专利名称：转基因甜菜h7-1的lamp现场快速检测方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学和核酸检测技术领域。具体地，本发明涉及转基因甜菜H7-1的检测方法和试剂盒。
背景技术：
1998年，转基因甜菜首次被批准商业化种植。至今，转基因甜菜已经在美国、加拿大、新西兰、澳大利亚等国被批准种植。2009年，美国转基因甜菜的种植面积占全国甜菜种植面积的95%。甜菜是加工白糖的主要原料，占白糖加工原料的1/3 ;其副产品有糖蜜和甜菜柏，均可用于食品和饲料。甜菜肉柏是食用纤维的主要原料之一，被广泛应用于食品加工行业。甜菜柏也被广泛用于养猪、养牛业的饲料，尤其是奶牛养殖业的首选优质饲料。世界各国对转基因生物的安全性问题争议较大，欧盟、日本、韩国、中国等国家出台了转基因产品标签制度及相关法规，要求对转基因产品进行强制性标识。2006年，日本发布“关于转基因食品质量标签标准的修正草案”，要求对糖用甜菜及以糖用甜菜作为主要配料的加工食品强制性标识转基因成分。现在出口商要求出口到欧盟、日本等国的白糖、甜菜柏等甜菜加工产品，要求出具非转基因检测证书。所以，检验检疫口岸急需转基因甜菜的检测标准方法，以促进出口和保护我国利益。目前大面积种植的是抗草甘膦甜菜H7-1。转基因甜菜H7-1是Monsanto公司产品，美国2004年，菲律宾2005年被批准食用；该品系改变的性状为耐除草剂，所含外源基因有:FMV35s、E93\ cp4epsps和ctp2。国内外已有转基因甜菜H7-1检测的研究报道，方法主要是PCR方法。PCR方法由于高特异性、高灵敏度被广泛应用，然而本方法只能用于实验室检测，需配置高精尖仪器，操作人员需有专业知识，不适用于现场快速检测。随着贸易发展和企业的现场监控，口岸简易实验室和进出口企业越来越需要现场的、快速的、不需高昂设备仪器和专业人员的检测方 法。当前转基因甜菜H7-1品系的标准检测方法主要依据欧盟规定的方法。甜菜H7-1品系标准检测方法的文献依据是欧盟发布的官方方法“CRLVL28/04VP Event-specificMethod for the Quantitation of sugar beet line H7_lUsing Real-timePCR (Corrected versionl) ”,该方法采用的是TaqMan实时突光PCR方法,检测转入事件与甜菜基因组结合点区域。但是，这种方法都需要高端仪器设备、专业操作人员。本领域目前还没有检测效果良好且操作简单、设备要求低的特异性检测转基因甜菜成分的试剂和方法。
发明内容
本发明的目的在于提供转基因甜菜H7-1的检测方法和试剂盒。在本发明的第一方面，提供一种鉴定转基因甜菜H7-1成分的方法，所述方法包括:以待测样品的DNA为模板，以特异性扩增转基因甜菜H7-1的引物进行扩增；若发生特异性扩增，则表明待测样品中包含转基因甜菜H7-1成分；其中，所述的特异性扩增转基因甜菜H7-1的引物包括:上游外引物SEQ ID N0:1，下游外引物SEQ ID N0:2，上游内引物EQID N0:3，下游内引物SEQ ID NO: 4，上游环引物SEQ ID NO: 5，下游环引物SEQ ID N0:6。。在一个优选例中，所述的扩增是环介导等温扩增(LAMP)。在另一优选例中，所述的环介导等温扩增包括:63土1°C (较佳地63±0.5V )恒温反应90 土 IOmin (较佳地90 土 5min)，然后在80 ± 2°C (较佳地80 ± I °C )灭活5 土 Imin (较佳地5±0.5min)，结束反应。在另一优选例中，所述的环介导等温扩增的体系中包括弓I物、Mg2+、甜菜碱、dNTPs ；其中，Mg2+浓度8± ImM ;甜菜碱浓度1±0.1M ;dNTPs浓度1.6±0.2mM。