专利名称：通过PARP1基因、CYP1A1基因和ERCC2基因的SNPs位点进行肺癌易感性检测的试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种疾病易感性检糖用的试剂盒，尤其是一种检测肺痛易感性的试剂盒，通过同时检測多 聚ADP核糖转移瞎家族成员1 (poly(ADP-ribose) polymerase family, member 1 ， PARP1 ，又简写为ADPRT)、 细胞色素P4501A1嗨基闪(cytochrome P450, family 1， subfamilyA， polypeptide 1, CYPlAl)和切除修复复 合物2 (Excision Repair Cross-complementing Rodent Repair Deficiency, Complementation Group 2, ERCC2 ) 的单核苷酸多态性位点(SNP)来预测个体对肺癌的易感性。背录技术原发性支气管肺癌，简称肺痛，为当前世界各地最常见的恶性肿癯之一，是一种严重威胁人类健康和 生命的疾病。肿癯细胞源于支气管粘膜或腺体，常有区域性淋巴结和血行转移，早期常有刺激性咳嗽、瘐 中带血等呼吸道症状，病情进展速度与细胞的生物特性有关。半个世纪以来，世界各国肺痛的发病率和病死率都有明显塌高趋势。世界卫生组织(WHO)2000年报吿: 1997年全世界死于恶性肿瘤的共706.5万人，占死亡人数的12.6%，其中肺癌占恶性肿癯死亡的19%，居 恶性肿癍死因的第一位。我国1990~1992年的抽样调査显示，在城市人口的肿癯死亡中，肺癌由原来的 第4位上升为第1位，农村上升最快的也是肺癌。云南锡矿的肺癌发病率在1954 1959年间为28.02/10 万，1诉0 1969年间为197.87/10万，1970~1979年间上升到219.10/10万.这在全世界也是罕见的。英国 著名肿瘤学家R.Peto预言如果我国不及时控制吸烟和空气污染，到2025年我国每年肺痛将超过100万， 成为世界第一肺癌大国。病因和发病机制迄今尚未明确。一致认为肺癌的发病与下列因素有关①吸烟(包括主动吸烟和被动 吸烟)②职业致癌因子，己被确认的致人类肺痛的职业因素包括石棉、无机砷化合物、二氣甲瞎、铬及 其化合物、锞、氡、芥子气、氣乙烯、煤烟、焦油和石油中的多环芳烃、烟草的加热产物等③空气污染 (包括室内小环境和室外大环境污染);.④电离辐射⑤饮食与营养，美国纽约和芝加哥开展的前瞎性人群观察的结果说明，食物中天然维生素A类、e胡萝卜素的摄入紫与十儿年后痛症的发生虽负相关，其中虽突出的是肺痛⑥其他，美国癌症学会将结核列为肺癌的发病因素之一。有结核病者患肺痛的危险性是 正常人群的10倍。其主要组织学类型是腺癌，此外，病毒感染、真菌毒素(黄曲每)、机体免疫功能低下、 内分泌失调以及家族遗传等因素，对肺痛的发生可能也起一定的综合作用。近年研究表明，肺癌的发生与某些痛基因的活化及抑癌基因的失活密切相关。已经证明的几个癌基因 家族包括引起突变的旭族、放大基因的myc族、C>erB2、机制不明的bcl-2、 Kit及由野生型变异的抗癌 基因p53、 p16和RB等。火量研究表明C-myc、 L-myc、 N-myc和RAF在小细胞肺癌中均有过度表达。 非小细胞肺癌中则常可见ras族基因的过度表达。这些深入的研究将为基因预防和治疗肺癌提供理论基础，SNP(single nucleotide polymorphism)，即单核苷酸多态性标记，是一类基于单碱基变异引起的DNA 多态性，被遗传学界称为第三代遗传标记。主要是指由基因组核苷酸水平上的变异引起的DNA序列多态性， 包括单碱基转换、颠换，以及单碱基的插入/缺失等。它是基因组中最为广泛存在的一类多态性标记，占 大约90%。这些基闳组序列变异可以导致个体间表型的差异以及不同个体对疾病，特别是复杂疾病的易感 性和对环境因素、药物反应的差异.PARP1基因位于第1号染色体lq41"q42位置，全长47.31*, mRNA全长3861bp，共有23个外显子， 编码1015氨基酸的多聚ADP核糖转移酶蛋白。这种酶通过聚ADP核糖基化反应條正多种核蛋白.这种 修正以DNA为基础，参与多种重要的细胞活动，例如分化，增殖，肿癯转移等，同时也参与分子水平 的活动，例如修复DNA受损的细胞等等。PARP1的主要功能通常被描述为3个方面1. DNA修复功能 (BER〉 2.抑制受损DNA的转录；3.耗尽细胞中的能^;,导致细胞凋亡4.参与部分基因的转录调控. 这些功能可以修复细胞中受损的DNA,抑制破损DNA的转录，甚至杀死无法修复的细胞，达到抑制痛症 发生的作用。研究发现，PARP1功能缺失会提髙乳腺痛，肺癌等癌症的发病率。rall36410是位于第l号 染色体上PARP1基因上的一个T/C多态，引起PARP1基因编码的蛋白第762个氨基酸由Val变为Ala.
