一种抗泡球蚴囊壁组织(生发层、角皮层)单克隆抗体的制备和应用的制作方法
【专利摘要】本专利公布一种抗泡球蚴囊壁组织(生发层、角皮层)单克隆抗体的制备和应用。多房棘球绦虫的幼虫泡球蚴寄生在人体可引起多房包虫病又称泡球蚴病，其主要寄生在肝脏，常与肿瘤等病变混淆。本发明涉及泡球蚴病的科学研究、诊断和治疗领域，提供了一种鼠源性杂交瘤细胞株，其分泌的单克隆抗体可与泡球蚴囊壁组织(角皮层、生发层)特异性结合，以及利用此抗体对此种疾病病理组织进行免疫组化特异性染色的方法。抗体效价达到1∶105，并具有很强的敏感性和特异性。此抗体可用于对泡球蚴病进行免疫病理诊断，还可利用该单克隆抗体与化疗药物或放射性核素偶联，制成的靶向药物和诊断试剂，或用于泡球蚴相关的科学研究。
【专利说明】一种抗泡球蚴囊壁组织(生发层、角皮层)单克隆抗体的制备和应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物技术及细胞工程领域。涉及分泌抗泡球蝴囊壁组织单克隆抗体的杂交瘤细胞株和由其分泌的抗体，及其在多房包虫病(泡球蝴病)诊断和治疗上的应用。
【背景技术】
[0002]多房包虫病(Multilocular hydatid disease)又称泡球蝴病,是多房棘球绦虫的幼虫泡球蝴寄生在人体所引起的寄生虫病。多房包虫病主要流行于西部地区的牧区和半农半牧区，以新疆、青海、甘肃、宁夏、西藏、内蒙和四川西部最为严重。给当地的经济造成了极大的损失。多房棘球绦虫的成虫寄生在狐狸、犬等终宿主的小肠中，当啮齿动物、人吞食随终宿主粪便排出的虫卵，虫卵中的六钩蝴在中间宿主的小肠内孵出并钻入肠壁进入血循环，到达肝脏，发育为泡球蝴。在形态上，泡球蝴为大小不一，直径0.1~Imm的小囊泡集聚而成，囊壁结构分为角皮层和生发层，其角皮层较薄，与宿主组织之间没有很明显的间隔，通过外生性出芽生长和内生性隔膜形成在肝脏中呈浸润性生长，使肝脏遭到广泛破坏。还可经淋巴、血行转移扩散，造成极坏的预后。由于泡球蝴病早期不易被发现，当发生明显的肝功损害时，往往虫体已在肝脏广泛蔓延并发生转移，所以手术切除率仅为20~30%，不经治疗，5年和10年病死率分别为70%和93%，有“虫癌”之称。由于本病的临床表现酷似肝癌，故在诊断中须注意与肝癌的鉴别诊断。
[0003]泡球蝴病的诊断及治疗，是流行区各级、各类医疗机构所面临的实际问题。目前的诊断多借助于流行病学史调查、临床表现、影像检查。在临床上虽有B超和各种免疫学实验辅助，但其误诊率依然很高。在大样本的病例报告中术前误诊率为24.3%，前苏联相关报道为26.8%。该疾病的临床确诊，依赖于手术中所取标本的病理学诊断，但现行的病理诊断只是通过对虫体的形态加以辨别来完成，易和单房包虫病及其肝脏肿瘤混淆而误诊。若要确诊，最好使用免疫组织化学的方法。但一直缺乏使用免疫组织化学法所需要的具有很强特异性和敏感性的单克隆抗体，而无法开展。
[0004]在针对泡球蝴病进行的科研工作中，也常常需要能和泡球蝴囊壁组织特异性结合的抗体作为研究工具，来确定泡球蝴的定性定位情况。抗泡球蝴单克隆抗体也是进行革巴向药物的研究工作中必不可少的工具。
[0005]本发明为临床和科研机构提供了抗泡球蝴囊壁组织的特异性单克隆抗体，它既可用于免疫组化试验对病理标本进行临床诊断，也可为包虫研究部门提供便利的研究工具，还可以用作靶向药物的引导结合部位，在多房包虫病的诊断、治疗中有广泛的应用价值。
【发明内容】
[0006]1、本发明的目的是提供能分泌抗泡球蝴囊壁组织(生发层、角皮层)特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
[0007]2、本发明的另一目的是提供由上述细胞株分泌的抗泡球蝴囊壁组织(生发层，角皮层)的特异性单克隆抗体。
[0008]3、本发明的另一目的是上述单克隆抗体在多房包虫病诊断和治疗上的可能应用。
