专利名称：Cyp5013c2蛋白及其编码基因以及表达cyp5013c2蛋白的四膜虫的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种CYP5013C2蛋白及其编码基因，并提供了表达CYP5013C2蛋白的四膜虫及其在降解DDT中的应用。
背景技术：
滴滴涕(DDT)是一种有机氯杀虫剂，自1942年商品化以来，在杀蚊除虱方面取得了显著成效，制止了斑疹伤寒的流行。工业级DDT包含两类同分异构体，70-80%为有活性成分的P，P’ -DDT,剩余的为副产物O，p’ -DDT,它们进入生物体后会分别代谢成p，P’ -DDE和P, P’ -DDD,以及O，p’ -DDE和o，p’ -DDD。许多研究表明，喷洒的DDT主要通过地表径流方式进入水体，随即粘附在藻类、浮游动物等低等水生生物的体表及其纤毛上，通过食物链和食物网的运输，DDT最后在高等生物体内蓄积，对野生动物、甚至人类造成长久的危害(包括乳腺癌、糖尿病、低精子质量、自发性流产、儿童神经系统发育受损等)。1972年，美国通过立法禁止使用DDT，其它国家随后也纷纷开始禁用DDT。2001年，联合国环境大会通过了 ((conference of plenipotentiaries on the Stockholmconvention on persistent organic pollutants》，列出了包括 DDT 在内的亟待控制的 12种持久性有机污染物(persistent organic pollutant, POPs), 100多个国家签署了该公约。DDT禁用后，疟疾在部分非洲国家又卷土重来。2006年9月，世界卫生组织宣布正式解除对DDT的禁令，允许部分地区重新使用这种杀虫剂。目前全球环境中的DDT浓度呈不断上升的趋势，这主要有以下几个方面的来源:
(I)非洲部分国家仍采用DDT控制疟疾；(2)使用含有DDT的杀虫剂；3)海洋仍然在释放几十年前作为杀虫剂使用而未分解的DDT。此外，DDT具有较长的半衰期，在土壤中为0.25-15年，在人体内可长达4年。因此，DDT虽然主要是在南半球使用，但是由于洋流和大气作用，北半球海洋中DDT的浓度也依然在上升。与低气温地区相比，DDT在高气温地区更容易挥发，大范围的大气流动作用，导致了 DDT在高纬度地区和极地的积累。所以，目前环境中的DDT对野生动物和人类健康仍然存在严重的威胁，而采取一定的技术手段将环境中的DDT进行高效降解，对于保护生态环境和保障人类健康具有非常重要的意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种CYP5013C2蛋白及其编码基因，并提供了表达CYP5013C2蛋白的四膜虫及其在降解DD T中的应用。本发明保护过表达CYP5013C2基因的四膜虫在降解DTT中的应用；所述CYP5013C2基因为编码CYP5013C2蛋白的基因；所述CYP5013C2蛋白为如下(a)或(b ): (a)由序列表中序列I所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列I的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列I衍生的蛋白质。
所述CYP5013C2基因为如下I)或2)或3)的DNA分子:I)编码区如序列表中序列2所示的DNA分子；2)在严格条件下与I)限定的DNA序列杂交且编码具有相同功能的蛋白的DNA分子；3)与I)限定的DNA序列具有90%以上同源性且编码具有相同功能的蛋白的DNA分子。所述严格条件为在0.1 XSSPE (或0.1XSSC)、0.1% SDS的溶液中，65°C条件下杂交并洗膜。所述过表达CYP5013C2基因的四膜虫是在出发四膜虫中导入含有所述CYP5013C2基因的DNA片段得到的重组四膜虫。所述DNA片段中，由四膜虫mttl基因启动子驱动所述CYP5013C2基因的表达。所述DNA片段具体可为将序列表的序列4自5’末端第2216至7096位核苷酸所示的双链DNA分子进行如下改造得到的DNA分子:将序列4自5’末端第5713位核苷酸至6543位核苷酸取代为序列表的序列2所示的核苷酸。所述出发四膜虫具体可为嗜热四膜虫B2086株系。本发明还保护以上任一所述CYP5013C2基因在促进四膜虫降解DTT中的应用。所述四膜虫具体可为嗜热四膜虫B2086株系。本发明还保护含有以上任一所述CYP5013C2基因的DNA片段、重组载体或重组四膜虫。所述DNA片段具体可为将序列表的序列4自5’末端第2216至7096位核苷酸所示的双链DNA分子进行如下改造得到的DNA分子:将序列4自5’末端第5713位核苷酸至6543位核苷酸取代为序列表的序列2所示的核苷酸。所述重组载体具体可为在载体PXS75的多克隆位点(如BamH I和Asc I酶 切位点之间)插入所述CYP5013C2基因得到的重组质粒。所述重组四膜虫具体可为将所述DNA片段导入出发四膜虫得到的重组四膜虫。所述出发四膜虫具体可为嗜热四膜虫B2086株系。