NCBI公布的世界人群中的该多态的频率分布.T占0,抑8， C占0.192左右，杂合度为0.311*分子生物学 研究表明，PARP1上762号氨基酸由Val转化为Ala，降低了酶的活性，导致多种痛症的发生风险升商。 尤样本的中国人群的关联分析显示，该位点的多态现象是中国人群中重要的肺痛影响因素之一。CYP1A1基因位于第15号染色体I5q22i24位置，全长6.0kb, mRNA全长260lbp，共有7个外显子， 编码5l3个氨基酸的细胞色素P450lAl。 P450lAl是重要的活化多环芳烃类致癌物的主要酶类，被激活的 CYPIAI能将多种环境中的有机物质如PAH (polycyclic aromatic hydrocarbons)多环芬芳碳虽化合物转 化为细胞毒素或其他致痛物质，从而増加痛症发生的危险。国内外的众多研究显示CYPIAI的多态与野生 型相比有更高的酶接触反应活性和可诱导性，从而增加肝癌、肺癌、乳腺癌、食道痛、前列腺痛等疾病的 危险度。细胞色素P450酶(CYP450)是细胞内^耍的I相代谢嗨，在致癌物的活化和解毒过程中起着重 耍的作用。P450lAl(CYPlAl)是活化多环芳妤类致癌物的主耍酶类。CYPIAI作为一种微神经元体细胞瞎 与一些致癌物质的生物激活有关，例如benzo[a]pyrene。同时，CYPIAI易于被TCDD和多环的芳香族化 合物所诱变，包括3-甲基胆葸等实验室用致癌物质。目前的动物实验表明，CYPIAI的表达与芳基碳敏化 合物受体(AhR)和Arnt (A欣NuclearT咖slocator)的激动剂，以及USFl (Upstream Stimulatoiy Factor) 的拮抗剂有关。同时，CYPIAI通过C2羟基化作用参与雌激素的代谢活动。rel048943是位于CYPIAI基 闪上的一个A/G多态，位于第7外显子462号氨基酸由lie转化为Val。目前NCBI公布的世界人口频率 A:G为0.896:0.104,杂合度0.186。世界人群的关联分析表明，CYP1A1 He462Val位点VaIVal和Vallle基 因型在肺痛病例组中的频率明显高于对照组，在女性中风险度尤其突出。基于多个中国人群肺癌发病与 CYPlAlIle462Va!位点的关联分析研究，上千例肺癌个体与健康对照个体的分析，显示CYP1A1 Ite462Val 这种位于嗨蛋白的血红素结合区的变异，是中国人群中重要的肺癌遗传易感因素之一，在女性中尤为突出. 酶动力学研究表明,3种基因型表达的嗨活性存在差异。Wl/Val活化毒物的能力最强，He/Val次之,而He/Ile 最弱。研，显示，CYPlAlValVal基因型是中国人群中重要的肺痛遗传易感因素之一。ERCC2,位于第19号染色体19ql3,3位置，共有23个外显子，基因全长19.0kb, mRNA全长2355bp, 编码含761个氨基酸的蛋白。由ERCC2编码的蛋白参与转录偶联的核苷酸切除修复，它可识别与修复结 构无关的大范围的损伤，如大的加合物和胸腺哦啶二聚体，并且是基本转录因子复合物BTF2/TFIIH的一 个组成成分。该蛋白具有ATP依赖性的DNA解旋活性，并且属于RAD3/XPD解旋瞎亚家族，ERCC2的 功能缺失导致基本转录因子复合物不能正确识别DNA损伤位点，从而使碱基切除條复无法正确进行，导 致DNA上的致痛损伤积累。ERCC2基闲的突变或者失活可能导致的疾病包括癌症、着色性干皮病、毛 发琉营养不良、柯凯因氏综合症。rsl799793是位于第19号染色体ERCC2基因第十号外显子段Asp312Asn 的G/A多态。世界人群中的频率约为G:A4778:0.222,中国人群中的频率约为G:A=0.94:0.06。目前的多 .项研究表明，该位点的多态会导致ERCC2参与构成的转录因子复合物的性能发生弱化，从而使得对DNA 损伤修复的能力下降，转录因子的能力也同时发生下降，导致一系列诸如肺痛，前列腺癌等疾病的发生。 ERCC2Asp312Asn多态性与肺癌特别是肺鳞癌发生有显著关联，该位点的多态现象被认为是中国人群中肺 癌遗传易感因素之一。