专利名称：具毒性质粒沙门氏菌荧光pcr检测探针、试剂盒及检测方法
技术领域：
本发明属于沙门氏菌属检测技术领域，尤其涉及具毒性质粒沙门氏菌荧光PCR检测探针、试剂盒及检测方法。
背景技术：
现有市场上销售的沙门氏菌属荧光定量PCR检测试剂盒和沙门氏菌属荧光PCR试剂盒，这些试剂盒是运用荧光PCR技术检测出沙门氏菌属的全部种类。但现有技术的PCR检测沙门氏菌属均为普通PCR方法，其检测灵敏度较低，检测速度较慢，PCR扩增时间太长，电泳成本较高且时间长。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于:提供一种具毒性质粒沙门氏菌荧光PCR检测探针，从而实现将具有毒性质粒的沙门氏菌能从众多的沙门氏菌属的种类中迅速准确检测出来。本发明要解决的又一技术问题在于:提供一种具毒性质粒沙门氏菌荧光PCR检测试剂盒，以利于方便快捷地将致病性沙门氏菌检出。本发明要解决的再一技术问题在于:提供一种具毒性质粒沙门氏菌荧光PCR检测方法，从而将具有毒性质粒的沙门氏菌能从众多的沙门氏菌属的种类中迅速准确检测出
来。 为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案是:具毒性质粒沙门氏菌荧光PCR检测探针，为Taqman荧光探针,具有序列为:
5’ -FAM-AGG GCT GGC GAT GTT ACT C-TAMRA-3’705-723
19bp Tm= 57.4 GC=57.9HO DO FO
所述Taqman荧光探针与特异性引物spVR-P35_P36配套使用进行荧光PCR检测。进一步地，所述特异性引物spvR-P35_P36为:
上游引物:
P35:5’ -GGA AAT CGG ACC TAC GGG-3’249-266
18bp Tm=57.4 GC=61.1% HO DO FO 下游引物:
P36:5’ -AAT CCC AGA GCC CGA CAG-3’755-738
18bp Tm=57.7 GC=61.1% HO DO F0。本发明还提供毒性质粒沙门氏菌荧光PCR检测试剂盒，其包括所述的具毒性质粒沙门氏菌荧光PCR检测探针。进一步地，所述试剂盒还包括沙门氏菌PCR反应液、Taq酶、沙门氏菌阳性对照及沙门氏菌阴性对照；所述沙门氏菌PCR反应液包括所述具毒性质粒沙门氏菌荧光PCR检测探针以及所述引物P35和引物P36。进一步地，所述沙门氏菌阳性对照为鼠伤寒沙门氏菌DNA提取液；所述沙门氏菌阴性对照为大肠埃希氏菌DNA提取液。进一步地，所述试剂盒中的相对规格为:沙门氏菌PCR反应液为500 ML，Taq酶为5U/ML 20 ML，沙门氏菌阳性对照为0.5 mL，沙门氏菌阴性对照为0.5 mL ;所述检测试剂盒
还包括一细菌基因组DNA提取试剂盒。进一步地，所述沙门氏菌PCR反应液组成及配比为:不含MgCl2的10 X PCR缓冲液 2.5iiL，25 mmol/L MgCl2 3 u L, 10 mmol/L dNTPs 0.5 u L, 10 ii mol/L 的引物 P35 和引物P36各0.5iiL，10iimol/L的TaqMan探针0.5 y L ;或者，单次反应25 y L PCR反应液组成及配比为:Mg2+ Plus 的 10 XPCR 缓冲液 3.0ii L，25mM each 的 dNTP Mixture 0.5u L,5 U/U L 的 Taq DNA 聚合酶 0.25 ii L，25 ii mol/L 的 TaqMan 探针 0.5 ii L，50 ii mol/L 的引物 P35为 0.5 ii L，50 ii mol/L 的引物 P36 为 0.5 y L，50 y g/mL 模板 DNA 为 2 y L,超纯水 17.75 u L。本发明还提供具毒性质粒沙门氏菌荧光PCR检测方法，包括以下步骤:
步骤1:模板DNA提取；
步骤2:配制荧光PCR反应体系，并设定空白、沙门氏菌阳性对照、沙门氏菌阴性对照，所述荧光PCR反应体系包括上述具毒性质粒沙门氏菌荧光PCR检测探针；
步骤3:设定PCR反应条件进行荧光PCR检测；
步骤4:结果判断:根据扩增结果，对照空白管、阳性对照管、阴性对照管扩增曲线，确定样品的扩增结果。进一步地，步骤2中所述沙门氏菌阳性对照为鼠伤寒沙门氏菌DNA提取液；所述沙门氏菌阴性对照为大肠埃希氏菌DNA提取液。进一步地，所述步骤2的荧光PCR反应体系25 L单次反应时组成及配比如下: 10 X PCR 缓冲液 Mg2+ Plus 3.0il L: 500mmol/L KCl, 100mmol/L Tris Cl,在 25。。
下，pH9.0, 1.0% Triton X-100
dNTP Mixture 25mM each:0.5 u L5 U/u L Taq DNA 聚合酶:0.25 U L25 u mol/L TaqMan 探针:0.5 U L50 ii mol/L 引物 35: 0.5 u L50 ii mol/L 引物 36: 0.5 u L50 u g/mL 模板 DNA: 2 u L超纯水:17.75iiL
所述PCR反应条件为95°C，5 min ；95°C , 5s, 60 V，40 s, 40个循环，4°C保存。本发明的有益效果:本发明利用特异性引物和探针，运用荧光PCR技术将具有毒性质粒的沙门氏菌能从众多的沙门氏菌属的种类中迅速检测出来，而具有毒性质粒沙门氏菌种类，均为高致病性沙门氏菌，可以引起人类和动物致病，也是食源性疾病的重要病原菌之一。故本发明《具毒素质粒沙门氏菌荧光PCR快速检测试剂盒》不仅用于食品检测，也可应用于医学诊断。 本发明的具毒素质粒沙门氏菌荧光PCR检测探针、试剂盒及检测方法，能快速检测出具有毒性质粒的有致病作用的沙门氏菌，比普通PCR的检测速度更快，不仅大大节省PCR的扩增时间，也节省了电泳的成本和时间，有助于对人和动物常见沙门氏菌病的早期临床诊断和食物、水源、环境中沙门氏菌的跟踪监测，并对于公共卫生、食品卫生、畜牧兽医和口岸检疫中的致病性沙门氏菌的检出具有重要的实际意义。
图1 (纵座标表示的是荧光强度，横座标表示是循环数)是本发明实施例的具毒素质粒沙门氏菌荧光PCR快速检测试剂盒检测图谱，其中从下往上9条曲线分别表示:1:大肠埃希氏菌(阴性对照)、S空白对照、1:鼠伤寒沙门氏菌、I猪霍乱沙门氏菌、￡样品分离株沙门氏菌、S鸡白痢沙门氏菌、T鸡伤寒沙门氏菌、I'羊流产沙门氏菌、I；肠炎沙门氏菌。
具体实施例方式以下具体实施例对本发明作进一步的说明，以下实施例仅用于说明本发明，而不用于限定本发明的范围。具有毒性质粒的沙门氏菌菌株对小鼠的毒力要比其相应的无质粒菌株强至数百甚至数万倍，截至目前已先后在鼠伤寒、猪霍乱、肠炎、羊流产、鸡伤寒、鸡白痢等沙门氏菌中鉴定出不同分子量的毒力质粒，由于不同血清型沙门氏菌的毒力质粒(spv)中存在一个含毒力基因的高度保守的IOkb左右的区域，因此通过对此保守区的检测，可以鉴定出常见的具有毒性质粒的沙门氏菌。本发明基于最常见的具有毒性质粒的沙门氏菌种类，在普通PCR的基础上，设计出一条具有序列特异性的Taqman荧光探针；最终连同常规的DNA提取液，沙门氏菌PCR反应液、Taq酶等组装成一套具毒素质粒沙门氏菌荧光PCR快速检测试剂盒。
