一种基于核糖体dna its1基因检测华支睾吸虫囊蚴的pcr扩增试剂盒及扩增引物的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及寄生虫检测技术领域，特别涉及一种基于核糖体DNA ITS1基因检测华 支睾吸虫囊蝴的PCR扩增试剂盒及扩增引物。
【背景技术】
[0002] 华支睾吸虫病（Clonorchiasis)是由于感染华支睾吸虫（Clonorchis sinensis， Cs)引起的食源性人兽共患寄生虫病，严重危害人类的健康。该病主要分布在东亚、东南亚 和东欧的部分国家，如中国、韩国、老挝和越南等。据统计全球约有3 500万人感染这种吸 虫，其中1500万人分布在我国的各个省市区（除内蒙古、青海、西藏和新疆外均有发现）， 以广东、广西和东北三省尤为严重。目前，华支睾吸虫的鉴定方法还没有统一的标准，目前 对华支睾吸虫囊蝴的诊断依赖于显微镜检查。众所周知，显微镜检查耗费时间长，检查效率 低，对检查者临床工作经验要求较高，而且对于与华支睾吸虫亲缘关系相近的囊蝴，虫卵形 态相似，普通光镜无法区分，使用这种方法往往会出现误判。免疫诊断法虽然较显微镜检查 法效率高，但也常常为灵敏度和特异性所局限。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的在于提供一种基于核糖体DNA ITS1基因检测华支睾吸虫囊蝴的 PCR扩增试剂盒，灵敏度高，特异性强，检测快速、准确，为华支睾吸虫感染的诊治和预防提 供有效的技术手段。
[0004] 本发明还提供了一种基于核糖体DNA ITS1基因检测华支睾吸虫囊蝴的扩增引物， 特异性强。
[0005] 本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
[0006] -种基于核糖体DNA ITS1基因检测华支睾吸虫囊蝴的PCR扩增试剂盒，包括 PCR扩增反应液，所述PCR扩增反应液包括：Tris-HCl 10mmol/L，KC1 50mmol/L，MgCl2 1. 5mmol/L, dNTPs 0. 8mmol/L,正向引物 0? 4 y mol/L，反向引物 0? 4 y mol/L，DNA 模板 20ng/ 1^，了39酶 0.0751]/1^。
[0007] 本发明以华支睾吸虫核糖体DNA内转录间隔区（ITS)基因-ITS1为目标，专门设 计了针对性的特异性引物，进一步的设计了检测试剂盒，检测结果特异，结果易判断，灵敏 度高，特异性强，检测快速、准确，为华支睾吸虫感染的诊治和预防提供有效的技术手段。
[0008] 作为优选，所述正向引物序列为：5' -CTAGTTCCGTCATCTGTCTTGC-3'（SEQ ID NO. 1) 〇
[0009] 作为优选，所述反向引物序列为：5' -ACCGAGGCGTTATCAGTCGTA-3'（SEQ ID NO. 2)。
[0010] 作为优选，所述Tris-HCl的pH为8. 3。
[0011] -种基于核糖体DNA ITS1基因检测华支睾吸虫囊蝴的扩增引物所述扩增引物包 括正向引物和反向引物，所述正向引物序列为：5'-CTAGTTCCGTCATCTGTCTTGC-3'（SEQ ID NO. 1)，所述反向引物序列为：5'-ACCGAGGCGTTATCAGTCGTA-3'（SEQ ID NO. 2)。采用本发明 设计的特异性扩增引物，检测灵敏度高，特异性强。
[0012] 本发明的有益效果是：灵敏度高，特异性强，检测快速、准确，为华支睾吸虫感染的 诊治和预防提供有效的技术手段。
【附图说明】
[0013] 图1是本发明试剂盒对华支睾吸虫DNA的PCR扩增结果图，
[0014] 图中：M : 100bp DNA marker，1-2:目的扩增条带。
[0015] 图2是本发明试剂盒的特异性试验结果图，
[0016] 图中：M :100bp DNA marker ;1:目的扩增条带；2-4:简单异尖线虫、刺激隐核虫和 棘颚口线虫。