国内外的大景的关联分析表明，PARP1基因上的rsl136410号SNP位点基因型为C时肺痛的发生几率 增加CYP1A1基因上rsl048943号SNP位点基因型为G时肺豳的发生儿率增加；ERCC2基因上rsl799793 号SNP位点基因型为A时肺癌的发生几率增加。这三个SNPs位点的多态性可用于评估个体对肺痛的易感 性。发明内容基于PARP1基因上的rsl136410号SNP位点、CYP1A1基因上的rsl048943号SNP位点和ERCC2基因上 的rsl799793号SNP位点的多态性可用于评估个体对肺癌的易感性的基础上，本发明提供一种检測肺癌易 感性的试剂盒。该试剂盒包括检渊PARP1基因上的rsl136410号SNP位点的特异性引物对及特异性荧光探针、检測 CYP1/U基因上的rsl0幼943号SNP位点的特异性引物对及特异性荧光探针、检測ERCC2基因上的rsl799793 号SNP位点的特异性引物对及特异性荧光探针、T叫酶、dNTP混合液、MgCh溶液、荧光定紫PCR反应缓
冲液、去离子水。本试剂盒中所述的特异性引物对是指针对PARP1基闪上的rsl136410号SNP位点、CYP1A1基因上的 rsl048943号SNP位点和ERCC2基因上的rsl799793号SNP位点而设计，能特异性扩增出耙位点的DNA片 段.设计这类引物对是本领域技术人员能够轻易完成的。优选地，试剂盒中包含具有S印ID NO: 1和2 所示序列的引物对、具有SEQ ID NO: 3和4所示序列的引物对以及具有SEQ ID NO: 5和6所示序列的引 物对。特异性引物对可用常规的合成技术进行合成。本领域的技术人员能够理解，本发明的引物不限于这 三对引物。本试剂盒中所述的特异性荧光探针是指针对PARPl基因上的rsl136410号SNP位点、CYPlAl基因上的 rsl048943号SNP位点和ERCC2基因上的rsl799793号SNP位点而设计，能通过荧光定量PCR技术特异性 检测出这三个SNPs位点肺癌易感基闲型的探针。设计这类探针是本领域技术人员能够轻易完成的，优选 地，试剂盒中包含具有SEQ ID NO: 7、 8承l 9所示序列的T叫man探针。特异性荧光探针可用常规的合成 技术进行合成。本领域的技术人员能够理解，本发明的特异性荧光探针不限于这三条探针，所有可用于荧 光定量PCR检测PARPl基因上的rsl136410号SNP位点、CYPlAl基冈上的rsl048943号SNP位点和ERCC2 基因上的rsl799793号SNP位点的探针均在本发明范围内。本发明试剂盒的组分和含量包括 lul 10 X荧光定黹PCR反应缓沖液， 0.1|U 25mM dNTP混合液， 0. 5^1 25mH MgCh溶液， 0.02|U (5units/pl) Taq DNA聚合酶， 20nM特异性引物对(六条)各O. 225^1, 10fiM特异性荧光探针(三条)各0.25nl， 去离子水4. 28(il。本试剂盒供一人份检测应用，试剂盒的保存温度为-2ox:。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规 条件，或按照厂商所建议的条件。实施例l.检测试剂盒的使用 步爽l: DNA模板的抽取 用硅胶吸附法抽提口腔上皮细胞的基因组咖A。 步驟2:荧光定量PCR反应使用可检測肺癌易感性的荧光定ttPCR检测试剂盒，其中，含有下列引物对和炎光探针:有义引物l:5'-TTTGCCATTCACTGTCTTGG -3，(SEQID NO:1) Tm值为58"C反义引物1:5，-ATCCTTGCTGCTATCATCA -3'(SEQID NO:2) Tm值为541C有义引物2:5'- GTGTTAAGTGAGAAGGTGAT -3，(SEQID NO:3〉 Tm值为56lC反义引物2:5'-AGGATAGCCAGGAAGAGAAA -3'(SEQID NO:4) Tm值为58TC有义引物3:5'-ATCAAAGAGACAGACGAGCA -3'(SEQID NO:5) Tm值为581C反义引物3:5'-TCAGGAAGCCCAGGAAAT -3，(SEQID NO:6) Tm.