从NCBI 的 GenBank 数据库中搜索 S.typhimurium, S.choleraesuis,S.enteritidis, S.gall1-narum各代表菌株公布的spvR基因序列如序列表中SEQ ID N0.1，递交NCBI进行Blast检索，并递交EBI利用ClustalW(l.82)软件进行多重序列比对。通过Blast检索和多重序列比对，发现spvR基因序列具有很强的保守性，结合多重PCR考虑，利用Primer Premier 5软件设ii 对特异性引物spvR_P35_P36,与此同时,设计出一条Taqman突光探针,具体结果如下:
上游引物:
P35:5’ -GGA AAT CGG ACC TAC GGG-3’249-266
18bp Tm=57.4 GC=61.1% HO DO FO 下游引物:
P36:5’ -AAT CCC AGA GCC CGA CAG-3’755-738
18bp Tm=57.7 GC=61.1% HO DO FO Taqman突光探针:
5’ -FAM-AGG GCT GGC GAT GTT ACT C-TAMRA-3’705-723
19bp Tm= 57.4 GC=57.9HO DO FO
运用这条Taqman突光探针，同时与特异性引物spvR_P35_P36配套使用，在RocheIightcycler系列荧光定量PCR仪上进行荧光PCR实验验证，结果同时检测出6种具有毒性质粒的沙门氏菌，特异性和灵敏性好。其最大的优点及积极效果是:能快速检测出具有毒性质粒及有致病作用的沙门氏菌。本发明比普通PCR的检测速度更快，不仅大大节省PCR的扩增时间，也节省了电泳的成本和时间。本发明进一步建立具毒性质粒沙门氏菌荧光PCR快速检测试剂盒，用于对人和动物常见沙门氏菌病的早期临床诊断和食物、水源、环境中沙门氏菌的跟踪监测，并对于公共卫生、食品卫生、畜牧兽医和口岸检疫中的致病性沙门氏菌的检出具有重要的实际意义。该毒性质粒沙门氏菌荧光PCR快速检测试剂盒具体组成及其功用作为一实施例如下表1，但需说明的是，表中所述规格及数量可适当调整和选择，也可选择其它规格及数量:
权利要求
1.具毒性质粒沙门氏菌荧光PCR检测探针,为Taqman荧光探针,具有序列为: 5’ -FAM-AGG GCT GGC GAT GTT ACT C-TAMRA-3’705-723 19bp Tm= 57.4 GC=57.9HO DO FO 所述Taqman荧光探针与特异性引物spVR-P35_P36配套使用进行荧光PCR检测。
2.如权利要求1所述的具毒性质粒沙门氏菌荧光PCR检测探针，其特征在于:所述特异性引物spvR-P35-P36为: 上游引物: P35:5’ -GGA AAT CGG ACC TAC GGG-3’249-266 18bp Tm=57.4 GC=61.1% HO DO FO 下游引物: P36:5’ -AAT CCC AGA GCC CGA CAG-3’755-738 18bp Tm=57.7 GC=61.1% HO DO F0。
3.具毒性质粒沙门氏菌荧光PCR检测试剂盒，其特征在于:包括如权利要求广2中任一项所述的具毒性质粒沙门氏菌荧光PCR检测探针。
4.如权利要求3所述的具毒性质粒沙门氏菌荧光PCR检测试剂盒，其特征在于:所述试剂盒还包括沙门氏菌PCR反应液、Taq酶、沙门氏菌阳性对照及沙门氏菌阴性对照；所述沙门氏菌PCR反应液包括所述具毒性质粒沙门氏菌荧光PCR检测探针以及所述引物P35和引物P36。
5.如权利要求4所述的具毒性质粒沙门氏菌荧光PCR检测试剂盒，其特征在于:所述沙门氏菌阳性对照为鼠伤寒沙门氏菌DNA提取液；所述沙门氏菌阴性对照为大肠埃希氏菌DNA提取液。