在另一优选 例中，在环介导等温扩增反应结束后，在扩增产物中加入SYBR GreenI荧光染料观察颜色变化，没有扩增产物的阴性管呈橙色，有扩增产物的阳性管为绿色在另一优选例中，所述的待测样品是种子、食品或饲料。在本发明的另一方面，提供一种引物，所述引物是LAMP扩增引物，包括:上游外引物SEQ ID NO: 1，下游外引物SEQ ID N0:2，上游内引物EQ ID NO:3，下游内引物SEQ IDN0:4，上游环引物SEQ ID N0:5，下游环引物SEQ ID N0:6。在本发明的另一方面，提供所述的引物的用途，用于从待测样品中鉴定转基因甜菜H7-1成分。在本发明的另一方面，提供一种鉴定转基因甜菜H7-1成分的试剂盒，其中包括前面所述的引物。在一个优选例中，所述试剂盒中还包括:含有转基因甜菜H7-1成分的检测标准品；DNA提取试剂；pH 缓冲试剂(如 Tris-HCl (PH8.8))；钾离子溶液；镁离子溶液；铵离子溶液；Tween20 ；甜菜碱；dNTP ；Bst大片段DNA聚合酶；荧光染料(如SYBR Green I荧光染料);和/或说明鉴定转基因甜菜H7-1成分的方法的使用说明书。本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
图1、LAMP弓丨物的LAMP反应结果。 CH5-6:阴性对照，CH7-8:阳性对照。图2、LAMP引物引入环引物的LAMP反应结果。CH1-2:阴性对照，CH3-4:阳性对照。
图3、引物特异性图。A:CHl-8依次为:转基因甜菜H7-1，转基因棉花M0N531，转基因大豆M0N89788，转基因大米Bt63，转基因油菜MS8XRF3，转基因玉米GA21，转基因玉米M0N810，转基因玉米Mon863 XMon810。B:CHl-8依次为:转基因玉米M0N863，转基因玉米M0N88017，转基因玉米NK603，转基因玉米MIR604，转基因玉米M0N89034，转基因玉米CBH351，转基因玉米B11，转基因玉米 BT176。C:CHl-8依次为:转基因玉米EVENT98140，转基因马铃薯EH92-527-1，转基因大豆DP305423，转基因大豆DP356043，转基因大豆GTS40-3-2，转基因大米科丰6号，转基因大米科丰8号，转基因油菜GT73。图4、LAMP引物的灵敏度。CHl:100% ；CH2:5% ；CH3:1% ；CH4:0.5% ；CH5:0.1% ；CH6:阴性对照(超纯水)。图5、5%模拟样品稳定性实验图。A =CHl:阳性对照，CH2:阴性对照(超纯水)，CH3-8:5%转基因甜菜H7-1模拟样
品OB:CHl-8:5%转基因甜菜H7-1模拟样品。C:CHl-6:5%转基因甜菜H7-1模拟样品。
`
图6、1%模拟样品稳定性实验图。A:CHl-8:1%转基因甜菜H7-1模拟样品。B:CHl-8:1%转基因甜菜H7-1模拟样品。C =CHl:阳性对照，CH2:阴性对照，CH3-6:1%转基因甜菜H7_l模拟样品。图7、0%空白样品稳定性实验图。A =CHl:阳性对照，CH2:阴性对照，CH3-8:0%转基因甜菜H7-1样品。B:CHl-8:0%转基因甜菜H7-1样品。C:CHl-6:0%转基因甜菜H7-1样品。图8、转基因甜菜H7-1品系5%模拟样品的LAMP显色法检测结果。图中第一排第一管为阳性对照，第二管为阴性对照，其余为5%模拟样品。阴性对照以无菌水为模板，阳性对照以100%标准品为模板。图9、转基因甜菜H7-1品系1%模拟样品的LAMP显色法检测结果。图中第一排第一管为阳性对照，第二管为阴性对照，其余为1%模拟样品。阴性对照以无菌水为模板，阳性对照以100%标准品为模板。图10、转基因甜菜H7-1品系0.5%模拟样品的LAMP显色法检测结果。图中第一排第一管为阳性对照，第二管为阴性对照，其余为0.5%模拟样品。阴性对照以无菌水为模板，阳性对照以100%标准品为模板。图11、转基因甜菜H7-1品系0%空白样品的LAMP显色法检测结果。图中第一排第一管为阳性对照，第二管为阴性对照，其余为0%模拟样品。阴性对照以无菌水为模板，阳性对照以100%标准品为模板。图12、灵敏度实验的LAMP显色法检测结果。第一排从左至右依次为0%,0.1%, 0.5%, 1%模拟样品，第二排为阴性对照和阳性对照，阴性对照以无菌水为模板，阳性对照以10%标准品为模板。