值为54匸荧光探针1:5'-CAGGCCAAGGCGGAAATGCT -3，(SEQID NO:7〉 Tm值为64"C 炎光探针2: 5， - TATCGGTGAGACCGTTGCCC -3' (SEQ ID NO: 8) Tm值为64r荧光探针3: 5， _ TGCCCMCGAAGTGCTGCAG -3' (SEQ ID NO: 9) Tm值为64TC有义引物1,反义引物1和荧光探针1特异地针对检測PARP1基闪上的rsl136410号SNP位点多态性: 有义引物2，反义引物2和荧光探针2特异地针对检测CYP1A1基因上的rsl048943号SNP位点多态性有 义引物3，反义引物3和荧光探针3特异地针对检测ERCC2基因上rsl799793号SNP位点多态性。荧光定量PCR反应体系为总体积lOpl,包含浓度为20ng/fil的DNA模板2jd、 ljil 10 X荧光定 PCR 反应缓冲液、0. 25mM dNTP混合液、0.5^1 25mM MgCl2溶液、0.02(il (5units/|il) T叫DNA聚合,、 20jiM的有义引物1、 2和3各0. 225jil、 20pM的反义引物1、 2和3各0. 225jil、 lO)iM的荧光探针1、 2和 3各0.25fil,去离于水4. 28fil 。在ABI9700型PCR扩增仪上进行反应，反应条件为501C、 2分钟，951C、 IO分钟，进行60个循环的 诉1C、 30秒，601C、 l分钟。反应结束后在旭I7900型荧光定景PCR仪上读取样品荧光紫， 步骤3: SNP基因型分析将荧光定量PCR仪上显示的最终样品荧光量和正常对照相对比，荧光探针1最终的荧光信号明显离于 正常对照,说明被检搠DNA的PARP1基因上的rsl 136410号SNP位点基因荆携带有C型，为肺癌易感型 荧光探针2最终的荧光信号明显髙于正常对照，说明被检测DNA的CYP1A1基因上rsl048943号SNP位点 基因型携带有G型，为肺痛易感型;荧光探针3虽终的荧光信号明显布于正常对照，说明被检拥DNA的ERCC2 基因上rsl799793号SNP位点基因型携带有A型，为肺癌易感型。实施例2.指导人们主动预防肺癌的服务目前在上海主健生物工程有限公司已经开展了这项服务。 步骤l: DNA提取对被检測者进行服务前咨询，由被检测者签署知情同意书，填写生活饮食习is问巻调査表。依照取样盒中的指示使用口腔采样拭进行口腔上皮细胞取样，采用硅胶吸附法进行口腔上皮细胞的DNA抽提， 步骤2:基因分型检测使用本发明提供的试剂盒，对被检湖者DNA的PARP1基闪上的rsl136410号SNP位点、CYP1A1基因上 rsl048943号SNP位点和ERCC2基因上rsl799793号SNP位点同时进行荧光定承PCR检豕j，确定这三个SNPs 位点的基因型。步骤3:指导人们主动预防肺癌通过对被检测者SNPs基肉型的分析，出具基因分型检测报告和被检测者个体化健康指导报告.基因 检测报告详细说明了被检測者肺痛易感程度的高低以及患病的概率大小。个体化健康指导报告以被检拥者 的基因分型检測结果为基础，结合其生活饮食习惯问巻调査结果，评估被检測者肺痛遗传易感的相对风险* 同时制定出针对于被检拥者的个性化健康行动方案，方案包括在饮食习惯、生活方式上的改进建议等，并 为被检测者普及预防肺癌的健康知识。 序列表<iio>上海主健生物工程有限公司<120>通过PARP1基因、CYPlAl基因和ERCC2基因的SNPs位点进行肺痛易感性检測的试剂盒<160> 9<210> 1 <211> 20 〈212>陽 <213>人l:序列〈220><223>引物 <400> 1tttgccattc actgtgttgg 20<210> 2 <211> 19 <212> DNA <213>人丄序列〈220><223>引物 <400> 2atccttgctg ctatcatca 19<210> 3 <211> 20 <212> DM <213>人工序列<220><223>引物 <400> 3gtgtt卿tg ag助ggtgat 20 <210> 4 <211> 20 <212>腿 <213>人工序列<220><223>引物 <400> 4aggatagcca gg卿agaaa. 