[0009]根据目的一，通过杂交瘤技术采用Balb/C小鼠脾细胞与SP2/0细胞融合建立杂交瘤细胞株。其特征为:由泡球蝴囊壁抗原免疫刺激后的Balb/C小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞株SP2/0细胞融合形成的鼠-鼠杂交瘤细胞，能在体外长期生长和稳定传代。能稳定分泌抗泡球蝴囊壁组织的特异性单克隆抗体。其染色体数目见图1。
[0010]根据目的二，由上述细胞可以通过体外培养法、动物体内诱生腹水法制备单克隆抗体。其中以小鼠体内腹水法所制备的单克隆抗体为IgG，效价为1: 1X105。
[0011]根据目的三，制备了泡球蝴免疫组化试剂盒。利用上述小鼠体内腹水诱生的单克隆抗体稀释10万倍进行免疫组化染色，可见泡球蝴囊壁组织(角皮层、生发层)着色，见图
2。同等条件下对单房包虫幼虫(细粒棘球蝴)组织染色不着色，见图3，与水泡带绦虫幼虫(细颈囊尾蝴)组织不着色，见图4，与虫体寄生的宿主组织不着色，见图3。说明本单克隆抗体具有很强的特异性和敏感性。
【专利附图】
【附图说明】
[0012]图1杂交瘤细胞染色体Giemsa染色对所制备的杂交瘤细胞株在细胞分裂中期进行Giemsa染色,显示染色体,杂交瘤细胞平均染色体个数为98,表明该细胞株是小鼠骨髓瘤细胞和脾细胞的融合体。
[0013]图2制备的单克 隆抗体对泡球蝴囊壁组织进行的免疫组织化学染色结果利用上述小鼠体内腹水诱生的单克隆抗体稀释10万倍进行免疫组化染色，可见泡球蝴囊壁组织(角皮层、生发层)着色，原头蝴和宿主组织未着色。
[0014]图3制备的单克隆抗体对单房包虫幼虫(细粒棘球蝴)组织免疫组织化学染色结果同等条件下对单房包虫幼虫(细粒棘球蝴)组织进行免疫组化染色，细粒棘球蝴组织不着色。
[0015]图4制备的单克隆抗体对水泡带绦虫幼虫(细颈囊尾蝴)组织免疫组织化学染色结果同等条件下对水泡带绦虫幼虫(细颈囊尾蝴)组织进行免疫组化染色，细颈囊尾蝴组织不着色。
【具体实施方式】
[0016]实施例1-建立细胞株
[0017]1.抗原制备
[0018]材料:泡球蝴感染的沙鼠，培养皿、手术器械、50ml圆底离心管消毒备用、0.9%氯化钠注射液，组织匀浆机(宁波新芝XHF-D)，细胞超声波粉碎仪(宁波新芝JY92-1I)。
[0019]步骤:采用泡球蝴感染的沙鼠乙醚过度麻醉致死。75%乙醇浸泡15分钟体表消毒。按解剖层次开腹。剪取腹腔内的生长良好的泡球蝴虫体组织放入培养皿中加入0.9%氯化钠注射液6ml。用眼科剪小心去除虫体表面的宿主组织和血管。取15g处理好的包虫组织放入50ml离心管中。
[0020]用组织匀浆机2800转3分钟破碎组织。2000转10分钟离心。去除上清。加入
0.9%氯化钠注射液25ml混匀离心，去除上清，反复3次。以洗去泡球蝴囊液。加入15ml0.9%氯化钠注射液放入细胞超声波粉碎仪在冰浴中超声粉碎细胞600w，20分钟，提取囊壁蛋白。用考马斯亮蓝法测量所获混悬液蛋白浓度。并调到200ug/ml的浓度备用。
[0021]2.免疫小鼠
[0022]材料:试验I所准备的虫体囊壁抗原混悬液、选择与所用骨髓瘤细胞同源的Balb/c健康雌性小鼠(购自四川大学华西医学中心试验动物中心)，鼠龄在8~12周。福氏完全佐剂(sigma公司)、福氏不完全佐剂(sigma公司)
[0023]步骤:初次免疫:虫体囊壁抗原混悬液加等体积福氏完全佐剂，乳化到滴水不化即可做小鼠背部皮下多点注射，注射体积500 μ l (50ug抗原)/只小鼠，三周后进行第二次免疫。
[0024]第二次免疫:取体囊壁抗原混悬液，加等体积福氏不完全佐剂乳化到滴水不化即可做小鼠背部皮下多点注射，注射体积500μ l(50ug抗原)/只小鼠。三周后进行第三次免疫。
[0025]第三次免疫:取体囊壁抗原混悬液稀释一倍，做小鼠背部皮下多点注射，注射体积500 μ I (50ug抗原)/只小鼠。
[0026]加强免疫:采上述小鼠尾静脉血离心取血清测效价(用ELISA方法检测)，效价达一万以上的小鼠融合前三天取囊壁抗原混悬液加强免疫，腹腔注射体积500μ UlOOug抗原)/只。