具体实施例方式本发明人经过广泛而深入的研究和试验，首次揭示一种转基因甜菜H7-1的环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)检测方法。经过比较筛选，找到了针对转基因甜菜H7-1特异性良好的引物，所述引物针对含有转基因甜菜H7-1以外的DNA不发生特异性扩增。本发明的方法可良好地应用于鉴定转基因甜菜H7-1成分，并且具有良好的再现性、灵敏度。如本文所用，所述的“转基因甜菜H7-1成分”是指特异性来自于转基因甜菜H7-1的成分，区别于其它植物来源的成分，也区别于非转基因甜菜成分。如本文所用，所述的“食品”包含了饮料。本发明人通过对引物的筛选，获得一类可特异性鉴定转基因甜菜H7-1成分的引物，其对于转基因甜菜H7-1的DNA发生特异性扩增，而对没有转基因甜菜H7-1成分的DNA不发生特异性扩增。本发明采用环介导等温扩 增(LAMP)快速检测技术:根据转基因甜菜H7-1品系外源基因和甜菜边界序列设计特异性内引物、外引物和环引物各一对，特异性识别靶序列上的八个独立区域，利用Bst酶启动循环链置换反应，在甜菜H7-1品系特异靶序列启动互补链合成，在同一链上互补序列周而复始形成有很多环的花椰菜结构的茎-环DNA混合物，力口入显色液，即可通过颜色变化观察判定结果。因此，本发明提供一种引物，所述的引物是LAMP扩增引物，包括:上游外引物SEQID NO: 1，下游外引物SEQ ID N0:2，上游内引物EQ ID NO:3，下游内引物SEQ ID N0:4，上游环引物SEQ ID N0:5，下游环引物SEQ ID N0:6。本发明的这些弓I物还可以用放射性同位素、生物素、酶、荧光素或其他化学发光物质进行标记。利用本发明的引物，进行LAMP反应，并通过浊度仪检测或显色观察，就可以准确、快速地判断待测样品是否含有转基因甜菜H7-1成分，而且所需的样品量很少。本发明还提供了一种鉴定转基因甜菜H7-1成分的方法，所述方法包括:以待测样品的DNA为模板，以特异性扩增转基因甜菜H7-1的引物进行扩增；若发生特异性扩增，则表明待测样品中包含转基因甜菜H7-1成分。更优选地，基于本发明所提供的适用于鉴定转基因甜菜H7-1成分的特异性引物，所述方法包括:以待测样品的DNA为模板，以SEQ ID NO: KSEQ ID NO:2,SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:4, SEQ ID N0:5 和 SEQ ID N0:6 所示的引物进行扩增；若发生特异性扩增，则表明待测样品中包含转基因甜菜H7-1成分。LAMP是近年来发展的一种新颖和较成熟的等温核酸扩增技术。与PCR方法相比，LAMP不需要热循环仪(PCR仪)，且由于LAMP反应中产生大量的副产物-白色焦磷酸镁沉淀，扩增产物通过肉眼观察或浊度计即可判定结果；因此LAMP适合于现场、战时野外或条件较差的实验室进行快速检测。LAMP技术以其快速、准确和操作简便等优点在核酸的科学研究、病原微生物鉴定和转基因食品检测等领域得到了日益广泛的应用。总体而言，LAMP法是一种简便、快速、高特异的基因扩增法，不需要特殊的试剂和仪器设备，采用该方法能建立起总成本低廉的检测体系，在转基因食品检测等领域具有广阔的应用前景。
