专利名称：西瓜果实苦味基因Bt连锁SNP位点及CAPS标记的制作方法
技术领域：
本发明属于基因序列及其获取方法领域，具体涉及与西瓜果实苦味基因(bitterness, Bt)连锁SNP位点及CAPS标记的获得方法。
背景技术：
西瓜(Citrullus Ianatus)属于葫芦科重要作物，占世界蔬菜作物面积7%,全球年产量约为90，000，000吨(11 ://^&08丨&丨.fa0.0rg)。我国西瓜产销量位于世界第一，是我国具有国际竞争力和较大经济增长空间的重要园艺作物。近期西瓜全基因组序列的发布，极大促进了西瓜分子生物学研究，为分子设计辅助育种提供了更加坚实的基础。随着西瓜基因组时代的到来，进一步明确基因功能，寻找控制西瓜重要性状的关键基因，是目前西瓜分子生物学研究的首要内容。西瓜起源于非洲，原产非洲的野生西瓜包含两个生化类型，一种果实含有葫芦素(Cucurbitacin)，具有苦味，另一种不含葫芦素；后一种随着人们的选育成为目前主栽品种。目前在西瓜种质资源库(http://www.ars-grin.gov/)所存的西瓜种质资源中有多份材料都具有果实苦味这一性状，通常具有苦味果实的西瓜种质资源表现出对很多病害的抗性，适合西瓜抗性育种采用，但同时由于苦味是一种不良性状且遗传表现为显性遗传，给育种选育过程增加了难度。通过鉴定苦味基因，开发其紧密连锁的分子标记进行品种初期筛选，达到分子辅助育种的目的，可大大缩短育种的周期提高育种效率。此外，葫芦科其他作物如黄瓜等果实苦味发生更为严重，对生产影响更大，其果实苦味鉴定较困难且受很多因素影响，导致了目前尚未发现果实苦味基因。因此，西瓜育种领域的科研和实践中需要提出一种西瓜果实苦味基因Bt连锁SNP位点及CAPS标记及其获取方法
发明内容
本发明的目的是获得与西瓜果实苦味基因Bt连锁SNP位点及CAPS标记。本发明的目的是通过以下技术方案实现的:所述的西瓜果实苦味连锁的SNP位点及CAPS标记，具有序列表中的SEQ IDN0:1 2的核苷酸碱基序列。序列表中SEQ ID NO:1为引物对Bt-F和Bt-R、对非苦味材料特异性扩增的核苷酸序列；序列表中SEQ ID N0:2为引物对Bt-F和Bt-R、对果实苦味材料特异性扩增的核苷酸序列。本发明的目的是通过以下另一技术方案实现的:西瓜果实苦味基因Bt连锁SNP位点及CAPS标记的获取方法，该标记具有序列表中的SEQ ID NO:1 2的核苷酸碱基序列；该获取方法包括以下步骤:A、供试材料选取:所述的供试材料包括父本、母本、Fl代、RILs群体、重测序材料、自然群体；B、供试材料果实苦味风味的确定:采用口尝的方法鉴定上述各个供试材料的果实，得到鉴定出果实苦味的单株；C、对所述的RILs群体中的鉴定出果实苦味的单株与该RILs群体所构建的高密度分子标记遗传图谱进行遗传连锁分析，初步定位目标基因区间；D、候选SNP的获得:对所述的重测序材料在所述的初步定位基因区间内进行基因组序列比对，获取与西瓜材料表型性状完全符合的候选SNP位点；E、基因组DNA提取:分别提取所述的父本、母本、Fl代、RILs群体、自然群体的各自的基因组DNA ；F、针对所述的候选SNP位点设计所述的CAPS标记,在所述的父本、母本、Fl代、RILs群体中验证所述的候选SNP位点，获得与西瓜果实苦味基因Bt连锁的CAPs标记。本发明的有益效果为:本发明通过筛选RILs群体中的苦味单株；结合西瓜高密度遗传图谱信息，将西瓜果实苦味基因进行初步定位；利用西瓜全基因重测序信息，对参试的20份西瓜重测序材料初步定位基因区间全部SNP位点进行与果实苦味风味的连锁分析，获取与果实苦味性状连锁的SNP位点。本发明将与性状连锁的候选SNP位点结合分离群体验证分析及自然群体验证分析，获取与目的性状紧密连锁的标 记，可应用于西瓜品种改良分子辅助育种，为西瓜品质分子育种提供技术支持，同时大大缩短了传统基因定位的时间。本发明对RILs分离群体及自然群体进行果实风味鉴定并利CAPS标记分子检测所述SNP位点与目的性状连锁情况；利用上述特异CAPS标记，可以用来对品种进行初期筛选，达到分子标记辅助育种的目的，大大缩短育种周期，具有重要的理论及实践意义。