本发明提供的重组四膜虫具有以下优点:(I) CYP5013C2基因对DDT的胁迫响应特异而灵敏；(2) CYP5013C2基因参与DDT在四膜虫细胞内的生物转化过程；(3)具有高效降解DDT的功能；含有CYP5013C2基因正常表达水平的野生型四膜虫在4小时内能够降解70%的DDT，而含有CYP5013C2基因过表达的转基因四膜虫具有更加高效的降解DDT的能力，它在4小时内能够降解91%的DDT ；(4)能将水体中DDT控制在食物链底端:喷洒的DDT主要通过地表径流方式进入水体，而四膜虫则以自由游泳方式生活在水体中，因此含有CYP5013C2基因过表达的转基因四膜虫通过高效降解水体中的DDT，达到在食物链底端控制住DDT向更高等级的生物体转移和富集；(5)不污染环境:嗜热四膜虫细胞内有I个大核和I个小核，不同交配型的四膜虫经过有性生殖过程，子代四膜虫内行使生命活动功能的大核染色体发育自亲本小核染色体，子代四膜虫内的原亲本大核染色体则全部凋亡；转基因四膜虫的转基因片段定位于大核染色体上，转基因四膜虫在经历有性生殖过程后会丧失转基因片段，转基因物种消失，因此转基因物种不会对水生态系统造成长久干扰，也就不会污染环境。以上任一所述DDT具体可为p，p’-DDT。本发明还保护一种蛋白质，为如下(a)或(b):(a)由序列表中序列I所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列I的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列I衍生的蛋白质。
本发明还保护编码所述蛋白质的基因，为如下I)或2)或3)的DNA分子:1)编码区如序列表中序列2所示的DNA分子；2)在严格条件下与I)限定的DNA序列杂交且编码具有相同功能的蛋白的DNA分子；3)与1)限定的DNA序列具有90%以上同源性且编码具有相同功能的蛋白的DNA分子。所述严格条件为在0.1XSSPE (或0.1 X SSC)、0.1 % SDS的溶液中，65 °C条件下杂交并洗膜。本发明对于保护生态环境和保障人类健康具有非常重要的意义。
图1为实施例1中，采用各个浓度的P，P’-DDT处理下四膜虫的生长曲线。图2为实施例3中，四膜虫CYP5013C2基因的相对表达水平。图3为实施例4中，CYP5013C2蛋白在细胞内定位的照片。图4为实施例5中，基因沉默的流程示意图。图5为实施例6中，重组质粒0ECYP5013C2_PXS的结构示意图。图6为实施例7中，四膜虫的生长曲线。图7为实施例8的结果。
具体实施例方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。嗜热四膜虫(Tetrahymena thermophila) SB210株系:由美国加州大学圣巴巴拉分校 Eduardo Orias 教授惠赠，参考文献:Eisen JA, Coyne RS, Wu M, Wu D, ThiagarajanMj Wortman JRj Badger JHj Ren Q，Amedeo P，Jones KM，Tallon LJ，Delcher AL, SalzbergSLj Silva JC，Haas BJj Majoros WHj Farzad M，Carlton JM，Smith RK Jr，Garg J，PearlmanRE, Karrer KM，Sun L，Manning Gj Elde NCj Turkewitz AP，Asai DJj Wilkes DEj Wang Y，CaiH，Collins Kj Stewart BA，Lee SR, Wilamowska Kj Weinberg Zj Ruzzo WLj Wloga D，GaertigJj Frankel Jj Tsao CCj Gorovsky MAj Keeling PJj Waller RF, Patron NJj Cherry JMj StoverNA，Krieger CJ，del Toro Cj Ryder HF, Williamson SC，Barbeau RA, Hamilton EP，OriasE.Macronuclear genome sequence of the ciliate Tetrahymena thermophila, a modeleukaryote.Plos Biol.2006.4(9):e286.);可从the National Tetrahymena Stock Center(http://tetrahymena.vet.Cornell, edu/index, html)购买。嗜热四膜虫B2086株系:康奈尔大学Bruns教授馈赠，参考文献JacekGaertig and Martina A.Gorovaky.Efficient mass transformation of Tetrahymenathermophila by electroporation of conjugants.Proc.Nat 1.Acad.Sc 1.USA.1992.89 (19):9196-9200.;可从 the National Tetrahymena Stock Center (http://tetrahymena.vet.Cornell, edu/index, html)购买 pNeo4载体:由奥地利科学院分子技术研究所Mochizuki教授馈赠，参考文献 Mochizuki K.High efficiency transformation of Tetrahymena using acodon-optimized neomycin resistance gene.Gene.2008.425 (1-2):79-83.。p，p，-DDT =Supelco,美国，产品编号:N12810，结构式如下:
权利要求
1.过表达CYP5013C2基因的四膜虫在降解DTT中的应用；所述CYP5013C2基因为编码CYP5013C2蛋白的基因；所述0￥ 501302蛋白为如下(a)或(b): Ca)由序列表中序列I所示的氨基酸序列组成的蛋白质； (b)将序列I的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列I衍生的蛋白质。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于:所述CYP5013C2基因为如下I)或2)或3)的DNA分子: 1)编码区如序列 表中序列2所示的DNA分子； 2)在严格条件下与I)限定的DNA序列杂交且编码具有相同功能的蛋白的DNA分子； 3)与I)限定的DNA序列具有90%以上同源性且编码具有相同功能的蛋白的DNA分子。
3.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于:所述过表达CYP5013C2基因的四膜虫是在出发四膜虫中导入含有所述CYP5013C2基因的DNA片段得到的重组四膜虫。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于:所述出发四膜虫为嗜热四膜虫B2086株系。
5.CYP5013C2基因在促进四膜虫降解DTT中的应用；所述CYP5013C2基因为编码CYP5013C2蛋白的基因；所述CYP5013C2蛋白为如下(a)或(b): Ca)由序列表中序列I所示的氨基酸序列组成的蛋白质； (b)将序列I的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列I衍生的蛋白质。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于:所述CYP5013C2基因为如下I)或2)或3)的DNA分子: 1)编码区如序列表中序列2所示的DNA分子； 2)在严格条件下与I)限定的DNA序列杂交且编码具有相同功能的蛋白的DNA分子； 3)与I)限定的DNA序列具有90%以上同源性且编码具有相同功能的蛋白的DNA分子。
7.含有CYP5013C2基因的DNA片段、重组载体或重组四膜虫；所述CYP5013C2基因为编码CYP5013C2蛋白的基因；所述CYP5013C2蛋白为如下(a)或(b): Ca)由序列表中序列I所示的氨基酸序列组成的蛋白质； (b)将序列I的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列I衍生的蛋白质。
8.如权利要求7所述的DNA片段、重组载体或重组四膜虫，其特征在于:所述CYP5013C2基因为如下I)或2)或3)的DNA分子: 1)编码区如序列表中序列2所示的DNA分子； 2)在严格条件下与I)限定的DNA序列杂交且编码具有相同功能的蛋白的DNA分子； 3)与I)限定的DNA序列具有90%以上同源性且编码具有相同功能的蛋白的DNA分子。
9.一种蛋白质，为如下(a)或(b): Ca)由序列表中序列I所示的氨基酸序列组成的蛋白质； (b)将序列I的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列I衍生的蛋白质。
10.编码权利要求9所述蛋白质的基因，为如下I)或2)或3)的DNA分子: I)编码区如序列表中序列2所示的DNA分子；2)在严格条件下与I)限定的DNA序列杂交且编码具有相同功能的蛋白的DNA分子；3)与I)限定的DNA序列具有90%以上同源 性且编码具有相同功能的蛋白的DNA分子。
全文摘要
本发明公开了一种CYP5013C2蛋白及其编码基因，并提供了表达CYP5013C2蛋白的四膜虫及其在降解DDT中的应用。本发明保护过表达CYP5013C2基因的四膜虫在降解DTT中的应用；所述CYP5013C2基因为编码如下(a)或(b)(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列1衍生的蛋白质。本发明的重组四膜虫有以下优点(1)CYP5013C2基因对DDT的胁迫响应特异而灵敏；(2)CYP5013C2基因参与DDT在四膜虫细胞内的生物转化过程；(3)具有高效降解DDT的功能；(4)能将水体中DDT控制在食物链底端；(5)不污染环境。
文档编号C12N15/30GK103223219SQ20131012493
公开日2013年7月31日 申请日期2013年4月11日 优先权日2013年4月11日
发明者缪炜, 冯立芳, 袁冬霞 申请人:中国科学院水生生物研究所