[0027]3.饲养细胞的制备
[0028]材料:Balb/c小鼠4只、消毒备用的手术器械、超净工作台、RPM1-1640基础培养液(赛墨飞公司)完全培养液:RPM1-1640基础培养液40ml加入IOml小牛血清(民海生物公司)。HAT选择培养液:完全培养液49ml加入1ml 50倍HAT储备液(sigma公司)
[0029]步骤:将Balb/c小鼠拉颈脱日处死，浸泡于75%酒精5分钟，随即放入超净工作台内，腹部朝上放于平皿内或固定于解剖板上。用眼科镊子夹起小鼠腹部皮肤，用剪刀剪一小口，注然后用剪刀向上下两侧做钝性分离，充分暴露腹膜。用酒精棉球擦拭腹膜消毒。用注射器吸取5ml RPM1-1640基础培养液，注入小鼠腹腔，注射器停留不动，反复抽吸儿次。用原注射器抽回腹腔内液体,注入离心管。如此反复操作3~4次。1000rpm离心10min，弃上清。用适量HAT选择培养液重悬细胞并稀释I X 105/ml, 100 μ I/孔滴加到培养板，共铺板12块。
[0030]4.骨髓瘤细胞的准备
[0031]骨髓瘤细胞选取SP2/0细胞购自四川大学华西医学中心临床免疫实验室。试验前经过8-氮鸟嘌呤(sigma公司)筛选。放入100mL培养瓶中扩大培养。试验时选取处于对数生长期的形态良好的，活细胞计数超过95%的骨髓瘤细胞。将之完全吹下，转移到50ml离心管中，加RPMI1640至30ml, 1500~2000rpm离心5分钟，弃上清，共洗涤2次，加RPMI1640至20ml计数，取2 X IO7个细胞待用。
[0032]5.脾细胞制备
[0033]取加强免疫小鼠一只，眼眶采血后脱白处死，在75%酒精中消毒后取脾脏，在无菌条件下取出脾脏，去除结缔组织，用不完全的培养液洗一次，置培养皿中不锈钢筛网上，用注射器针芯研磨成细胞悬液后。转移到50ml离心管中，加1?^11640至301111，1500~2000rpm离心5分钟，弃上清，共洗涤2次，加RPMI1640至20ml，计数为I X IO8个细胞待用。[0034]6.细胞融合
[0035]材料:水浴锅、50ml离心管、离心机、5~IOml吸管、Iml吸管、细胞计数板。细胞融合剂:PEG分子量为4000 (merek公司)，二甲基亚砜，RPMI1640培养液三者混合，使PEG浓度为50%，二甲基亚砜浓度为5%，调pH值到7.8高压灭菌。PMI1640基础培养液RPMI1640
完全培养液HAT培养液。
[0036]步骤:将骨髓瘤细胞与脾细胞按1: 10的比例混合在一起，在50ml塑料离心管内用不完全培养液洗I次，1200rpm，8分钟。弃上清，用滴管吸净残留液体，轻轻弹击离心管底，使细胞沉淀略加松动。在37°C水浴下融合30秒内加入预热的Iml细胞融合剂，边加边搅拌。作用90秒钟。加预热的不完全培养液，终止PEG作用，每隔2分钟分别加入lml，2ml, 3ml, 4ml, 5ml和10ml。离心,800rpm, 6分钟。弃上清，先用6ml左右完全培养液轻轻混悬，补加HAT培养液到120ml。将融合后细胞悬液加入含有饲养细胞的96孔板，100 μ I/孔，37°C、5% CO2孵箱培养。
[0037]7.细胞克隆的观察和换液
[0038]材料:倒置显微镜(奥林巴斯)，完全培养液，HT选择培养液:49ml完全培养液加入Iml 50倍HT储备液(sigma公司)。
[0039]细胞融合后第三天开始，对细胞进行仔细观察，记录好细胞的生长状态、每孔克隆数、杂交细胞瘤个数、培养液有无污染、饲养细胞的状况。培养5天后HAT培养液换液一次，10天换HT培养液培养至20天，换PMI1640完全培养液。 [0040]8.筛选分泌抗体的杂交瘤细胞
[0041]在培养后的第8天，按前述细胞克隆的观察结果对12块培养板上所有的有细胞克隆生长的细胞培养孔采用ELISA法检测杂交瘤细胞抗体产生的情况。
[0042]材料:
[0043]I).磷酸盐缓冲液(PBS) 8g氯化钠、0.2g氯化钾、1.44g磷酸氢二钠、0.24g磷酸二氢钾，蒸馏水加至800ml。用IM HCL调pH至7.2，加水到1000ml0 2).封闭液:小牛血清IOml加90ml磷酸盐缓冲液。3).洗涤缓冲液吐温20 (Tween 20)0.5ml加PBS 1000ml。4).底物显色A液:1.46g磷酸氢二钠、0.933g柠檬酸、0.75%双氧水0.64ml、蒸馏水加至100ml。5).底物显色B液:TMB (sigma公司)20HATmg溶于IOml无水乙醇后加90ml水。6).底物显色反应液:底物显色A液，底物显色B液1:1混合。7).终止液(2M H2SO4)取浓H2SO427.62ml，缓缓加入到473ml的蒸馏水中，混匀即可。8).抗原包被液(0.1M碳酸盐缓冲液)pH 9.6:碳酸钠1.59g、碳酸氢钠2.93、蒸馏水加至1000ml。9).辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgG抗体(sigma公司)。10).酶标仪(sunrise公司)设定波长为450nm。
[0044]步骤:1).抗原包被:取上述试验I所制备的泡球蝴囊壁抗原调整抗原浓度一般为20μ g/ml,用包被液1:1稀释后取100 μ I加入酶标板各孔中，4°C过夜后。2).封闭:每孔加满封闭液，37°C I小时后，洗涤3次，拍干。3).加待测样品:无菌条件下取有细胞克隆的细胞培养板上的培养孔上清，100 μ I/孔加样到酶标板中，同时，每板分别选取无细胞生长的两孔为阴性对照，另选取无细胞生长的两孔加入阳性血清作为阳性对照；37°C孵育I小时，洗涤3次，拍干。4)加二抗:羊抗小鼠IgG抗体稀释8000倍，100 μ I/孔，37°C孵育I小时，洗涤4次，拍干。(3)显色:加入底物显色反应液100 μ I/孔，避光37°C显色15分钟。
(4)终止:加入终止液50 μ I/孔。(5)读数:以450nm单波长测定各孔OD值，以与阴性对照孔OD值的比值(P/N)大于2.1为限，作为判断为阳性的临界点。并选取阳性孔中高OD值孔，对其所对应的细胞培养孔进行细胞的克隆化。
[0045]9.目标杂交瘤细胞的克隆化。
[0046]采用有限稀释法。
[0047]阳性孔细胞的计数，并调细胞数在1~5X 108/ml
[0048] 取130个细胞放入6.5ml含饲养细胞完全培养液，即20个细胞/ml，100 μ I/孔加A、B、C三排为每孔2个细胞。余下2.9ml细胞悬液补加2.9ml含饲养细胞的完全培养液，细胞数为10个/ml，100 μ I/孔加D、E、F三排，为每孔I个细胞。余下2.2ml细胞悬液补加
2.2ml含饲养细胞的完全培养液，细胞数5个/ml，100 μ I/孔，加G、H两排，为每孔0.5个细胞。培养4~5天后，在倒置显微镜上可见到小的细胞克隆，补加完全培养液200 μ I/孔。第8~9天时，肉眼可见细胞克隆，记录只有单个克隆生长的细胞孔，待细胞克隆生长到孔底1/3时及时进行抗体检测。检测方法同试验8。并再次重复本试验2次，经过检测到第3次克隆的细胞板上的细胞孔所有小孔上清均为阳性时停止，获得了阳性克隆细胞Ρ325。
[0049]实施例2-细胞株的扩大培养及冻存
[0050]1.细胞株的扩大培养
[0051]将所获得的阳性细胞从96孔板中取出放入到24孔板中扩大培养。培养基采用完
全培养液。
[0052]2.杂交瘤细胞的冻存
[0053]材料:细胞冻存液:小牛血清25ml、RPMI1640不完全培养液20ml、二甲基亚砜5ml混合为细胞冻存液。_70°C冰箱液氮，冻存管。
[0054]步骤:观察24孔培养板中扩大培养的单克隆杂交瘤细胞，当长满孔底时，观察细胞生长良好，活细胞大于90%。用完全细胞培养液吹落孔底的细胞。2~3孔收集到离心管中。经2000rpm离心5min，吸去上清。用冷冻液配制成0.2~I X 107/ml细胞悬液，分装冷冻管。用一块厚毛巾包裹好冻存管，放入冰箱_70°C过夜，次日转入液氮中。