图1为实施例1中西瓜果实苦味基因Bt初步定位结果图。图2为实施例1中初步定位基因区间西瓜20个重测序材料序列比对后获得的候选SNP位点图。图3为实施例1中引物对Bt-F和Bt-R对父本(苦)、母本(不苦XSFl代的PCR扩增反应条带及该PCR扩增产物利用NspI酶切后的结果电泳图。图4为实施例1中引物对Bt-F和Bt-R对RILs群体的PCR扩增反应条带及该PCR扩增产物利用NspI酶切后的结果电泳图。图5为实施例1中引物对Bt-F和Bt-R对自然群体的PCR扩增反应条带及该PCR扩增产物利用NspI酶切后的结果电泳图。
具体实施例方式实施例1:本实施例为西瓜果实苦味基因Bt连锁SNP位点及CAPS标记，以及该标记的获取方法。所述的西瓜果实苦味基因Bt连锁SNP位点及CAPS标记，具有序列表中的SEQ IDN0:1 2的核苷酸碱基序列。序列表中SEQ ID NO:1为引物对Bt-F和Bt-R对非苦味材料特异性扩增的核苷酸序列，共503个碱基；序列表中SEQ ID NO: 2为引物对Bt-F和Bt-R对果实苦味材料特异性扩增的核苷酸序列，共503个碱基；该获取方法包括以下步骤:A、供试材料选取:所述的供试材料包括父本、母本、Fl代、RILs群体、重测序材料、自然群体；所述的父本为:PI296341FR，为典型野生类型西瓜材料，果实具有苦味；所述的母本为:97103，为典型的东亚类型西瓜栽培品种，果实无苦味，含糖量高；所述的Fl代为:以上述为亲本进行杂交获取的Fl代；所述的RILs群体为:该Fl代自交多代获得的RILs群体，共103株，包58含株果实非苦味株系和45株果实苦味株系(详见表I)；所述的重测序材料为:13份果实非苦味材料和7份果实苦味材料，共20份(详见表2)； 所述的自然群体为:在1484份西瓜资源库中经过风味鉴定共发现69份资源果实可能具有苦味，将这69份苦味资源加上随机选择的果实不具苦味资源，得到200份西瓜种质资源构成的自然群体(详见表3)；上述各个供试材料均为北京市农林科学院蔬菜研究中心种质资源库保存的种质资源材料。B、供试材料果实苦味风味的确定:采用口尝的方法鉴定上述各个供试材料的果实，得到果实苦味的单株:每株系连续种植4年，有3年及以上的单株果实鉴定为苦味，该株系即定为果实苦味，不再品尝，否则需继续品尝。每株每次由对苦味敏感者同时品尝，以确保试验结果的准确性。步骤B中的验证结果与分析如下:西瓜果实苦味基因遗传规律分析。根据步骤B中对苦味亲本PI296341FR (父本)、非苦味亲本97103 (母本)、Fl群体的单株、103个RILs分离群体单株进行果实苦味鉴定。结果表明PI296341FR、97103和Fl的果实苦味性状分别为苦、不苦、和苦。该Fl多代自交后获得RILs群体果实苦味鉴定结果表明:103个单株中有45个果实苦味单株和58个果实不具苦味单株，卡平方检验X 2=1.3981，df=l，P=0.237，差异不显著，符合I:1的理论分离比例。综合上述双亲、Fl和103个RILs分离群体单株果实风味鉴定结果，得出西瓜果实苦味基因为单基因控制的显性性状。根据步骤B对所述重测序材料、自然群体的单株果实苦味鉴定结果详见表2、表3。C、利用Joinmap4.0软件对所述的RILs群体中风味鉴定出果实苦味的单株与该RILs群体所构建的高密度分子标记遗传图谱进行遗传连锁分析，初步定位目标基因区间。所述的高密度分子标记遗传图谱的构建方法记载于《A High Resolution GeneticMap Anchoring Scaffolds of the Sequenced Watermelon Genome》，(PLoS One,2012)；步骤C中的验证结果与分析如下:西瓜果实苦味基因的初步定位分析。利用步骤C中Joinmap4.0软件对结果进行遗传连锁分析，将果实苦味基因Bt定位在西瓜I号染色体上，具体位于bin9 binll的范围内；图1为西瓜果实苦味基因Bt初步定位结果图。
