一种水稻CYP81A6基因突变体CYP81A6-m1及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因工程领域，具体地说，涉及一种水稻CYP81A6基因突变体 CYP81A6-ml及其应用。
【背景技术】
[0002] 水稻是我国的核心粮食作物，杂交水稻对提高我国粮食产量发挥了重要作用。杂 交水稻具有明显的杂种优势现象，目前我国杂交水稻累计种植面积超过45亿亩，杂交水稻 种植面积已经占到全国水稻种植面积的55 %左右。杂交水稻可分为三系法杂交稻和两系 法杂交稻。我国杂交水稻制种效率不高，主要表现在劳动强度大，种子产量和质量不稳定等 方面。因此实现杂交水稻制种全程机械化是进一步提升我国杂交水稻生产的必由之路。目 前，已经尝试了下列方法：1)机械采粉-贮藏-授粉技术。利用机械采集父本花粉，直接或 经贮藏然后对母本授粉。2)父本为雌性不育，实现父母本混播混收机械化。3)种子颜色标 记法。通过选育使父母本种子颜色不同，混播群体收获后，通过色选机将母本的杂交种与父 本的自交种子分离。4)利用除草剂清除混杂种子。这又包括两条途径，一是将抗除草剂基 因通过转基因导入母本不育系，使其对除草剂产生抗性。将母本与父本混播以产生杂交种 子，授粉后用母本可抗的除草剂进行田间喷施处理，将父本选择性杀死，收获的种子即是杂 交后代。这一方法受转基因法规制约，故尚未实现商业化。另一途径是将除草剂敏感突变 基因导入父本，使父本水稻对某种除草剂敏感。将母本与父本混播以产生杂交种子，授粉后 用父本敏感的除草剂进行田间处理，将父本水稻选择性杀死。这一方法不受转基因法规制 约，具有较好的应用前景。
[0003] 野生型 CYP81A6 基因（GenBank:DQ 341412. 1)全长 3914bp，其结构包括 1321bp 的 启动子序列，53bp的5'非翻译区（5' -UTR)，2268bp的编码区以及272bp的3' -UTR。编码 区包含两个外显子（长度分别为924bp和618bp)和一个内含子（长度为726bp)，编码513 个氨基酸，属于细胞色素 P450基因家族。尽管目前发现的数十个细胞色素 P450晶体结构 显示不同种属间的序列差异较大，但其三维结构高度保守（王斌，李德远（2009)细胞色 素 P450的结构与催化机理.有机化学29:658-662)。细胞色素 P450的主要结构功能域包 括：底物结合结构域和亚铁血红素（HEM)结合及催化结构域。其中，由于细胞色素 P450是 以硫醇盐结合血红素为活性中心催化氧原子转移的氧化还原酶，故亚铁血红素结合及催化 结构域在行使其活性功能时，HEM的铁离子一侧与绝对保守的半胱氨酸的硫络合，形成硫醇 盐离子键，成为铁的一个配体；另一侧可与水中的氧分子络合，形成亚铁P450-二氧复合物 (P-Fe (II) -02)。P-Fe (II) -02经第二个单电子还原和质子化，形成Fe (III)-氢过氧化复合 物（P-Fe(III)-O-OH)，进一步自催化形成高价铁氧中间体（P*Fe(IV) =0)，该氧铁卟啉阳 离子自由基，即能提供单电子，又含正电荷，提供活性氧原子，在水溶液中能够实现转移氧 原子，插入到惰性的C-H键中，实现温和条件下烃的羟基化，此为单加氧方式；另外一种方 式是高价铁氧中间体P *Fe (IV) = 0直接对底物氧化脱氢，而不是在C-H键上插入氧，该方 式为氧化脱氢方式。无论那种方式均依赖亚铁血红素（HEM)结合及催化结构域对底物进行 氧化，该结构域核心区域如图4中黑色方框所示（FGMGRRRCPG)(张集文，2010,水稻苯达松 敏感突变研宄进展.中国水稻科学24:551-558)。
[0004] 苯达松为苯并噻二唑类除草剂，可杀死多数阔类叶杂草和莎草科杂草，而对包括 水稻在内的禾本科和豆科植物十分安全。其作用机理是抑制植物光合作用的希尔反应。其 选择性是因为不同种类植物分解苯达松的能力存在差异。正常水稻品种可将苯达松快速代 谢为羟基化的无毒产物。经辐射诱变，在水稻品种农林8号（N8)和W6154S上获得了两个 苯达松敏感的突变体，农林8号m(N8m)和8077S。农林8号m的致死浓度为5mg/L，8077S 的致死浓度为313mg/L，前者比后者敏感60倍，而正常水稻品种用2500mg/L苯达松处理未 表现明显伤害。遗传研宄表明农林8号m突变位点和8077S突变位点为等位基因，其敏感 致死表型由同一个bsl基因控制。野生型的bsl是一个P450基因（CYP81A6)，其编码区长 度为2268bp，含有两个外显子和一个内含子，编码一个由513个氨基酸组成的酶。其在农 林8号m中，在翻译起始密码ATG后第507位点，缺失了一个C，这一突变发生在第一外显子 上，导致其编码的蛋白大部分氨基酸缺失，因而完全丧失生化功能。在8077S中，突变发生 在翻译起始密码ATG后第2058位点，缺失了一个G，这一突变发生在第二个外显子靠近3' 端。导致其编码的酶蛋白缺失了 49个氨基酸，并使其第441~450位的关键结构域突变， 故使其基本丧失了生化功能（张集文（2010)水稻苯达松敏感突变研宄进展.中国水稻科 学24:551-558)。但上述两个突变体都只有Ibp的缺失，不能用实验室常用的琼脂糖电泳检 测，难以用于分子标记辅助育种，需特殊的检测单碱基突变的技术方法。另外，两个突变体 中，籼稻来源的8077S对苯达松敏感性不高。因此，在水稻杂交制种实际应用中，需要新的 对苯达松高度敏感的，易于进行分子检测和开展分子标记辅助育种的籼稻突变体。