20<210> 5 <211> 20 <212> DNA <213>人l:序列<2加><223>引物 <柳> 5atcaaag卿cagacgagca 20<210> 6 <211> 18 <212> DNA <213>人..L:序列<2加><223>引物 <衡6tcaggaagcc c鄉aaat 18<210> 7 <211> 20 <212> DNA <213>人工序列<220><223>探针 <400> 7caggccaagg cggaaatgct<210> 8<211> 20 <212>咖A <213>人l:序列<220><223>探针 <柳> 8tatcggtgag accgttgccc<210> 9 <211〉 20 <212> DM <213>人工序列<220〉<223>探针 <400> 9tgccc咖ga agtgctgcag
权利要求
1. —种检測肺痛易感性的试剂盒，包括同时检測PARP1基闳上的rsl136410号SNP位点、CYPIAI 基因上的rsl0幼943号SNP位点和ERCC2基因上的rsl799793号SNP位点的特异性引物对及特异性荧光探 针、Taq解、dNTP混合液、MgCl2溶液、荧光定量PCR反应缓冲液、去离子水。
2. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述的特异性引物对是指针对PARP1基因上的 rsl 136410号SNP位点、CYPIAI基因上的rsl048943号SNP位点和ERCC2基因上的rsl799793号SNP位点 而设计，能特异性扩增出包含PARPl基闵上的rsll36410号SNP位点、CYPIAI基因上的rsl048943号SNP 位点和ERCC2基因上的rsl799793号SNP位点的引物对。
3. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述的特异性荧光探针是指针对PARP1基因上的 rsl136410号SNP位点、CYPIAI基因上的rsl0幼943号SNP位点和ERCC2基因上的rsl799793号SNP位点 而设计，能通过荧光定量PCR技术特异性检測出这三个SNPs.位点肺癌易感基因型的探针。
4. 根据权利耍求l所述的试剂盒，其特征在于所含的特异性引物对选自具有SEQh)NO: l和2所 示序列的引物对、具有SEQ ID NO: 3和4所示序列的引物对以及具有SEQ ID NO: 5和6所示序列的引物 对。
5. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所含的特异性荧光探针选自具有SEQ ID NO: 7、 8 和9所示序列的Taqman探针。
6. 根据权利耍求1所述的试剂盒，其特征在于试剂盒的组分和含量包括lul IOX荧光定量PCR反 应缓冲液，0. ljil 25mM dNTP泡合液，CL5nl 25mM MgCl2溶液，0.02|il (5units/(il) T叫DNA聚合,， 20jiM特异性引物对(六条)各0.225ji1, 10nM特异性荧光探针(三条)各0.25jxl，去离子水4.28(il。本试剂盒供一人份检拥应用，试剂盒的保存温度为-加ic。
全文摘要
本发明公开了一种检测肺癌易感性的试剂盒。该试剂盒包括同时检测PARP1基因上的rs1136410号SNP位点、CYP1A1基因上rs1048943号SNP位点和ERCC2基因上的rs1799793号SNP位点的特异性引物对及特异性荧光探针、用于荧光定量PCR检测的常规组件等。本发明的试剂盒通过同时检测分析个体的PARP1基因、CYP1A1基因和ERCC2基因上SNPs位点基因携带型来预测个体对肺癌的易感性。
文档编号G01N21/00GK101144773SQ20061011609
公开日2008年3月19日 申请日期2006年9月15日 优先权日2006年9月15日
发明者冯哲民, 邹祖烨 申请人:上海主健生物工程有限公司