D、候选SNP的获得:利用西瓜全基因重测序结果，对所述的重测序材料在所述的初步定位基因区间内进行基因组序列比对，获取与西瓜材料表型性状完全符合的候选SNP位点；寻找所述的重测序材料中与其苦味鉴定密切连锁的SNP位点，发现初定位区间内有一处SNP位点(C — T)的变化与苦味连锁。在苦味品种中该位点为C，而在非苦味品种中该位点为T。步骤D中的验证结果与分析如下:目标性状与连锁SNP位点比对分析。步骤D中，利用20份西瓜代表种质全基因组重测序信息，对初步定位的第I号染色体bin9 binll区间范围内所有SNP位点连锁分析，得到与20份材料果实苦味表型完全相符的I个SNP位点，分析结果显示位于西瓜基因组I号染色体上4169032bp处发生的C-T的变化与果实苦味风味共分离，如图2所示。E、基因组DNA提取:分别提取所述的父本、母本、Fl代、RILs群体、自然群体的基因组DNA ；所述的DNA提取方法在参照Murry等(1980)的方法(Murray M, ThompsonW F.Rapid isolation of high molecular weight plant DNA[J].Nucl AcidRes, 1980，8:668-673.)的基础上改进而成；具体步骤如下:1.上述各供试材料的叶片1.5克，在液氮中研磨成粉末，再加入9ml2%CTAB提取液(2%CTAB，1.4mM NaCl, IOOmMTris-HCl pH8.0,20mM EDTA ρΗ8.0，1%PVP_40，0.2%β -巯基乙醇)，混勻，于65°C水浴I小时，得到混合物A ； .将所述的混合物A停止水浴，加入1/3体积的5Μ的醋酸钾溶液，混匀后冰浴20分钟；再加入等体积的氯仿/异戊醇(24:1)抽提两次，得到上清液A ；ii1.向所述的上清A中加入2/3体积异丙醇用来沉淀DNA ;再用洗涤缓冲液(75%乙醇，IOmM乙酸铵)洗涤一次，吹干后加TE缓冲液(IOmM Tris-HCl，ImM EDTA，pH7.4)溶解，得到溶液A ；iv.向所述的溶液A中加入RNase A，使其终浓度达100 μ g/ml，再混匀37°C水浴I小时；再用等体积氯仿/异戊醇(24:1)抽提一次，得到上清液B ；V.向所述的取上清液B中加入1/2体积7.5M醋酸铵、2倍体积无水乙醇，得到DNA沉淀；v1.用70%乙醇洗涤所述的DNA沉淀，吹干后加适量ddH20溶解DNA，得到各自的基因组DNA ;再用紫外分光光度计(Shimadzu UV-1201,日本)以0D260值测定所述的各自的基因组DNA的浓度，再用1.2%琼脂糖凝胶电泳检测各自的基因组DNA的提取质量。F、利用互联网上公布的西瓜全基因组序列信息，针对所述的候选SNP位点设计所述的CAPS标记，在所述的父本、母本、Fl代、RILs群体中验证所述的候选SNP位点，获得与西瓜果实苦味基因Bt连锁的CAPS标记。具体的操作为:针对所述的候选SNP位点设计所述的CAPS标记；对所述的父本、母本、Fl代、RILs群体各自的基因组DNA进行PCR扩增反应，得到各自的PCR扩增产物；再对上述各自的PCR扩增产物进行酶切反应，得到各自的酶切产物；上述西瓜全基因序列信息来源于西瓜基因组信息网站，网站为http://www.1wg1.0rg ；上述PCR扩增反应中，所用引物序列如下:Bt-F(上游引物序列):5，-CTGAGATGGAAGGA GGTCTCTGTC-3，，Bt-R(下游引物序列):5’ -GTTTCGATGCAGTTAACTCGATG-3’ ；上述引物由上海生工公司北京合成部合成。