获取待测样品的DNA的方法是本领域技术人员所熟知的技术，例如可采取传统的酚/氯仿/异戊醇法，或者可采用一些商购的DNA提取试剂盒，这类试剂盒是本领域技术人员熟知的。本发明还涉及一种用于鉴定转基因甜菜H7-1成分的试剂盒，所述试剂盒中含有针对转基因甜菜H7-1的LAMP扩增引物。此外，所述的试剂盒还可含有其它鉴定转基因甜菜H7-1成分的试剂，如(但不限于):含有转基因甜菜H7-1成分的检测标准品；DNA提取试剂；pH缓冲试剂(如Tris-HCl (PH8.8));钾离子溶液；镁离子溶液；铵离子溶液；Tween20 ;甜菜碱；dNTP ；Bst大片段DNA聚合酶；荧光染料(如SYBR Green I荧光染料)。此外，所述的试剂盒中还可含有鉴定转基因甜菜H7-1成分的使用说明书和/或标准操作程序。本发明所述的试剂盒可实现快速检测、批量检测转基因甜菜H7-1成分的目的。本发明的主要优点在于:(I)首次揭示一种可特异性鉴定转基因甜菜H7-1成分的引物，所述的引物特异性良好，对于转基因甜菜H7-1成分能够实现特异性扩增，而对于转基因甜菜H7-1以外的其它成分不能特异性扩增。并且，所述引物具有良好的再现性、结果稳定可靠。(2)利用所述的引物或含有所述引物的检测试剂盒，可快速、大批量地检测转基因甜菜H7-1成分，从待测样品中快速准确地区分转基因甜菜H7-1成分，并且所需样品量少，操作简单。(3)本发明的方法用于食品安全突发事件现场的检测和食品生产企业生产过程控制中的样品检测，填补转 基因产品现场快速检测方法的空白。本发明的方法的推广应用对保障产品的质量，保护消费者知情权和选择权，维护正常的经济秩序等提供了技术支持。为食品的市场监督部门和检验检疫部门提供了技术支持。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。实施例1、转基因甜菜H7-1品系外源基因和甜菜边界序列转基因甜菜H7-1品系外源基因和甜菜边界序列如下(SEQ ID NO: 7):
A TCGTAA Π (；Τ('αΠ ΤΑ TC'AAAA TGTA( Χ 7777:4 TAA TAACCKI GC'GGACA TCTACA ΤΠ ΟΑΑ TTGAAAAAAAA TTddTAA TlA ( K 'Χ Χ TCC'AT AT TGACCA TCA TA CTCA TTGCiGAlX 'CATGTAGATTIX' CCGGAC A TG A AGCCA TTTACAA TTGAACiA TA C 7 AGTA AAACCTCATAGGTTTTACGTATTTC ATTTAGGGACTAAAATGGTTTAGGATA其中，斜体部分为外源载体序列，正体部分为甜菜H7-1基因组序列。实施例2、LAMP反应体系的建立2.1引物筛选
根据上述转基因甜菜H7-1品系外源基因和甜菜边界序列设计引物，包括上游外引物(F3)，下游外引物(B3)，上游内引物(FIP)，下游内引物(BIP);较佳地还包括上游环引物(LF)和下游环引物(LB)。设计多套引物，来进行比较筛选合适的引物。确定采用25 μ L的LAMP反应体系，其成分包括:FIP和BIP各1.6 μ M，F3和B3各0.2yM，Ii^PLB#0.8yM，20mM Tris-HCl (ΡΗ8.8), IOmM KCl,8mM MgSO4, IOmM (NH4)2SO4,0.1% Tween20，IM 甜菜碱，6mM MgSO4,1.6mM dNTP, 8 U Bst 大片段 DNA 聚合酶，2 μ I 待测DNA模板，余量为蒸馏水。具体操作时先在冰上准备LAMP反应混合液，扩增反应体系如下:2XReaction Mix(RM) 12.5 μ L，超纯水8.5 μ L，引物I μ L，Bst酶I μ L以及待测DNA模板2 μ L。将除模板外其他试剂配备成混合液混匀后，每管分装23 μ L，加入20 μ L密封液后再分别加入2 μ L模板DNA或阴阳性对照模板，混匀离心后将I μ L的显色液点在管盖中间，小心盖紧管盖，避免显色液掉入反应液中。