6.如权利要求4所述的具毒性质粒沙门氏菌荧光PCR检测试剂盒，其特征在于:所述试剂盒相对规格为:沙门氏菌PCR反应液为500 ML，Taq酶为5U/ML 20 ML，沙门氏菌阳性对照为0.5 mL,沙门氏菌阴性对照为0.5 mL ;所述检测试剂盒还包括一细菌基因组DNA提取试剂盒。
7.如权利要求6所述的具毒性质粒沙门氏菌荧光PCR检测试剂盒，其特征在于:所述沙门氏菌PCR反应液组成及配比为:不含MgCl2的10 X PCR缓冲液2.5 ii L，25 mmol/L MgCl2 3u L, 10 mmol/L dNTPs 0.5 u L, 10 ii mol/L 的引物 P35 和引物 P36 各 0.5 y L，lOumol/L的TaqMan探针0.5 ii L ;或者，单次反应25 ii L PCR反应液组成及配比为:Mg2+Plus 的 10 X PCR 缓冲液 3.0ii L，25mM each 的 dNTP Mixture 0.5u L,5 U/u L 的 Taq DNA聚合酶 0.25ii L，25 u mol/L 的 TaqMan 探针 0.5 y L，50 y mol/L 的引物 P35 为 0.5 y L，50 u mol/L 的引物 P36 为 0.5 y L，50 y g/mL 模板 DNA 为 2 y L,超纯水 17.75 u L。
8.具毒性质粒沙门氏菌荧光PCR检测方法，包括以下步骤: 步骤1:模板DNA提取； 步骤2:配制荧光PCR反应体系，并设定空白、沙门氏菌阳性对照、沙门氏菌阴性对照，所述荧光PCR反应体系包括如权利要求f 2中任一项所述的具毒性质粒沙门氏菌荧光PCR检测探针； 步骤3:设定PCR反应条件进行荧光PCR检测； 步骤4:结果判断:根据扩增结果，对照空白管、阳性对照管、阴性对照管扩增曲线，确定样品的扩增结果。
9.如权利要求8所述的具毒性质粒沙门氏菌荧光PCR检测方法，其特征在于:步骤2中所述沙门氏菌阳性对照为鼠伤寒沙门氏菌DNA提取液；所述沙门氏菌阴性对照为大肠埃希氏菌DNA提取液。
10.如权利要求8所述的具毒性质粒沙门氏菌荧光PCR检测方法，其特征在于:所述步骤2的荧光PCR反应体系25 ii L单次反应时组成及配比如下:·10 XPCR 缓冲液 Mg2+ Plus 3.0ii L: 500mmol/L KCl, 100mmol/L Tris Cl,在 25。。下，pH9.0, 1.0% Triton X-100dNTP Mixture 25mM each:0.5 u L·5 U/u L Taq DNA 聚合酶:0.25 U L·25 u mol/L TaqMan 探针:0.5 U L·50 ii mol/L 引物 35: 0.5 u L·50 ii mol/L 引物 36: 0.5 u L·50 u g/mL 模板 DNA: 2 u L超纯水:17.75iiL 所述PCR反应条件 为95°C，5 min ；95°C , 5s, 60 V，40 s, 40个循环，4°C保存。
全文摘要
本发明涉及一种具毒性质粒沙门氏菌荧光PCR检测探针、试剂盒及检测方法，该荧光PCR检测探针具有序列为5’-FAM-AGGGCTGGCGATGTTACTC-TAMRA-3’，705-723，19bp，Tm=57.4，GC=57.9，H0，D0，F0，Taqman荧光探针与特异性引物spvR-P35-P36配套使用进行荧光PCR检测，从而将具有毒性质粒的沙门氏菌能从众多的沙门氏菌属的种类中迅速准确检测出来。
文档编号C12Q1/68GK103243159SQ20131012455
公开日2013年8月14日 申请日期2013年4月11日 优先权日2013年4月11日
发明者马立农 申请人:深圳职业技术学院