上述PCR扩增反应的反应体系为:2.5μ L含15mM MgCl2的IOXBuffer ;2.5 μ L浓度为2.5mM的dNTPs ；1U Taq DNA聚合酶；2 μ L浓度为IOmM PCR上、下游混合引物(上下游引物各I μ L) ；50ng模板DNA ；ddH20补足到25 μ L ；Taq DNA聚合酶及反应缓冲液购自TaKaRa公司。dNTPs购自北京全式金生物技术有限公司；上述PCR扩增反应的反应程序为:阶段1:94°C预变性 5min ;阶段 2:94V 20s,56°C 20s,72°C 30s，共循环 34 次；阶段3:72°C延伸5min ;阶段4:4°C保持。其中PCR仪为购自Applied Biosystems公司的Veriti96well Thermal Cycler ；上述酶切反应的反应体系为:1.0 μ LlOXNEB Buffer, 0.1 μ LlOOXBSA, 0.2 μ L NspI 限制内切酶，4 μ LPCR 产物，双蒸水补齐至IOyL;上述酶切反应的反应程序为:37°C 酶切 2h 后 4°C 保持；上述PCR扩增产物/酶切产物的检测:取4μ L上述PCR扩增产物/10μ L上述酶切产物，加入I μ IlOXLoading Buffer，移液器混匀后取点入1%琼脂糖凝胶中，110V/500mA电泳，时间为30min ；所述的CAPS标记具有序列表中的SEQ ID NO:1 2的核苷酸碱基序列。步骤F中的验证结果与分析如下:RILs群体及自然群体材料基因型验证分析。步骤F中，通过对双亲、Fl、103个RILs分离群体单株及200份自然群体材料进行PCR扩增，根据差异处碱基序列设计CAPS标记，苦味品种经引物对Bt-F和Bt-R扩增后的PCR产物可以由DNA限制内切酶NspI切成两段大小为180bp和323bp的两段，而非苦味品种则不能被切开，如图3，4，5所示。图3为父本、母本、Fl的CAPS标记检测结果(泳道I为分子量Marker ;泳道2和3为父本PCR产物及CAPS酶切产物；泳道4和5为母本PCR产物及CAPS酶切产物；泳道6和7为Fl的PCR产物及CAPS酶切产物)。图4为103株RILs群体部分株系CAPS标记检测(泳道I为分子量Marker ;其他泳道各株系PCR产物及CAPS酶切产物)，实验结果显示风味鉴定结果与标记检测结果呈现出共分离。G、利用所述的 CAPS标记对所述的自然群体进行验证:为进一步验证所述的CAPS标记与西瓜果实苦味基因Bt的连锁关系，利用所述的自然群体进行验证。以所述的自然群体的基因组DNA为模板进行PCR扩增反应，得到自然群体的PCR特异片段；再将上述PCR特异片段进行酶切反应，得到自然群体酶切产物。
具体的操作为:1.PCR反应扩增特异片段。反应体系(25yL)中含有:2.5yL含15mM MgCl2的IOXBuffer ;2.5μ L浓度为 2.5mM 的 dNTPs ；1U TaqDNA 聚合酶；2μ L 浓度为 IOmM PCR 上、下游引物混合引物(采用步骤F中的PCR引物，上下游引物各I μ L) ；50ng模板DNA ；ddH20补足到25 μ L ；Taq DNA聚合酶及反应缓冲液购自TaKaRa公司。dNTPs购自北京全式金生物技术有限公司；PCR扩增反应程序为:阶段1:94°C预变性5min ;阶段2:94°C 20s,56°C 20s，72°C30s，共循环34次；阶段3:72°C延伸5min ;阶段4:4°C保持。其中PCR仪为购自AppliedBiosystems 公司的 Veriti 96 well Thermal Cycler ；i1.