[0055]实施例3-单克隆抗体的大量制备(腹水制备)
[0056]材料:6~8周Balb/c小鼠，液体石蜡，细胞计数板，RPMI1640不完全培养液。
[0057]步骤:小鼠致敏:液体石蜡致敏Balb/c小鼠，注射体积500ul/只。10天后制备腹水。注射细胞:收集杂交瘤细胞并用RPMI1640不完全培养液洗细胞两遍，取100~150万细胞注射于老鼠腹腔，一周后可见老鼠状态不活跃并且老鼠的腹腔肿大。腹水采集:接种细胞7~10天后可见有腹水产生，密切观察动物的健康状况与腹水征象，待腹水尽可能多，而小鼠濒于死亡之前，处死小鼠，将腹水吸入试管。采集到的腹水于_70°C冰箱保存。
[0058]实施例4-制备了泡球蝴免疫组化试剂盒
[0059]材料:小鼠体内腹水诱生的单克隆抗体、泡球蝴组织、棘球蝴组织、细颈囊尾蝴组织、辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgG(sigma公司)、DAB显色试剂盒(博士德公司)、
0.01M枸橼酸盐缓冲液(ρΗ6.0)、0.01M PBS缓冲液(ρΗ7.2)、10%小牛血清封闭液、免疫组
化孵育盒。
[0060] 步骤:将泡球蝴组织、棘球蝴组织、细颈囊尾蝴组织10%多聚甲醛固定后，常规石蜡包埋，切片，厚度5微米。脱蜡，梯度入水。3%过氧化氢室温10分钟灭活内源性酶。蒸馏水洗3次。抗原修复:将切片浸入0.01M枸橼酸盐缓冲液(ρΗ6.0)，电炉或微波炉加热至沸腾后断电，间隔5~10分钟后，反复2次。冷却后PBS(pH7.2)洗涤2次。封闭:滴加10%小牛血清封闭液，37°C 30分钟。甩去多余液体，不洗。滴加制备单抗(腹水稀释100000倍):滴加稀释的一抗，370C I小时。PBS洗3分钟，3次。滴加稀释的二抗:滴加稀释250倍的辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgG，37°C I小时。PBS洗3分钟，4次。DAB显色:使用DAB显色试剂盒。取Iml蒸馏水，加试剂盒中A，B，C试剂各I滴，混匀后加至切片。室温显色，镜下控制反应时间，在10~20分钟之间。苏木素轻度复染。脱水，透明，封片。显微镜观察。可见泡球蝴囊壁组织(角皮层、生发层强染)虫体基底细胞层未着色。同等条件下对单房包虫幼虫(细粒棘球蝴)组织染色不着色，与水泡带绦虫幼虫(细颈囊尾蝴)组织不着色。与虫体寄生的宿主组织不着色。说明本发明具有很强的特异性和敏感性。
本发明建立的杂交瘤细胞株保藏于中国典型培养物保藏中心。其保藏信息如下:保藏单位名称:中国典型培养物保藏中心。保藏单位地址:湖北省武汉市武昌区珞珈山街16号武汉大学。保藏日期:2010年7月9日。保藏编号:CCTCC NO:C201071。分类命名:杂交瘤细胞株P3 25。
【权利要求】
1.一种分泌抗多房棘球绦虫幼虫(泡球蝴)囊壁组织(角皮层、生发层)的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其保藏号为=CCTCC NO:C201071，保藏日期为2010年7月9日，保藏单位为中国典型培养物保藏中心。
2.如权利要求1所述细胞株所分泌的单克隆抗体。
3.用于诊断多房棘球绦虫幼虫所致疾病多房包虫病(泡球蝴病)的免疫组化试剂盒。其特征在于所述试剂盒包含权利要求2所述的单克隆抗体。
4.如权利要求2所述的单克隆抗体在多房包虫病(泡球蝴病)科研、诊断和治疗中的应用。
5.如权利要求4所述的应用。其中包括该单克隆抗体与化疗药物或细胞因子或放射性核素偶联，制成的靶向 药物和诊断试剂。
【文档编号】A61P33/10GK103898064SQ201210576667
【公开日】2014年7月2日 申请日期:2012年12月27日 优先权日:2012年12月27日
【发明者】王昕 , 陈建平, 刘巧凤, 李晋川 申请人:王昕 , 陈建平, 刘巧凤, 李晋川