的猪肉或鸭肉冒充牛肉等事件。这不仅涉及到食品掺假欺诈的商业行为而且涉及到民族和宗教信仰问题。因此，基于经济和宗教方面的考虑，肉的物种鉴定具有非常重要的意义。另一方面，对加工食品而言，物种的原始可识别形态特征消失，使得物种的鉴别变得相对困难。目前关于肉的物种鉴定方法有:感官分析，解剖和组织学鉴定，显微技术，化学方法，电泳法，色谱法以及免疫学技术等方法。但是，因加工后的肉品大多已改变其原始形态，采用这些方法通常不能做出正确判断。目前迫切需要一些更灵敏和可靠的检测方法来鉴定动物食品或动物源性加工食品的物种来源。
[0003]正是在这样的背景下，发展了各种基于DNA的分子鉴定技术，如，PCR、PCR-RFLP,Real-time PCR、DNA条形码技术等。尽管目前的分子技术已经用于许多肉的物种鉴定，如猪肉，鸭肉，鸡肉，鹅肉，牛肉，鹿肉，鱼肉等。
[0004]牦牛(Bos grunniens)是青藏高原及紙邻地区生活的独特畜种，是我国的主要牛种之一，目前的牦牛总数量大约为I千4百万头，这些牦牛为当地牧民提供约90%的奶和50%的肉，是西部藏区经济支柱，也是西部藏区少数民族的主要生产生活资料。牦牛肉质鲜美，品质优良，蛋白质含量高，矿物质丰富，脂肪少，且脂肪中胡萝卜素含量丰富，是广受消费者青睐的天然绿色食品。但是，基于牦牛肉的稀少和人们需求的增多，牦牛肉的价格也变得相对昂贵，这样一来，为了经济利益，不法商贩利用其它肉类加工后充当牦牛肉在市场上进行销售，严重损害了消费者的权益，也带来了诸多的食品安全隐患。如何进行牦牛肉的真伪鉴定显得非常重要。目前，关于牦牛肉真伪鉴定技术方面的研究报道还不多，国内外报道的文献也只有寥寥几篇，大多数采用的是PCR-RFLP方法，因此，还需要不断开发新的更加快速的方法。
[0005]基于以上的分析和目前迫切的需求，本发明采用常规PCR技术进行牦牛肉物种的真伪鉴定，开发了一种快速鉴定牦牛肉真伪的技术。为目前市场上售卖的牦牛肉及其制品的监督提供急需的技术支持，也为消费者的利益提供技术保障，将具有良好的应用前景和推广价值。
【发明内容】
[0006]为了解决现有技术中的缺乏和不足，本发明的目的是提供一种能鉴定出牦牛肉真伪的检测方法。
[0007]为达到上述目的，本发明所采用的技术手段是: 一种能快速鉴定出牦牛肉真伪的检测方法，
步骤一、DNA提取:将新鲜的动物肌肉组织取下一小块，切碎后放入研钵中加入液氮，快速将组织在液氮中捣碎并研磨成细粉；取0.6g细粉于2ml的EP管中，加入TE缓冲液共480μ?，放入 68°C水浴 10 min，加入 53μ? 的 10% SDS, ΙΟμ? 的 10mg/mL 的蛋白酶 K，68°C水浴15 min，取出后加入 87μ? 的 5 mol/L NaCl，以及 70μ? 的 CTAB/NaCl，68°C水浴 15min，_20°C放置30 min，取出加入等体积的24:1的氯仿/异戊醇混勾，离心取上清；重复上述步骤一次；最后用2倍体积的冰的无水乙醇混匀，-20°C静置30 min，离心去上清，沉淀用70%的乙醇洗涤，干燥，沉淀溶于50 PL双蒸水中，使用超微量核酸蛋白质测定仪，将DNA浓度稀释至lOOng/^L左右作为模板。
[0008]步骤二、PCR=PCR扩增采用20 μ?的体系，DNA模板I μ?，不含Mg2+的10XPCR缓冲液 2 μ?，浓度为 25 mmol/L 的 MgCl2L 6 μ?，浓度为 2.5 mmol/L dNTPs 1.2 μ?，牦牛肉特征引物Yak-F和Yak-B的10Mmol/L混合物1PL，5U/^L的Taq DNA聚合酶0.2 μ?，加超纯水补充至20 μ? ；PCR扩增反应程序为:94°C预变性5 min ;94°C变性40 s，60°C退火50 s，72°C延伸40 s;35个循环；最后72°C延伸8 min ;4°C保存。