[0017] 图3是本发明试剂盒的敏感性试验结果图，
[0018] 图中：M :100bp DNA Marker ;1 :40ng/ y L华支睾吸虫 DNA ;2 :4ng/ y L 华支睾吸虫 DNA ;3 :400pg/ y L华支睾吸虫DNA ;4 :40pg/ y L华支睾吸虫DNA ;5 :4pg/ y L华支睾吸虫 DNA ;6 :0? 4pg/ y L 华支睾吸虫 DNA。
【具体实施方式】
[0019] 下面通过具体实施例，并结合附图，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。
[0020] 本发明中，若非特指，所采用的原料和设备等均可从市场购得或是本领域常用的。 下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。
[0021] 本发明实施如下：
[0022] 1、材料与方法
[0023] 1. 1 材料：
[0024] 囊蝴和华支睾吸虫DNA阳性对照来源：2013年5月底采集舟山市场上销售的麦穗 鱼，用消化法从鱼肉组织中分离获得华支睾吸虫囊蝴。华支睾吸虫DNA阳性对照品由舟山 出入境检验检疫局提供。简单异尖线虫、刺激隐核虫和棘颚口线虫由舟山出入境检验检疫 局提供。
[0025] dNTPs、Taq酶均购自大连宝生物公司。
[0026] 1. 2 方法
[0027] 1. 2. 1囊蝴的分离
[0028] 将麦穗鱼用清水洗净，去除鱼头、鱼尾、鱼鳍、鱼刺及内脏，将鱼肉用绞肉机加工 成肉泥，放入玻璃杯。按每克鱼肉加入10mL人工胃液（盐酸浓度为8mL/L，胃蛋白酶浓 度8g/L，氯化钠浓度为9g/L)，37°C孵箱作用2h，将消化完全的鱼肉消化液经80目分离筛 过滤集中于2L的分液漏斗中沉淀0. 5h，放出约300mL的消化液至500mL的烧杯中，沉淀 10-30min后，弃去上面的浊液，用清水反复清洗至液体清亮，随后将含虫体的液体转移至 15mL尖底离心管内，沉淀lmin后将含囊蝴的上清液体吸至另一新管内，反复沉淀几次，显 微镜下检查囊蝴纯净度。将剩余的囊蝴保存在Alsever' s溶液（Alsever's Solution，市 售）中，置于4°C冰箱备用。
[0029]1. 2. 2囊蝴的形态学和DNA提取
[0030] 取少量上述收集到的囊蝴置于显微镜下观察，并对其进行了形态学鉴定。随后按 照Takara universal Genomic DNA Extraction kit (市售，购自大连宝生物公司）说明书 中提供的方法提取囊蝴的基因组DNA。
[0031] 1.2.3引物设计与合成
[0032] 针对华支睾吸虫rDNA ITSl(GenBank:KF740423)基因序列设计特异性引物1 对：正向引物序列为：5' -CTAGTTCCGTCATCTGTCTTGC-3'（SEQ ID NO. 1)，反向引物序列为： 5'-ACCGAGGCGTTATCAGTCGTA-3'（SEQ ID N0. 2)。引物设计采用 DNASTAR5. 0 软件程序设计 完成，由生工生物（上海）有限公司合成，对上述2. 2提取的DNA进行PCR扩增，获得528kb 目标产物。
[0033] 1.2.4目的基因扩增与序列测定
[0034] 20 y L的PCR反应体系中组分如下：
[0035] pH8. 3 的 Tris-HCl 10mmol/L, KC1 50mmol/L, MgCl2 1. 5mmol/L, dNTPs 0. 8mmo 1 / 1，正向引物（5￡0 10勵.1)0.4以111〇1/1，反向引物（5￡0 10勵.2)0.411111〇1/1，0嫩模板 (1. 2. 2 节提取获得）20ng/ y L，Taq 酶 0? 075U/ y L，ddH20 补足至 20 y L。
[0036] PCR 扩增条件：94°C 5min - 94°C 30sec，（54。(：、56。(：