上述PCR特异片段经1%琼脂糖电泳检测正确后，用限制性内切酶为NspI (购自New England Biolabs)对其进行酶切反应,酶切后经1%琼脂糖电泳检测；酶切反应体系10μ L 中含有:1.0μ L 10ΧΝΕΒ Buffer, 0.1 μ LlOO X BSA, 0.2 μ LNspI限制内切酶，4 μ L PCR特异片段，双蒸水补齐至IOyL;所述的酶切反应程序为:37°C酶切2h后4°C保持；扩增产物/酶切产物的检测:取4 μ L PCR扩增产物及10 μ L酶切产物，加入I μ IIOXLoading Buffer，移液器混匀后取点入1%琼脂糖凝胶中，110V/500mA电泳，时间为30min即可。电泳结果如图5所示，果实苦味品种的503bp的PCR产物可以被切成大小分别为180bp和323bp的两段，而非苦味品种则不能被内切酶切开。经过引物对Bt-F和Bt-R扩增后利用NspI限制酶酶切，结果显示200份自然群体材料中共有196份材料的标记检测与风味鉴定相符，有4份参试份材料鉴定结果不符(如图5中，西瓜种质资源材料的PCR扩增产物及酶切产物)。其中3份材料风味鉴定为甜，而标记检测结果为A (可切开，苦味标记)，另有I份材料风味鉴定为苦而标记为B (不可切开，非苦味标记)。统计该CAPS标记对资源鉴定符合`率为98%。上述酶切反应结果进一步证实了所设计的CAPS标记与西瓜果实苦味基因Bt紧密连锁；说明该SNP位点以及利用该SNP位点所设计的CAPS标记在鉴别西瓜果实苦味上有非常高的利用价值，可以有效地运用于西瓜分子辅助育种。本实施例中，所采用的试剂和仪器均为市场常规产品。显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所做的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其他不同形式的变化或变动。这里无法对所有的实施方式予以穷举。凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。附表:表1:步骤A和步骤B中，RILs群体单株果实苦味鉴定结果(标记检测中A为苦味带型，B为非苦味带型，AB为两种带型均具有)
权利要求
1.西瓜果实苦味基因Bt连锁SNP位点及CAPS标记，其特征在于:该标记具有序列表中的SEQ ID NO:1 2的核苷酸碱基序列。
2.西瓜果实苦味基因Bt连锁SNP位点及CAPS标记的获取方法，其特征在于:该标记具有序列表中的SEQ ID NO:1 2的核苷酸碱基序列； 该方法包括如下步骤: A、供试材料选取:所述的供试材料包括父本、母本、Fl代、RILs群体、重测序材料、自然群体； B、供试材料果实苦味风味的确定:采用口尝的方法鉴定上述各个供试材料的果实，得到鉴定出果实苦味的单株； C、对所述的RILs群体中的鉴定出果实苦味的单株与该RILs群体所构建的高密度分子标记遗传图谱进行遗传连锁分析，初步定位目标基因区间； D、候选SNP的获得:对所述的重测序材料在所述的初步定位基因区间内进行基因组序列比对，获取与西瓜材料表型性状完全符合的候选SNP位点； E、基因组DNA提取:分别提取所述的父本、母本、Fl代、RILs群体、自然群体的各自的基因组DNA ； F、针对所述的候选SNP位点设计所述的CAPS标记，在所述的父本、母本、Fl代、RILs群体中验证所述的候 选SNP位点，获得与西瓜果实苦味基因Bt连锁的CAPs标记。
3.根据权利要求2所述的西瓜果实苦味基因Bt连锁SNP位点及CAPS标记的获取方法，其特征在于: 步骤D中，所述的SNP位点为:西瓜基因组I号染色体碱基位置为4169032bp处，碱基变化为C — T。
4.根据权利要求2或3所述的西瓜果实苦味基因Bt连锁SNP位点及CAPS标记的获取方法，其特征在于: 步骤F的具体操作为: 针对所述的候选SNP位点设计所述的CAPS标记；对所述的父本、母本、Fl代、RILs群体各自的基因组DNA进行PCR扩增反应，得到各自的PCR扩增产物；再对上述各自的PCR扩增产物进行酶切反应，得到各自的酶切产物。