[0009]步骤三、电泳检测:取10 μ? PCR产物与WL的6 X Loading buffer (上样缓冲液)混合，1.0%的琼脂糖凝胶上进行点样，120V条件下电泳40min，然后采用凝胶成像系统拍照。
[0010]步骤四、结果鉴定:观察电泳结果，牦牛肉的扩增片段大小为1003bp，如有上述大小的片段，则认为结果为阳性，样品是牦牛肉；如无上述大小片段，则认为是阴性，样品不是牦牛肉。
[0011]进一步，所述步骤一中TE 缓冲液为 10 mmol/T, Tris.Cl，I mmol/L EDTA，pH 8.0 ；CTAB/NaCl 为 1% CTAB，0.73 moL/L NaCl0
[0012]进一步，所述步骤二中牦牛肉特征引物10 Mmol/L混合物，上游序列为:Yak_F_5’-GACCTTCCAGCTCCATCAAACAITTCATCATGG-3’ ；下游序列为:Yak-B_5’ -CTAGTTGTCCAATGATAATGTATG-3’，扩增长度为 1003bp。
[0013]进一步，所述步骤三中的1.0%的琼脂糖凝胶中添加有?μ?的Goldview核酸染料。
[0014]本发明的有益效果在于:本发明设计的引物只是针对牦牛物种的细胞色素b基因序列进行特异性扩增，其它哺乳动物不能扩增出来，并且采用普通PCR即可进行牦牛肉的鉴定，不需要进行酶切和测序。本发明操作方便，检测时间短，具有很好的应用前景，满足于市场监督检测。
[0015]【具体实施方式】I
为了便于直观理解本发明的技术方案，在四川红原县采集新鲜牦牛样品9份，按照上述方法进行检测。
[0016]1、DNA 提取
将新鲜的动物肌肉组织取下一小块，切碎后放入研钵中加入液氮，快速将组织在液氮中捣碎并研磨成细粉；取0.6g细粉于2ml的EP管中，加入TE缓冲液共480μ?，放入68°C水浴10 min，加入53μ?的10% SDS，10μ?的10mg/mL的蛋白酶K，68°C水浴15 min，取出后加入 87μ? 的 5 mol/L NaCl,以及 70μ? 的 CTAB/NaCl，68°C水浴 15min，-20°C放置 30 min，取出加入等体积的24:1的氯仿/异戊醇混匀，离心取上清；重复上述步骤一次；最后用2倍体积的冰的无水乙醇混匀，_20°C静置30 min，离心去上清，沉淀用70%的乙醇洗涤，干燥，沉淀溶于50μ?双蒸水中，使用超微量核酸蛋白质测定仪，将DNA浓度稀释至10ng/μ L左右作为模板。
[0017]2、PCR
PCR扩增采用20 μ L的体系，DNA模板I μ?，不含Mg2+的10XPCR缓冲液2 μ?,浓度为25 mmol/L的MgCl2L 6 μ?，浓度为2.5mmol/L dNTPs 1.2 μ?，牦牛肉特征引物Yak-F和Yak-B的10 Mmol/L混合物?μ?，5U/^L的Taq DNA聚合酶0.2 μ?，加超纯水补充至20 μ? ；PCR扩增反应程序为:94°C预变性5min ;94°C变性40s，60°C退火50s，72°C延伸40s;35个循环；最后72°C延伸8min;4°C保存。
[0018]3、电泳检测
取10 μ? PCR产物与WL的6XLoading buffer (上样缓冲液)混合，1.0 %的琼脂糖凝胶上进行点样，120V条件下电泳40min，然后采用凝胶成像系统拍照。
[0019]4、结果鉴定
观察电泳结果，上述9份牦牛肉的扩增片段大小都为1003bp，结果为阳性，9份样品证实都是牦牛肉，结果见附图1。
[0020]【具体实施方式】2
为了便于直观理解本发明的技术方案，在市场上采集新鲜牛肉，鸡肉，猪肉，鸭肉，兔肉，羊肉和牦牛肉按照上述方法进行检测。
[0021]1、DNA 提取
将新鲜的动物肌肉组织取下一小块，切碎后放入研钵中加入液氮，快速将组织在液氮中捣碎并研磨成细粉；取0.6g细粉于2ml的EP管中，加入TE缓冲液共480μ?，放入68°C水浴10 min，加入53μ?的10% SDS，ΙΟμ?的10mg/mL的蛋白酶K，68°C水浴15 min，取