最后参照LAMP浊度仪使用说明书，将混合物置于反应孔中，于63°C恒温反应90min，最后80°C下保温5min以结束反应。用100%的转基因甜菜H7-1标准品(阳性对照)作为模板进行引物的初步筛选，同时以无菌水作为阴性对照。经过广泛的试验和比对，本发明人最终确定了反应体系和引物，包括:上游外引物(F3，SEQ ID NO:1)，下游外引物(B3，SEQ ID N0:2)，上游内引物(FIP，SEQ ID NO: 3), T游内引物(BIP, SEQ ID N0:4)、上游环引物(LF, SEQ ID NO:5)和下游环引物(LB, SEQ IDΝ0:6) ο序列如下:F3:AACACTTAGCTTGGGACAA ；B3: TGATTGAACCCAATCTGGA ；
权利要求
1.一种鉴定转基因甜菜H7-1成分的方法，其特征在于，所述方法包括: 以待测样品的DNA为模板，以特异性扩增转基因甜菜H7-1的引物进行扩增；若发生特异性扩增，则表明待测样品中包含转基因甜菜H7-1成分； 其中，所述的特异性扩增转基因甜菜H7-1的引物包括:上游外引物SEQ ID N0:1，下游外引物SEQ ID N0:2，上游内引物EQ ID NO:3，下游内引物SEQ ID NO:4，上游环引物SEQ IDN0:5，下游环引物SEQ ID N0:6。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的扩增是环介导等温扩增。
3.如权利要求2所述的 方法，其特征在于，所述的环介导等温扩增包括:63±1°C恒温反应90±10min，然后在80±2°C灭活5±lmin，结束反应。
4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的环介导等温扩增的体系中包括引物、Mg2+、甜菜碱、dNTPs ； 其中，Mg2+浓度8± ImM;甜菜碱浓度1±0.1M ;dNTPs浓度1.6±0.2mM。
5.如权利要求2所述的方法，其特征在于，在环介导等温扩增反应结束后，在扩增产物中加入SYBR Green I荧光染料观察颜色变化，没有扩增产物的阴性管呈橙色，有扩增产物的阳性管为绿色
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的待测样品是种子、食品或饲料。
7.一种引物，其特征在于，所述引物是LAMP扩增引物，包括:上游外引物SEQ ID NO:1,下游外引物SEQ ID N0:2，上游内引物EQ ID NO:3，下游内引物SEQ ID N0:4，上游环引物SEQ ID N0:5，下游环引物 SEQ ID N0:6。
8.权利要求7所述的引物的用途，用于从待测样品中鉴定转基因甜菜H7-1成分。
9.一种鉴定转基因甜菜H7-1成分的试剂盒，其特征在于，其中包括权利要求7所述的引物。
10.如权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括: 含有转基因甜菜H7-1成分的检测标准品； DNA提取试剂； PH缓冲试剂； 钾离子溶液； 镁离子溶液； 铵离子溶液；Tween20 ； 甜菜碱； dNTP ； Bst大片段DNA聚合酶； 荧光染料；和/或 说明鉴定转基因甜菜H7-1成分的方法的使用说明书。
全文摘要
本发明涉及转基因甜菜H7-1的检测方法和试剂盒。经过比较筛选，找到了针对转基因甜菜H7-1特异性良好的LAMP引物，所述引物针对含有转基因甜菜H7-1以外的DNA不发生特异性扩增。本发明的方法可良好地应用于鉴定转基因甜菜H7-1成分，并且具有良好的再现性、灵敏度。
文档编号C12Q1/68GK103205499SQ20131012422
公开日2013年7月17日 申请日期2013年4月11日 优先权日2013年4月11日
发明者张舒亚, 周瑶, 王涛, 张坤 申请人:中华人民共和国上海出入境检验检疫局