5.根据权利要求4所述的西瓜果实苦味基因Bt连锁SNP位点及CAPS标记的获取方法，其特征在于: 步骤F中，所述的PCR扩增反应中，上下游引物具有以下核苷酸碱基序列: Bt-F(上游引物):5’ -CTGAGATGGAAGGA GGTCTCTGTC-3’， Bt-R(下游引物):5’ -GITTCGATGCAGTTAACTCGATG-3’， 步骤F中，所述的PCR扩增反应中，反应程序为::阶段1:94°C预变性5min;阶段2:940C 20s, 560C 20s, 72°C 30s，共循环 34 次；阶段 3:72°C延伸 5min ;阶段 4:4°C保持。
6.根据权利要求4所述的西瓜果实苦味基因Bt连锁SNP位点及CAPS标记的获取方法，其特征在于: 步骤F中，所述的酶切反应中，采用的限制内切酶为:Nsp I ； 步骤F中，所述的酶切反应中，反应程序为:37°C酶切2h后4°C保持。
7.根据权利要求2所述的西瓜果实苦味基因Bt连锁SNP位点及CAPS标记的获取方法，其特征在于: 步骤E中，所述的基因组DNA的提取方法为:i.取所述的父本、母本、Fl代、RILs群体、自然群体的叶片每单株各1.5克，在液氮中研磨成粉末，再加入 9ml 的 2%CTAB 提取液(2%CTAB，1.4mM NaCl, IOOmM Tris-HCl pH8.0,20mMEDTA ρΗ8.0，1%PVP_40，0.2% β -巯基乙醇)，混匀，于65°C水浴I小时，得到混合物A ； .将所述的混合物A停止水浴，加入1/3体积的5Μ的醋酸钾溶液，混匀后冰浴20分钟；再加入等体积的氯仿/异戊醇(24:1)抽提两次，得到上清液A ； ii1.向所述的上 清A中加入2/3体积异丙醇用来沉淀DNA ;再用洗涤缓冲液(75%乙醇，IOmM乙酸铵)洗涤一次，吹干后加TE缓冲液(IOmM Tris-HCl，ImM EDTA，pH7.4)溶解，得到溶液A ; iv.向所述的溶液A中加入RNase A，使其终浓度达100 μ g/ml，再混匀37°C水浴I小时；再用等体积氯仿/异戊醇(24:1)抽提一次，得到上清液B ; V.向所述的取上清液B中加入1/2体积7.5M醋酸铵、2倍体积无水乙醇，得到DNA沉淀； v1.用70%乙醇洗涤所述的DNA沉淀，吹干后加适量ddH20溶解DNA，得到各自的基因组 DNA。
8.根据权利要求2所述的西瓜果实苦味基因Bt连锁SNP位点及CAPS标记的获取方法，其特征在于: 步骤A中，所述的父本为:PI296341FR，为典型野生类型西瓜材料； 所述的母本为:97103，为典型的东亚类型西瓜栽培品种，果实无苦味； 所述的Fl代为:以上述为亲本进行杂交获取的Fl代； 所述的RILs群体为:该Fl代自交多代获得的RILs群体； 所述的重测序材料包括:果实非苦味材料和果实苦味材料； 所述的自然资源材料为资源库中随机挑选的材料，包括:果实非苦味材料和果实苦味材料。
全文摘要
本发明属于基因序列及其获取方法领域，具体涉及与西瓜果实苦味基因(bitterness,Bt)连锁SNP位点及CAPS标记的获得方法。所述的西瓜果实苦味连锁的SNP位点及CAPS标记，具有序列表中的SEQ ID NO:1～2的核苷酸碱基序列。本发明通过筛选RILs群体中的苦味单株；结合西瓜高密度遗传图谱信息，将西瓜果实苦味基因进行初步定位；将与性状连锁的候选SNP位点结合分离群体验证分析及自然群体验证分析，获取与目的性状紧密连锁的标记，可应用于西瓜品种改良分子辅助育种，为西瓜品质分子育种提供技术支持，同时大大缩短了传统基因定位的时间。
文档编号C12N15/10GK103194444SQ201310124560
公开日2013年7月10日 申请日期2013年4月11日 优先权日2013年4月11日
发明者许勇, 张洁, 张海英, 宫国义, 郭绍贵, 任毅 申请人:北京市农林科学院, 北京京研益农科技发展中心