【发明内容】
[0005] 本发明目的是提供对苯达松高度敏感的水稻CYP81A6基因突变体CYP81A6-ml及 其应用。
[0006] 本发明首先对籼稻品种93-11种子（MO代）进行钴60辐射诱变处理，种植处理的 种子获Ml代植株；Ml代植株自交产生种子（为M2代），种植M2代植株，对M2代植株进行 苯达松处理，筛选敏感植株；然后对敏感植株进行基因测序和DNA序列分析，在分子水平上 进行验证。最后获得对苯达松高度敏感纯合单株，并用于杂交育种和生物技术研宄。
[0007] 本发明提供的水稻CYP81A6基因突变体CYP81A6-ml，其为水稻CYP81A6基因第一 个外显子586位处中缺失7个碱基，所述缺失的7个碱基为AGGCGAC。
[0008] 进一步地，水稻CYP81A6基因突变体CYP81A6-ml，其核苷酸序列如SEQ ID No. 1所 不O
[0009] 本发明提供了含有本发明所述水稻CYP81A6基因突变体CYP8 lA6-ml的表达载体。
[0010] 本发明提供了含有上述表达载体的宿主细胞。
[0011] 本发明提供了水稻CYP81A6基因突变体CYP8 lA6-ml在制备转基因植物中的应用。
[0012] 本发明提供了水稻CYP81A6基因突变体CYP81A6-ml在制备对苯达松敏感的转基 因植物中的应用。
[0013] 优选地，所述转基因植物为转基因水稻。
[0014] 本发明提供了水稻CYP81A6基因突变体CYP8lA6-ml在农作物改良育种、制种中的 应用。
[0015] 优选地，所述的农作物为水稻、玉米、小麦、棉花。
[0016] 本发明提供了克隆水稻CYP81A6基因突变体CYP81A6-ml的方法，以水稻基因组 DNA为模板，分别以下述4对引物对进行PCR，将4个扩增产物依次拼接得到水稻CYP81A6 基因突变体CYP81A6-ml，所述4对引物对的核苷酸序列分别为：SEQ ID NO. 2-3和SEQ ID NO. 4-5 和 SEQ ID NO. 6-7 和 SEQ ID NO. 8-9。
[0017] 用SEQ ID NO. 2-3所示的引物对能够扩增出1314bp的水稻CYP81A6基因扩增 片段，用SEQ ID NO. 4-5所示的引物能够扩增出1216bp (野生型水稻CYP81A6基因）或 1209bp(CYP81A6-ml)的扩增片段，用SEQ ID NO. 6-7所示的引物能够扩增出1377bp的水稻 CYP81A6基因扩增片段，用SEQ ID NO. 8-9所示的引物能够扩增出796bp的水稻CYP81A6基 因扩增片段。
[0018] 本发明还提供了检测水稻CYP81A6基因突变体CYP8 lA6-ml的分子标记，该分子标 记是由以下引物对扩增得到，所述引物对的核苷酸序列为：
[0019] SEQ ID NO. 10-11 或 SEQ ID NO. 12-13 或
[0020] SEQ ID NO. 14-15 或 SEQ ID NO. 16-17 或
[0021] SEQ ID NO. 18-19 或 SEQ ID NO. 20-21 或
[0022] SEQ ID NO. 22-23。
[0023] 本发明提供了上述分子标记在检测CYP81A6基因突变体CYP8 lA6-ml中的应用。
[0024] 本发明提供了上述分子标记在制备对苯达松敏感的转基因植物中的应用。
[0025] 本发明提供了上述分子标记在水稻种质资源改良中的应用。
[0026] -种水稻CYP81A6基因突变体CYP81A6-ml的分子标记的方法，通过下述之一的引 物对扩增待检植物基因组DNA，并检测扩增产物：
[0027] 所述引物对的核苷酸序列为：
[0028] SEQ ID NO. 10-11 或 SEQ ID NO. 12-13 或
[0029] SEQ ID NO. 14-15 或 SEQ ID NO. 16-17 或
[0030] SEQ ID NO. 18-19 或 SEQ ID NO. 20-21 或
[0031] SEQ ID NO. 22-23 ；
[0032] 当用SEQ ID NO. 10-11所示的引物能够扩增出179bp的扩增片段，或者用SEQ ID NO. 12-13所示的引物能够扩增出123bp的扩增片段，或者用SEQ ID NO. 14-15所示的引物 能够扩增出107bp的扩增片段，或者用SEQ ID NO. 16-17所示的引物能够扩增出108bp的 扩增片段，或者用SEQ ID NO. 18-19所示的引